Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Summary

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial “buizen” en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Abstract

Cerebrale bloedvaten en hun respectieve microcirculatie leveren zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen via bloed stroom verordening. Endotheliale cellen lijn het lumen van de bloedvaten en de opdracht wijzigingen in vasculaire diameter desgewenst de metabole vraag van neuronen te voldoen. Primaire endotheel-afhankelijke signaalroutes voor hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal (V,_m) en stikstofmonoxide werken meestal parallel aan bemiddelen vaatverwijding en daardoor de bloedtoevoer. Hoewel integraal te coördineren vasodilatatie over enkele millimeters van vasculaire lengte, onderdelen van endotheel afkomstige hyperpolarisatie (EDH) historisch moeilijk geweest te meten. Deze onderdelen van EDH inhouden intracellulaire Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_ik verhoogt en verdere activering van kleine – en middenniveau huidgeleiding Ca^{2 +}-geactiveerd K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanalen.

Hier presenteren we een vereenvoudigde afbeelding van het isolement van verse endotheel van muis cerebrale bloedvaten; gelijktijdige metingen van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk; en een continue superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten onder fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). Posterieure cerebrale bloedvaten uit de cirkel van Willis worden verwijderd vrij van de posterieure communiceren en de arteria slagaders. Enzymatische spijsvertering van schoongemaakte posterieure cerebrale arteriële segmenten en latere verpulvering vergemakkelijkt verwijdering van adventitia, gerelateerde zenuwen en zachte spiercellen. Resulterende posterieure cerebrale arteriële endothelial “buizen” vervolgens onder een Microscoop zijn beveiligd en onderzocht met behulp van een camera, fotomultiplicator, en één of twee elektrometers terwijl onder continue superfusion. Collectief, kan deze methode gelijktijdig wijzigingen in endotheel [Ca^{2 +}]_ik en V_m in discrete cellulaire locaties, naast de verspreiding van EDH via gap kruispunten tot millimeter afstanden langs de intact meten endotheel. Deze methode wordt verwacht dat het rendement van een high-throughput analyse van de onderliggende mechanismen van bloed stroom verordening in de hersenen van normale en zieke endothelial hersenfunctie.

Introduction

Doorbloeding in de hersenen wordt geregeld door de coördinatie van vasodilatatie onder cerebrale bloedvaten en arteriolen in vasculaire netwerken¹. Endotheliale cellen voering cerebrale weerstand slagaders commando veranderingen in vasculaire diameter als nodig is om de metabole vraag van neuronen^1,2,3te voldoen. In het bijzonder tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie (algemeen bekend als EDH), intracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ik) en elektrische signalering in de coördinaat vasodilatatie endotheliale cellen onder endotheliale cellen en hun omliggende zachte spiercellen via gap kruispunten voor arteriële ontspanning⁴. Fysiologische inleiding van EDH inhoudt achtereenvolgens stimulatie van de G_q-receptoren (GPCRs), een toename van [Ca^{2 +}]_iken activering van endothelial kleine – en intermediair-Ca^{2 +}combinatie-geactiveerd K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanalen aan cerebrale endothelial membraan potentiële (V,_m)^5,6,7hyperpolarize. Dus is de intieme relatie van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m integraal aan de bloed stroom verordening en onontbeerlijk voor cardio- en cerebrovasculaire functie^6,8. In de bredere literatuur, tal van studies hebben melding gemaakt van de associatie van vasculaire endothelial dysfunctie met de ontwikkeling van chronische ziekten (bijvoorbeeld hypertensie, diabetes, hartfalen, coronaire hartziekten, chronisch nierfalen, ziekte van de perifere slagader)^9,10, waarin het belang van het bestuderen van endothelial functie in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Vasculaire endotheel is onlosmakelijk verbonden met de productie van hyperpolarisatie, vasodilatatie en perfusie van het weefsel en dus, onderzoek van de inheemse cellulaire eigenschappen is van cruciaal belang. Als een algemene studie-model, is voorbereiding van de arteriële endothelial buis muismodel gepubliceerd vóór voor skeletspieren^11,12, gut¹³, Long¹⁴, en onlangs de hersenen⁶. Studies van gelijktijdige [Ca^{2 +}]_ik en V_m metingen zijn in het bijzonder gepubliceerd voor skeletspieren arteriële endotheel^15,16 , alsmede lymfatische vaartuig endotheel¹⁷. Naast primaire studies gebruik te maken van de aanpak van het endotheel buis, kan een algehele herziening van de voor- en nadelen⁸ worden geraadpleegd om te bepalen of deze experimentele rol geschikt voor een specifieke studie is. Kortom, een voordeel is dat de fysiologische kerncomponenten van endothelial cel functie worden bewaard (bv., Ca^{2 +} toestroom en intracellulaire release, hyperpolarisatie van V_m tot de Nernst potentieel voor K⁺ via SK_Ca/IK_Ca activering en endotheel intercellulaire koppeling via de kruispunten van de kloof) zonder verstorende factoren zoals gerelateerde zenuw input, gladde spieren spanning-gated kanaal functie en contractility, omloop van het bloed en hormonale invloeden⁸. Daarentegen gebruikte cel cultuur benaderingen introduceren aanzienlijke veranderingen in de morfologie¹⁸ en ion kanaal expressie¹⁹ op een wijze die sterk vergelijkingen op fysiologische opmerkingen bepaald ex vivo kan verduisteren of in vivo. Beperkingen omvatten een gebrek aan integratie met andere essentiële onderdelen voor de regulering van de doorbloeding, zoals de gladde spieren en beperkte flexibiliteit in een experimentele planning, als dit model optimaal binnen de 4 uur van intact vasculaire segment isolatie getest is van het dier.

Gebouw uit een vorige video protocol geschreven door Socha en Segal¹² en recente experimentele ontwikkelingen in de tussentijdse^6,15,16, wij hierbij laten zien dat de isolatie van verse endotheel van posterieure cerebrale bloedvaten en gelijktijdige metingen van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk. Dit experiment houdt bovendien continu superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten tijdens de fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). We kozen de posterieure cerebrale slagader, zoals het levert geïsoleerde endotheel met de structurele integriteit (cellen gekoppeld via gap kruispunten) en voldoende afmetingen (breedte ≥50 µm, lengte ≥300 µm) vatbaar voor intra- en intercellulaire signalering langs en onder endotheliale cellen. Bovendien, studies van de knaagdier posterieure cerebrale slagader zijn sterk vertegenwoordigd in de literatuur en omvatten onderzoek van fundamentele endothelial signalering mechanismen, vasculaire ontwikkeling/veroudering en pathologie^{20, 21 , 22}. deze experimentele toepassing wordt verwacht rendement van een analyse van de high-throughput of cerebrale endothelial functie (dysfunctie) en zal daardoor zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in het begrip van bloed stroom verordening gedurende veroudering en de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekte.

Protocol

Voordat de volgende experimenten uitvoeren, ervoor zorgen dat alle dierenverzorgers gebruiken en protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruiken Comité (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council de ” “gids voor de zorg en het gebruik van Proefdieren ” (8th Edition, 2011) en de richtsnoeren voor het aankomen. De IACUC van de Loma Linda University heeft ingestemd met alle protocollen die worden gebruikt voor dit manuscript voor manneli…

Representative Results

De schematische demonstratie van het protocol die hierboven beschreven wordt in de bijgevoegde cijfers weergegeven. Een hersenen van een jonge volwassen mannelijke C57BL/6N muis (5 maanden) geïsoleerd wordt weergegeven in figuur 1A. Posterieure cerebrale bloedvaten zijn zorgvuldig gescheiden van de cirkel van Willis, verwijderd zonder bindweefsel, en snijd in segmenten (figuur 1B-D). Van gedeeltelijk verteerd ar…

Discussion

In het licht van recente ontwikkelingen^6,15,16,17tonen we nu de methode om te isoleren muis cerebrale arteriële endotheel in voorbereiding voor gelijktijdige meting van [Ca^{2 +}] _Ik en V_m onderliggende EDH consequent over ~ 2 h bij 37 ° C. Hoewel het technisch moeilijk, kunnen we meten aan-cel koppeling ook (zie referentie⁶, figuur 1). Op…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55