Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Abstract

Cerebrale bloedvaten en hun respectieve microcirculatie leveren zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen via bloed stroom verordening. Endotheliale cellen lijn het lumen van de bloedvaten en de opdracht wijzigingen in vasculaire diameter desgewenst de metabole vraag van neuronen te voldoen. Primaire endotheel-afhankelijke signaalroutes voor hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal (V,m) en stikstofmonoxide werken meestal parallel aan bemiddelen vaatverwijding en daardoor de bloedtoevoer. Hoewel integraal te coördineren vasodilatatie over enkele millimeters van vasculaire lengte, onderdelen van endotheel afkomstige hyperpolarisatie (EDH) historisch moeilijk geweest te meten. Deze onderdelen van EDH inhouden intracellulaire Ca2 + [Ca2 +]ik verhoogt en verdere activering van kleine - en middenniveau huidgeleiding Ca2 +-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen.

Hier presenteren we een vereenvoudigde afbeelding van het isolement van verse endotheel van muis cerebrale bloedvaten; gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk; en een continue superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten onder fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). Posterieure cerebrale bloedvaten uit de cirkel van Willis worden verwijderd vrij van de posterieure communiceren en de arteria slagaders. Enzymatische spijsvertering van schoongemaakte posterieure cerebrale arteriële segmenten en latere verpulvering vergemakkelijkt verwijdering van adventitia, gerelateerde zenuwen en zachte spiercellen. Resulterende posterieure cerebrale arteriële endothelial "buizen" vervolgens onder een Microscoop zijn beveiligd en onderzocht met behulp van een camera, fotomultiplicator, en één of twee elektrometers terwijl onder continue superfusion. Collectief, kan deze methode gelijktijdig wijzigingen in endotheel [Ca2 +]ik en Vm in discrete cellulaire locaties, naast de verspreiding van EDH via gap kruispunten tot millimeter afstanden langs de intact meten endotheel. Deze methode wordt verwacht dat het rendement van een high-throughput analyse van de onderliggende mechanismen van bloed stroom verordening in de hersenen van normale en zieke endothelial hersenfunctie.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Doorbloeding in de hersenen wordt geregeld door de coördinatie van vasodilatatie onder cerebrale bloedvaten en arteriolen in vasculaire netwerken1. Endotheliale cellen voering cerebrale weerstand slagaders commando veranderingen in vasculaire diameter als nodig is om de metabole vraag van neuronen1,2,3te voldoen. In het bijzonder tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie (algemeen bekend als EDH), intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]ik) en elektrische signalering in de coördinaat vasodilatatie endotheliale cellen onder endotheliale cellen en hun omliggende zachte spiercellen via gap kruispunten voor arteriële ontspanning4. Fysiologische inleiding van EDH inhoudt achtereenvolgens stimulatie van de Gq-receptoren (GPCRs), een toename van [Ca2 +]iken activering van endothelial kleine - en intermediair-Ca2 +combinatie-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen aan cerebrale endothelial membraan potentiële (V,m)5,6,7hyperpolarize. Dus is de intieme relatie van endothelial [Ca2 +]ik en Vm integraal aan de bloed stroom verordening en onontbeerlijk voor cardio- en cerebrovasculaire functie6,8. In de bredere literatuur, tal van studies hebben melding gemaakt van de associatie van vasculaire endothelial dysfunctie met de ontwikkeling van chronische ziekten (bijvoorbeeld hypertensie, diabetes, hartfalen, coronaire hartziekten, chronisch nierfalen, ziekte van de perifere slagader)9,10, waarin het belang van het bestuderen van endothelial functie in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Vasculaire endotheel is onlosmakelijk verbonden met de productie van hyperpolarisatie, vasodilatatie en perfusie van het weefsel en dus, onderzoek van de inheemse cellulaire eigenschappen is van cruciaal belang. Als een algemene studie-model, is voorbereiding van de arteriële endothelial buis muismodel gepubliceerd vóór voor skeletspieren11,12, gut13, Long14, en onlangs de hersenen6. Studies van gelijktijdige [Ca2 +]ik en Vm metingen zijn in het bijzonder gepubliceerd voor skeletspieren arteriële endotheel15,16 , alsmede lymfatische vaartuig endotheel17. Naast primaire studies gebruik te maken van de aanpak van het endotheel buis, kan een algehele herziening van de voor- en nadelen8 worden geraadpleegd om te bepalen of deze experimentele rol geschikt voor een specifieke studie is. Kortom, een voordeel is dat de fysiologische kerncomponenten van endothelial cel functie worden bewaard (bv., Ca2 + toestroom en intracellulaire release, hyperpolarisatie van Vm tot de Nernst potentieel voor K+ via SKCa/IKCa activering en endotheel intercellulaire koppeling via de kruispunten van de kloof) zonder verstorende factoren zoals gerelateerde zenuw input, gladde spieren spanning-gated kanaal functie en contractility, omloop van het bloed en hormonale invloeden8. Daarentegen gebruikte cel cultuur benaderingen introduceren aanzienlijke veranderingen in de morfologie18 en ion kanaal expressie19 op een wijze die sterk vergelijkingen op fysiologische opmerkingen bepaald ex vivo kan verduisteren of in vivo. Beperkingen omvatten een gebrek aan integratie met andere essentiële onderdelen voor de regulering van de doorbloeding, zoals de gladde spieren en beperkte flexibiliteit in een experimentele planning, als dit model optimaal binnen de 4 uur van intact vasculaire segment isolatie getest is van het dier.

Gebouw uit een vorige video protocol geschreven door Socha en Segal12 en recente experimentele ontwikkelingen in de tussentijdse6,15,16, wij hierbij laten zien dat de isolatie van verse endotheel van posterieure cerebrale bloedvaten en gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk. Dit experiment houdt bovendien continu superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten tijdens de fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). We kozen de posterieure cerebrale slagader, zoals het levert geïsoleerde endotheel met de structurele integriteit (cellen gekoppeld via gap kruispunten) en voldoende afmetingen (breedte ≥50 µm, lengte ≥300 µm) vatbaar voor intra- en intercellulaire signalering langs en onder endotheliale cellen. Bovendien, studies van de knaagdier posterieure cerebrale slagader zijn sterk vertegenwoordigd in de literatuur en omvatten onderzoek van fundamentele endothelial signalering mechanismen, vasculaire ontwikkeling/veroudering en pathologie20, 21 , 22. deze experimentele toepassing wordt verwacht rendement van een analyse van de high-throughput of cerebrale endothelial functie (dysfunctie) en zal daardoor zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in het begrip van bloed stroom verordening gedurende veroudering en de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voordat de volgende experimenten uitvoeren, ervoor zorgen dat alle dierenverzorgers gebruiken en protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruiken Comité (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council de " "gids voor de zorg en het gebruik van Proefdieren '' (8th Edition, 2011) en de richtsnoeren voor het aankomen. De IACUC van de Loma Linda University heeft ingestemd met alle protocollen die worden gebruikt voor dit manuscript voor mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen (leeftijd bereik: 3 tot 30 ma).

1. apparatuur en materiaal

Opmerking: Details van materialen die nodig zijn voor het protocol kunnen worden gevonden in de Tabel van de materialen, reagentia, en handleidingen of websites die zijn gekoppeld aan de respectieve leveranciers.

  1. Flow kamer
    1. Zet een superfusion kamer met een dekglaasje aan glazen bodem vast in een geanodiseerde aluminium platform. Beveilig het platform met kamer in een compacte aluminium stadium.
    2. Stel een micromanipulator aan elk uiteinde van het platform op het podium van de aluminium voor het houden van de pinning pipet.
      Opmerking: Als een praktische optie, gebruik dit apparaat overdraagbaar fase met een stroom kamer eenheid beveiligd ter vergemakkelijking van de overgang van isolatie van het endotheel buis naar de prestaties van de experimenten.
  2. Microscopen
    1. Gebruik stereomicroscopes (5 x 50 x vergroting bereik) uitgerust met fiber optic lichtbronnen voor macro - en micro-dissectie procedures.
    2. Voor voorbereiding van endothelial buizen, gebruikt u een omgekeerde Microscoop uitgerust met fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) compatibele doelstellingen (10 x, 20 x en 40 x) en een aluminium stadium.
    3. Plaats een microsyringe pomp controller om te isoleren endothelial buizen uit gedeeltelijk verteerd bloedvaten, grenzend aan het endotheel buis voorbereiding apparaat.
    4. Gebruik voor het experimentele apparaat, een omgekeerde Microscoop uitgerust met standaard doelstellingen (4 x en 10 x) naast fluorescerende doelstellingen (20 x en 40 x, numerieke diafragma 0,75) en een handmatige aluminium podium op een vibratie isolatie tafel.
  3. Intracellulaire controleapparaat
    1. De Vm van endotheliale cellen opnemen in geïsoleerde endothelial buizen verbinden met de elektrometer de compatibele headstage. Indien nodig, een functiegenerator of stimulator verbinding te maken met de elektrometer voor experimenten die huidige injectie nodig.
    2. Sluit de uitgangen van de versterker aan een data-acquisitiesysteem, hoorbare basislijn beeldschermen en een oscilloscoop. Beveilig de referentie-elektrode (Ag/AgCl pellet) in de buurt van de afrit van de kamer stroom tijdens experimenten.
    3. Gebruik een fotometrische systeem met geïntegreerde componenten een fluorescentie systeem interface, of hoge intensiteit booglamp en macht levering, hyperswitch, fotomultiplicator (PMT), en de camera om te meten [Ca2 +]ik in endotheliale cellen.
    4. Gebruik je een temperatuur controller voorzien van een inline-kachel te verhogen en houden een fysiologische temperatuur (37 ° C) gedurende het gehele experiment.
    5. Gebruik een zes-reservoir platform aangesloten op de controller van een ventiel met een inline flow control ventiel om de levering van de respectieve oplossingen aan de endothelial buis beveiligd in de zaal.
  4. Micropipetten en scherpe elektroden
    Opmerking: Voor de vervaardiging van pipetten voor verpulvering en de mechanische stabilisatie van geïsoleerde endothelial buizen, gebruik van een elektronische trekker voor het trekken van de pipetten en een micro-forge voor breken en vuur polijsten.
    1. Als u wilt scheiden adventitia, gladde spieren en het endotheel buis uit het gedeeltelijk verteerd arteriële segment, verpulvering pipetten (elk met een uiteinde van de interne diameter van 80-120 µm) in voorkomend geval, met behulp van borosilicaatglas capillaire buisjes, voor te bereiden en vuur Pools de tip.
    2. Om de endothelial buis tegen de bodem van de superfusion kamer, vastmaken pipetten te gebruiken met een afgestompte, sferische einde (warmte-gepolijst, OD van 100 – 150 µm; bereid uit dun-muur borosilicaatglas buizen).
    3. Registreren Vm van een endothelial cel, bereiden scherpe elektroden met een weerstand van de tip van ~ 150 ± 30 MΩ van glazen capillaire buizen met behulp van een elektronische trekker.

2. bereiding van de oplossingen en Drugs

  1. Fysiologische zoutoplossing (PSS)
    1. Voor een experiment met drug voorbereidingen, bereiden een minimum van 1 L van het gebruik van de PSS: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic zuur (HEPES) en 10 mM glucose.
    2. De vereiste oplossingen om voor te bereiden dissectie, bereiden isolatie van cerebrale slagader, en voorbereiding van de buis van het endotheel, PSS CaCl2 (nul Ca2 + PSS) ontbreekt.
    3. Bereiden alle oplossingen in ultrazuiver gedeïoniseerd H2O en breng de pH op 7.4, hen te steriliseren door een filter (0,22 µm poriegrootte) ervoor zorgen dat de osmolaliteit van de oplossingen tussen 290 en 300 mOsm is.
      Opmerking: Oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ongeveer twee weken.
  2. 10% bovien serumalbumine (BSA)
    1. Los 1 g van het gelyofiliseerd poeder in een bekerglas van 10 mL nul Ca2 + PSS als voorbereiding hierop 10% BSA.
    2. Dek het bekerglas af met paraffine film en laat een periode van enkele uren te geven, met langzaam roeren voor de BSA te ontbinden.
    3. Filtreer de definitieve oplossing met een 10 mL spuit plus een 0,22 µm filter en maak van 1 mL aliquots worden opgeslagen bij-20 ° C.
  3. Dissectie oplossing
    1. Ter voorbereiding van dissectie 50 mL, voeg toe 500 µL van BSA (10%) aan 49,5 mL nul Ca2 + PSS.
    2. Breng deze dissectie-oplossing in een petrischaal voor arteriële dissectie onmiddellijk na bereiding.
  4. Dissociatie oplossing
    1. Ter voorbereiding van dissociatie 50 mL, voeg 5 µL CaCl2 (1 M) en 500 µL van BSA (10%) aan 49,5 mL nul Ca2 + PSS. Laat de oplossing om te zitten bij kamertemperatuur (RT).
  5. Enzymen
    1. Voor een gedeeltelijke vertering van de arteriële segmenten, bereiden 1 mL van spijsvertering oplossing met papaïne 0.31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase (Type H mix) en elastase 0.13 mg/mL.
      Opmerking: Enzym activiteiten kunnen variëren; echter, voor onze succesvolle protocollen, commercieel meegeleverde enzym activiteiten hebben gebruikt als volgt: papaïne ≥10 eenheden/mg; Collagenase ≥1 eenheden/mg, voor N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala of FALGPA substraat omzet; en elastase ≥ 5 eenheden/mg.
  6. Voorbereiding van Fura-2 en farmacologische agenten
    1. Bereiden van voorraad concentratie (1 mM) voor Fura-2 AM kleurstof in DMSO. Bereiden een werkende concentratie (10 µM) door toevoeging van 5 µL van voorraad aan 495 µL van PSS voor laden.
    2. Bereiden ≥50 mL concentraties van farmacologische agenten (bijvoorbeeld ATP) werken in PSS zo nodig.
  7. Uitvoeren van de oplossing
    1. Bereiden een dirigent oplossing, 2 M KCl, door het oplossen van KCl in gedeïoniseerd H2O (7.455 g KCl in 50 mL H2O).
    2. Filtreer de oplossing door een 0,22 µm spuit filter voorafgaand aan backfilling de scherpe elektroden.
  8. Propidium jodide (0,1%)
    1. Los 10 mg gelyofiliseerd propidium jodide in 10 mL 2 M KCl.
    2. Meng goed en op te slaan op RT.

3. dissectie en isolatie van cerebrale slagader

Opmerking: Alle dissectie procedures vereisen specimen vergroting (50 x) via stereomicroscopes en verlichtingssterkte van fiber optic lichtbronnen. Dissectie u procedures alleen uitvoeren voor isolatie van de hersenen en bloedvaten, scherp dissectie instrumenten te gebruiken. Microdissection tools te isoleren en schoon slagaders omvatten scherp boete-tipped pincet en Vannas stijl dissectie schaar (3 tot en met 9.5 mm bladen).

  1. Isolatie van muis hersenen
    1. Anesthetize een C57BL/6 muis (3-30 maanden oud; mannelijk of vrouwelijk) via inhalatie van Isofluraan (3% voor 2-3 min), dan het dier onmiddellijk na volledige inductie van de anesthesie te onthoofden. Plaatsen van het hoofd in een petrischaal (diameter 10 cm, diepte 1,5 cm) die koud (4 ° C) bevat nul Ca2 + PSS onder een stereomicroscoop.
    2. Bekeken door de Microscoop, verwijder de huid en de haren over de schedel en buitensporige bloed met koude nul Ca2 + PSS. Maak een incisie met behulp van alleen de toppen van standaard dissectie schaar (bijvoorbeeld 24 mm mes), beginnend met het occipitale bot en uitbreiding omhoog door het nasale bot van de schedel.
    3. Open de schedel zorgvuldig langs de incisie met behulp van grof-tipped pincet en aparte bindweefsel te isoleren van de hersenen met een intact cirkel van Willis.
      Opmerking: Als alternatief, Littauer bot-snijden pincet kan worden gebruikt om te openen de schedel en het blootstellen van de hersenen.
    4. Voorzichtig wassen de geïsoleerde hersenen met koude nul Ca2 + PSS in een bekerglas van bloed verwijderen. Plaats de hersenen ventrale zijde naar boven in een cupje met koude dissectie oplossing voor isolatie van de cerebrale bloedvaten (figuur 1A).
  2. Isolatie van de cerebrale bloedvaten
    Opmerking: De achterste cerebrale slagader is geselecteerd als een representatieve cerebrovasculaire endothelial studie model voor dit protocol.
    1. Beveiligen van de geïsoleerde hersenen in koude dissectie oplossing met behulp van roestvrij stalen pinnen (diameter 0.2 mm, lengte ~ 11-12 mm) in een houtskool-geïnfundeerd silicon polymeer coating onder (diepte ≥50 cm) in een glazen petrischaaltje moet worden ingevoegd.
    2. Gebruiken om te handhaven een gekoeld temperatuur van PSS tijdens dissectie, een kamer van de dissectie gekoeld door een koelmiddel systeem continu fietsen een 1:1 water-ethyleen glycol mengsel. Als alternatief, dissectie kan worden uitgevoerd op vers ijs.
    3. Operatief isoleren de posterieure cerebrale slagaders (~0.3 0.5 cm segmenten, geen axiale spanning) de posterieure communiceren en de arteria slagaders met behulp van microdissection instrumenten Vannas stijl schaar en scherp boete-tipped pincet (figuur 1B ). Gebruik van roestvrij stalen pinnen (diameter 0.1 mm, lengte ~ 13-14 mm) om veilige zowel geïsoleerd posterieure cerebrale bloedvaten in de oplossing van de dissectie in de petrischaal (Figuur 1 c).
    4. De geïsoleerde posterieure cerebrale bloedvaten zorgvuldig schoon door het verwijderen van bindweefsel met behulp van aangescherpte boete-tipped pincet (Figuur 1 d). Snijd intact slagaders in segmenten (lengte 1 – 2 mm) voor enzymatische spijsvertering (Figuur 1 d; inzet).

4. voorbereiding van Endothelial buis en Superfusion

Opmerking: De endothelial buis is bereid zoals eerder beschreven12, met wijzigingen voor de cerebrale slagader6.

  1. Het apparaat van de verpulvering met behulp van een microscoop voorzien van doelstellingen (10 x, 20 x en 40 x), een camera en een aluminium stadium holding een kamer en micromanipulators voor te bereiden. Veilig een microsyringe met een pomp controller grenst aan het podium en het model (figuur 2A).
  2. Volledig aanvulling funderingsput een verpulvering Pipetteer met minerale olie en veilig over de micro-spuit-zuiger. Vervolgens met behulp van de micro-spuit met pomp controller, trekken dissociatie oplossing in de Pipet (~ 130 nl) op de top van de minerale olie waarbij de afwezigheid van luchtbellen in de pipet.
  3. Plaats intact arteriële segmenten in 1 mL van dissociatie oplossing in een 10 mL glazen buis (figuur 2B), met papaïne 0.31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase en elastase 0.13 mg/mL. Incubeer bij 34 ° C gedurende 10-12 minuten voor een gedeeltelijke vertering.
  4. Na de vertering, door het enzym oplossing te vervangen door ~ 5 mL verse dissociatie oplossing. Met behulp van een pipet 1 mL, breng één segment in een cupje met de dissociatie oplossing op RT.
  5. Plaats de pipet in de dissociatie-oplossing in de zaal en plaats het dicht bij het ene uiteinde van het verteerd schip. Stelt een tarief binnen het bereik van 2 tot en met 5 nL/s op de pomp controller voor zachte verpulvering (figuur 2C; inzet).
  6. Tijdens het bekijken door middel van 100 x 200 x vergroting, trekken en uitwerpen van de arteriële segment om zich te distantiëren van de zachte spiercellen terwijl de productie van een endothelial buis. Gebruik zo nodig zorgvuldig boete-tipped pincet te scheiden van gedissocieerde adventitia en interne elastische lamina van het endotheel buis. Bevestigen dat alle zachte spiercellen zijn losgekoppeld en dat alleen endotheliale cellen als een intact "tube" (figuur 2C blijven).
  7. Met behulp van micromanipulators, veilige elk uiteinde van het endotheel buis op de glazen cover slip van de superfusion kamer met behulp van borosilicaatglas pinning pipetten (figuur 2D).
  8. Wash-out los adventitia en zachte spiercellen van de kamer en vervang de dissociatie oplossing met 2 mM CaCl2 PSS. Overdracht van het mobiele platform met beveiligde endothelial buis naar de Microscoop voor superfusion en experimentele rig.
  9. Gebruik 6 schone 50 mL reservoirs (figuur 3A) voor continue levering van PSS en respectieve drug oplossingen tijdens het experiment, zo nodig. Gebruik de inline flow control ventiel handmatig in te stellen het debiet in de gehele als consistent met laminaire flow terwijl het overeenkomende stroom voeden tot vacuüm zuiger. PSS aan de zaal (figuur 3B) leveren voor de superfusion van het endotheel buis voor ≥ 5 min voordat de opname van de achtergrondgegevens en kleurstof laden.

5. kleurstof Load, Wash-Out en temperatuurinstellingen

  1. Alle onderdelen van de fotometrie systeem voor het meten van [Ca2 +]ikinschakelen. Kunt de Microscoop op de experimentele tuig (Figuur 3 c) bekijken de endothelial buis 400 x vergroting, en focus op de cellen in de fotometrische venster via fotometrie systeem softwaresuite.
  2. Meten van de diameter van het endotheel buis en achtergrond autofluorescence waarden opnemen in overeenstemming is met 510 nm emissie tijdens alternatieve excitatie op 340 en 380 nm (≥10 Hz).
  3. Om te meten [Ca2 +]ik reacties, laden de endothelial buis met Fura-2 ben kleurstof (eindconcentratie is 10 µM) op RT en toestaan ~ 30-40 min in de afwezigheid van licht.
  4. Opnieuw opstarten van de superfusion van het endotheel buis met verse PSS voor ~ 30-40 min te wash-out overtollige kleurstof en laat intracellulaire Fura-2 AM to-esterify. Tijdens de wash-out periode, verhogen de temperatuur geleidelijk van RT tot 37 ° C, de temperatuur controller (figuur 3A) met een inline-kachel, dan handhaven bij 37 ° C gedurende het gehele experiment.
    Opmerking: De aanbevolen incrementele overgang tussen RT tot 37 ° C houdt in drie stappen (bijvoorbeeld 5 ° C) met een ≥5 min equilibratietijd bij elke stap.

6. Gelijktijdige meting van [Ca2 +]Ik en Vm

  1. Zet alle andere apparatuur en de elektrometer softwaresuite voor het meten van Vm (Zie Figuur 3, Figuur 4). Gegevenssnelheid verwerving dienovereenkomstig aan te passen (≥10 Hz).
  2. Trek een scherpe elektrode en aanvulling van de funderingsput met 2 M KCl. Koppeling via dye overdracht, aanvulling funderingsput-de microelectrodes met 0,1% propidium jodide opgelost in 2 M KCl voor studies van intercellulaire.
  3. Beveilig de elektrode via een zilver draad bekleed met chloride in de houder van de pipet gekoppeld aan een elektrometer hoofd stadium beveiligd met een micromanipulator. Gebruik de micromanipulator om te kort plaatsen de tip van de elektrode in de stromende PSS in de kamer terwijl viewing via de doelstelling 4 x.
  4. Stel de rust Vm op 0 als consistent met geaarde Bad potentiële. Plaats het uiteinde van de elektrode iets meer dan een cel van het endotheel buis. Indien gewenst, gebruik hoorbaar basislijn monitoren gekoppeld aan elektrometers toonhoogte geluid koppelen aan potentiële opnames.
  5. Vergrotingsniveau te 400 x het streven naar 40 x uit en plaats het uiteinde van de elektrode zo nodig. De fotometrische venster met behulp van de fotometrie software focus op ~ 50 tot 80 endotheliale cellen aanpassen.
  6. Zachtjes de elektrode in een van de cellen van het endotheel buis met behulp van de micromanipulator plaatsen en wacht ≥2 min voor de rust van de Vm te stabiliseren. Ook het invoegen van een tweede elektrode in een andere cel (afstand ≥100 µm) van de eerste cel gespietst met eerste elektrode.
  7. Zodra rusten Vm stabiel bij de verwachte waarden is (-30 tot -40 mV)6, draaien op de bet op de interface van de fluorescentie bij gebrek aan licht en verwerving van intracellulaire [Ca2 +]ik door spannende Fura-2 afwisselend beginnen (10 Hz) op 340 en 380 nm terwijl het verzamelen van fluorescentie emissie bij 510 nm.
    Opmerking: Voor het testen van de intercellulaire elektrische koppeling, huidige (± 0,5-3 nb, ~ 20 s impulstijd) kan worden geleverd via een elektrometer als "Site 1", en wijzigingen van Vm kunnen worden vastgelegd met een ander elektrometer als "Site 2" (afstand ≥100 µm).
  8. Zodra de gelijktijdige metingen van Vm en [Ca2 +] enik zijn gevestigd, toestaan dat ~ 5 min. voor superfusion van endothelial buis met PSS aan een constante laminaire stroomtarief vóór het aanbrengen van drugs.
  9. Toepassing van de drug (bijvoorbeeld ATP) willen de superfusion kamer met het constant debiet in de PSS. Na ~ 3 min (of een periode van tijd geschikt is voor de kinetiek van de drug) terugkeren wassen met PSS tot Vm en de F340/f-ratio met380 naar hun uitgangssituatie. Mark respectieve opnamen als stoffelijk gesynchroniseerde over de fotometer en elektrometer software suites tijdens elke overgang van oplossingen.
  10. Zodra het experiment wordt gedaan, trekken van de elektrode van de cel met behulp van de micromanipulator en merken Vm ~ 0 mV waarnaar wordt verwezen door de bad-elektrode. Respectieve opnames van Vm en [Ca2 +]ik stoppen en opslaan van de records op bestand voor data-analyse.

7. visualisatie van cel naar cel koppeling

  1. Om te visualiseren van cel naar cel koppeling via propidium jodide, gebruiken een 40 x of 60 x TL doelstelling met een relatief hoge numerieke diafragma (bijvoorbeeld 0,95) en rhodamine filter ingesteld met solid-state verlichting, een high-resolution camera (bijvoorbeeld 16- Megapixels), en een imaging softwaresuite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De schematische demonstratie van het protocol die hierboven beschreven wordt in de bijgevoegde cijfers weergegeven. Een hersenen van een jonge volwassen mannelijke C57BL/6N muis (5 maanden) geïsoleerd wordt weergegeven in figuur 1A. Posterieure cerebrale bloedvaten zijn zorgvuldig gescheiden van de cirkel van Willis, verwijderd zonder bindweefsel, en snijd in segmenten (figuur 1B-D). Van gedeeltelijk verteerd arteriële segmenten, wordt de intact endothelial buis geproduceerd en beveiligd en opgeslagen op de glazen cover slip met behulp van pinning pipetten. Zachte mechanische stretch is toegepast met behulp van twee vastmaken pipetten lineaire in vivo lengte zonder schip tortuosity onderling aan te passen. Dit is verder verduidelijkt in het manuscript (figuur 2A-D). Endotheel buizen geïsoleerd van posterieure cerebrale bloedvaten zijn ~ 90-100 µm in breedte en ≥300 µm in lengte. De buis zit boordevol Fura-2 ben gevolgd door wash-out met PSS. Gelijktijdige meting van [Ca2 +]ik en Vm in de endotheliale buis wordt uitgevoerd door Ca2 + fotometrie evenals scherpe elektrode elektrofysiologie (experimentele tuig weergegeven in Figuur 3 en Figuur 4).

Functionele beoordeling van het endotheel buis wordt uitgevoerd door een klassieke endothelial GPCR agonist zoals ATP in de bedwelmingsruimte stroom onder fysiologische omstandigheden toe te passen. Zoals afgebeeld in Figuur 5, [Ca2 +]ik en Vm gelijktijdig worden opgenomen in reactie op de ATP (100 µM). Een belangrijke hyperpolarisatie van Vm (≥5 mV) optreedt gelijktijdig met een intracellulair [Ca2 +]ik verhoging, die aangeeft dat een stijging van [Ca2 +]ik SKCa/IK activeertCa kanalen en daarmee maakt efflux van K+ in het plasma-membraan te produceren EDH. Bewijs van intercellulaire koppeling met behulp van de huidige injectie (± 0,5 tot en met 3 nb, ~ 20 s pulsen) kan worden gevonden in onze onlangs gepubliceerde werk (referentie6, figuur 1). Merk op dat propidium jodide heeft een massa van ~ 668 Da verwijzing naar tweede boodschappers bekend voor het passeren van de kloof kruispunten zoals inositol trisphosphate (IP-3~ 420 Da), cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP, ~ 329 Da).

Figure 1
Figuur 1 : Isolatie van cerebrale slagader van hersenen. (A) hersenen geïsoleerd met intact slagaders (witte pijl geeft de posterieure cerebrale slagader) in dessection-oplossing. (B) Magnified bekijken van posterieure cerebrale slagader (witte pijl; ~ 3 x vs. Deelvenster A). (C) geïsoleerde posterieure cerebrale bloedvaten beveiligd met roestvrij stalen pinnen in specimen schotel. (D) Posterior cerebrale bloedvaten na verwijdering van bindweefsel. Inzet toont gesneden segmenten van slagaders; Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Voorbereiding van cerebrale endothelial buis. (A)-apparatuur die wordt gebruikt voor het triturating van de gedeeltelijk verteerd arteriële segmenten; een = micromanipulator, b = kamer voor het voorbereiden van de buis, c = aluminium podium, d = microsyringe, e = Microscoop, f = microsyringe pomp Kontroler. (B) arteriële segmenten (witte pijlen) in oplossing voor enzymatische spijsvertering. (C) Endothelial buizen bereid door verpulvering; een verpulvering = Pipet, b = intact endothelial buis. Inzet toont de verpulvering proces voor het verwijderen van adventitia en zachte spiercellen; Schaal bar = 100 µm. (D) een intact endothelial buis beveiligd en opgeslagen op de glazen cover slip met vastmaken pipet; een = pinning Pipet, b = intact endothelial buis met een diameter van ~ 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Apparatuur voor superfusion en gelijktijdige [Ca2 +] Ik en V m metingen. (A) apparatuur voor superfusion van het endotheel buis en temperatuurregeling, een = hoge intensiteit booglamp voeding, b = fluorescentie systeeminterface, c = temperatuurregelaar, d = zes-reservoirs van superfusion systeem, e = fiber optic licht bronnen, f = Kontroler ventiel, g = hyperswitch [Ca2 +]ik fotometrie systeem. (B) Superfusion kamer toestellen; een en b = headstages, c grond elektrode, d = = inline kachel, e = superfusion buis, f = vacuüm zuignap, g = superfusion kamer, h = aluminium fase houden van de kamer. (C) experimenteel platform op een vibratie isolatie tafel; een = cel framing adapter met camera, b = Microscoop licht, c = Microscoop, d = aluminium podium, e = micromanipulator voor een headstage controle, f = vibratie isolatie tabel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Apparatuur voor het bedienen van de elektrofysiologie en gegevens opnemen. een oscilloscoop, = b = functiegenerator, c = hoorbaar basislijn monitor, d = 50/60 Hz Ruisfilter, e en f = elektrometers, g = data-acquisitiesysteem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Gelijktijdige [Ca2 +] Ik en V m opnames. (A) differentiële Interference-Contrast foto (400 x) van een muis cerebrale arteriële endothelial buis aangepast voor experiment in fotometrische venster met behulp van een 40 x doelstelling. Een scherpe elektrode wordt geplaatst in een cel, zoals wordt weergegeven aan de bovenkant van de afbeelding (witte pijl). (B) Raw sporen voor gelijktijdige meting van F340/f380 ratio (boven) en Vm (onder) in reactie op de ATP (100 µM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In het licht van recente ontwikkelingen6,15,16,17tonen we nu de methode om te isoleren muis cerebrale arteriële endotheel in voorbereiding voor gelijktijdige meting van [Ca2 +] Ik en Vm onderliggende EDH consequent over ~ 2 h bij 37 ° C. Hoewel het technisch moeilijk, kunnen we meten aan-cel koppeling ook (zie referentie6, figuur 1). Op deze manier kunnen we meten discrete en transiënte gebeurtenissen gelijktijdig signalering. Voor een overzicht van de algemene uitdagingen terwijl isoleren muis arteriële endotheel verwijzingen11,12te raadplegen. Wij benadrukken kritische stappen voor het isoleren van muis cerebrale aderen, ons bijzondere metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm, suggesties voor het oplossen van problemen en overwegingen voor alternatieve methoden in het licht van experimentele sterke/zwakke punten hieronder.

De achterste cerebrale slagader vereist voorzichtig los van de cirkel van Willis en bindweefsel zonder schade aan de gladde spieren en endotheliale cellen. Chirurgische instrumenten (Tang en schaar) moet geschikt zijn voor muis microcirculatie dissectie procedures terwijl gehandhaafd met schone, scherpe randen. Relatieve tot skeletspieren12, wij gehalveerd de tijdsperiode voor enzymatische incubatie door tweederde en de concentraties van papaïne, collagenase en dithioerythritol tijdens het gebruik van een empirisch geoptimaliseerde concentratie van elastase toevoegen. Voor consistente succes in het isoleren van cerebrale arteriële endothelial buizen, is het belangrijk om orde enzymen in batches (2 tot en met 4 flesjes) van een zeer gerenommeerde leverancier met consistente productiepraktijken in overeenstemming met de frequentie van gebruik en houdbaarheid. Zelfs met het potentieel voor variatie in de enzymactiviteit van een heleboel enzym naar de volgende, wordt voorgesteld dat de concentraties van het enzym worden gehandhaafd terwijl het optimaliseren van de tijd van de spijsvertering binnen 10 à 12 min. Het is vermeldenswaard dat het geslacht noch de leeftijd van het dier (3 tot 30 maanden) een belangrijke belemmering is geweest aan de voorbereiding van geïsoleerde endotheel van de cerebrale bloedvaten in onze ervaring. Dus is het aangeraden dat de samenstelling van het enzym cocktail- en tijd van de enzym spijsvertering ongewijzigd in studies op leeftijd en geslacht.

Zoals benadrukt, is terughoudendheid geboden tijdens zachte verpulvering en isolatie van het endotheel van adventitia en zachte spiercellen spindel-vormig teneinde schade aan endotheliale cellen12. Voor de verpulvering stap dient de viskeuze minerale olie als een hydraulische medium tussen de zuiger van de micro-spuit en de waterige PSS om te trekken of uitwerpen vaartuig segmenten badend in de PSS. Opgemerkt moet worden dat indien het vaartuig segment de minerale olie contactpersonen, deze stap moet worden herhaald met behulp van een pipet schone verpulvering met opeenvolgende backfilling van minerale olie en PSS. Voordat een experiment, is het raadzaam dat een lengte ongeveer lineair in vivo worden hersteld naar de endothelial buis voor zover mogelijk, waarbij afzonderlijke cellen een 'platte', longitudinale morfologie (bijv. diameter ~ 5 µm; lengte ~ 100 µm veronderstellen; dikte ~0.5 µm)8. Axiale spanning moet echter niet worden toegepast voor zover waar cellen aan de randen van het model zijn trekken weg uit onder respectieve vastmaken pipetten en daardoor afbreuk te doen aan mechanische stabiliteit voor betrouwbare cellulaire metingen tijdens de experiment.

De fotometrische [Ca2 +]ik fietsmeet-systeem gebruikt bij deze techniek is geschikt voor continumetingen van het endotheel [Ca2 +]i met behulp van de ratiometric Fura-2 kleurstof. Individuele protocollen kunnen duren meestal ≥10 min zonder significante photobleaching. Verder gebruiken wij gewoonlijk deze aanpak voor het meten [Ca2 +]ik omdat het is vatbaar voor tijdige pauzes in data-acquisitie en frequente verkeer van Microscoop doelstellingen zo nodig teneinde scherpe elektroden voor Vm metingen. Merk op dat dit is een fotometrische benadering die alleen vastlegt global, gemiddeld [Ca2 +]ik onder meerdere cellen. In het algemeen, voor [Ca2 +]ik metingen adviseren wij fotometrie voor de eerste karakterisering van endothelial cel reacties op farmacologische agenten (b.v., tijdsverloop van piek en plateau fasen) tijdens het plannen om te beveiligen Ga naar microdomain signalering gebeurtenissen met behulp van standaard confocal of multiphoton microscopie12,23te kwantificeren.

De scherpe elektrode electrofysiologie aanpak is vatbaar voor geïntegreerde Vm opnamen in fysiologische meercellige preparaten. De meting van intracellulaire Vm is veruit de meest technisch uitdagend met talrijke kritische stappen, die kunnen vergemakkelijken of vernietigen van succes van metingen. Ten eerste, de experimentator moet de optimale programma voorwaarden vast op de trekker van een glas productie consequent scherpe elektroden met een weerstand van de tip van ~ 150 ± 30 MΩ. Met behulp van een gloeidraad warmte oprit test lezen als een referentie, is het raadzaam dat de experimentator bepalen parameters empirisch, met name wat betreft de variatie in de instelling van de "warmte" terwijl het maximaliseren van de tijd voor pull. Volgende, mechanische stabiliteit van de micromanipulators, headstages, Pipetteer houders en specimen is absoluut cruciaal. Afgezien van de duidelijke noodzaak voor een vibratie isolatie tabel, zal de experimentator moet om ervoor te zorgen dat alle armaturen veilig zijn en dat het werkgebied rond en onder de manipulatoren schoon is. In het ideale geval omgevingsgeluid moet worden verminderd voor zover de resolutie van scherpe elektrode opnamen binnen 1 is mV. In onze ervaring is de meest voorkomende bron van geluidshinder zilver draad beveiligd in de pipet-houder die helemaal is behoefte aan een voldoende chloride coating of vervanging. Als gemeenschappelijke 50/60 Hz ruis aanwezig is, "hum zwijgen" technologie kan worden gebruikt en wordt standaard geleverd met een moderne elektrometer. Als ruis volledig onhandelbaar verschijnt, controleert u of er een lek in het bad of de overloop is waar PSS in contact met weerstanden voor temperatuurregeling komen zal. Als complicaties bij het verwerven van een stabiele Vm signaal blijven, controleert u de integriteit van elektrische snoeren en t-stukken.

Over het geheel genomen als tot oprichting van dat een scherpe elektrode opname is mislukt, is het meestal te wijten aan een ongepaste elektrode, mechanische instabiliteit of slechte cellulaire gezondheid. Als alternatief kan de experimentator ook willen overwegen een configuratie van de patch-clamp techniek op individuele, elektrisch afgekoppeld cellen waar informatie over de hele cel stromingen en enkele ion kanaal opnames kan worden verkregen. Hoewel voor de algemene uitdagingen van het gebruik van een fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, heterogene intracellulaire laden, bleken, kalibratie met behulp van ionophoren, bescheiden detectie resolutie), kleurstoffen spanning-gevoelige zoals Di-8-ANEPPS zijn ook commercieel beschikbaar.

Ons begrip van het endotheel in bloed stroom verordening aan en de rest van de hersenen is van cruciaal belang met een snel verouderings menselijke bevolking en de stijgende incidentie van chronische cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten. Dus, wij bieden een methode voor het isoleren van intact endotheel van een vitale cerebrale slagader, die aangepast aan andere vasculaire structuren in de hersenen worden kan. Daarnaast tonen we een nuttige benadering voor de gelijktijdige metingen van onderliggende [Ca2 +]ik en Vm. Ten slotte, met behulp van dubbele intracellulaire elektroden, cel-naar-cel koppelen via gap kruispunten kan ook worden beoordeeld. Met zorgvuldig geplande farmacologische en/of genetische ingrepen omvat het huidige protocol redelijk en kwantitatief onderzoek van cerebrale endothelial functie in zijn oorspronkelijke vorm. Onze verwachting is dat onderzoekers zal bouwen uit en passen deze informatie om te gaan vasculaire biologie en neurowetenschappen in het algemeen. Het zou in het bijzonder bevredigend om te zien van gemeenschappelijke experimentele strijd betrokken bij elektrische metingen helemaal tot een minimum beperkt. Hoewel dit protocol niet een zelfstandige reeks technieken op enigerlei wijze is, kan het worden gebruikt als een complementaire benadering bepalen precies hoe endothelial biofysische determinanten vertalen naar veranderingen in vasculaire weerstand en hoe zij de verordening aanpassen van de bloedstroom ten opzichte van de omstandigheden die representatief zijn voor gezondheid vs. ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Wij danken Charles Hewitt voor uitstekende technische hulp nodig hebt bij het opzetten van apparatuur en benodigdheden die nodig zijn voor de huidige protocollen. Wij danken Drs. Sean M. Wilson en Christopher G. Wilson, vanuit het midden van de LLU voor perinatale biologie, voor het verstrekken van ons met een extra omgekeerde Microscoop en elektrometer, respectievelijk. Dit onderzoek is gesteund door de National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) en de Loma Linda University School of Medicine nieuw faculteit start-up middelen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).
Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter