Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial “buizen” en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.
Cerebrale bloedvaten en hun respectieve microcirculatie leveren zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen via bloed stroom verordening. Endotheliale cellen lijn het lumen van de bloedvaten en de opdracht wijzigingen in vasculaire diameter desgewenst de metabole vraag van neuronen te voldoen. Primaire endotheel-afhankelijke signaalroutes voor hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal (V,m) en stikstofmonoxide werken meestal parallel aan bemiddelen vaatverwijding en daardoor de bloedtoevoer. Hoewel integraal te coördineren vasodilatatie over enkele millimeters van vasculaire lengte, onderdelen van endotheel afkomstige hyperpolarisatie (EDH) historisch moeilijk geweest te meten. Deze onderdelen van EDH inhouden intracellulaire Ca2 + [Ca2 +]ik verhoogt en verdere activering van kleine – en middenniveau huidgeleiding Ca2 +-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen.
Hier presenteren we een vereenvoudigde afbeelding van het isolement van verse endotheel van muis cerebrale bloedvaten; gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk; en een continue superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten onder fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). Posterieure cerebrale bloedvaten uit de cirkel van Willis worden verwijderd vrij van de posterieure communiceren en de arteria slagaders. Enzymatische spijsvertering van schoongemaakte posterieure cerebrale arteriële segmenten en latere verpulvering vergemakkelijkt verwijdering van adventitia, gerelateerde zenuwen en zachte spiercellen. Resulterende posterieure cerebrale arteriële endothelial “buizen” vervolgens onder een Microscoop zijn beveiligd en onderzocht met behulp van een camera, fotomultiplicator, en één of twee elektrometers terwijl onder continue superfusion. Collectief, kan deze methode gelijktijdig wijzigingen in endotheel [Ca2 +]ik en Vm in discrete cellulaire locaties, naast de verspreiding van EDH via gap kruispunten tot millimeter afstanden langs de intact meten endotheel. Deze methode wordt verwacht dat het rendement van een high-throughput analyse van de onderliggende mechanismen van bloed stroom verordening in de hersenen van normale en zieke endothelial hersenfunctie.
Doorbloeding in de hersenen wordt geregeld door de coördinatie van vasodilatatie onder cerebrale bloedvaten en arteriolen in vasculaire netwerken1. Endotheliale cellen voering cerebrale weerstand slagaders commando veranderingen in vasculaire diameter als nodig is om de metabole vraag van neuronen1,2,3te voldoen. In het bijzonder tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie (algemeen bekend als EDH), intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]ik) en elektrische signalering in de coördinaat vasodilatatie endotheliale cellen onder endotheliale cellen en hun omliggende zachte spiercellen via gap kruispunten voor arteriële ontspanning4. Fysiologische inleiding van EDH inhoudt achtereenvolgens stimulatie van de Gq-receptoren (GPCRs), een toename van [Ca2 +]iken activering van endothelial kleine – en intermediair-Ca2 +combinatie-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen aan cerebrale endothelial membraan potentiële (V,m)5,6,7hyperpolarize. Dus is de intieme relatie van endothelial [Ca2 +]ik en Vm integraal aan de bloed stroom verordening en onontbeerlijk voor cardio- en cerebrovasculaire functie6,8. In de bredere literatuur, tal van studies hebben melding gemaakt van de associatie van vasculaire endothelial dysfunctie met de ontwikkeling van chronische ziekten (bijvoorbeeld hypertensie, diabetes, hartfalen, coronaire hartziekten, chronisch nierfalen, ziekte van de perifere slagader)9,10, waarin het belang van het bestuderen van endothelial functie in fysiologische en pathologische omstandigheden.
Vasculaire endotheel is onlosmakelijk verbonden met de productie van hyperpolarisatie, vasodilatatie en perfusie van het weefsel en dus, onderzoek van de inheemse cellulaire eigenschappen is van cruciaal belang. Als een algemene studie-model, is voorbereiding van de arteriële endothelial buis muismodel gepubliceerd vóór voor skeletspieren11,12, gut13, Long14, en onlangs de hersenen6. Studies van gelijktijdige [Ca2 +]ik en Vm metingen zijn in het bijzonder gepubliceerd voor skeletspieren arteriële endotheel15,16 , alsmede lymfatische vaartuig endotheel17. Naast primaire studies gebruik te maken van de aanpak van het endotheel buis, kan een algehele herziening van de voor- en nadelen8 worden geraadpleegd om te bepalen of deze experimentele rol geschikt voor een specifieke studie is. Kortom, een voordeel is dat de fysiologische kerncomponenten van endothelial cel functie worden bewaard (bv., Ca2 + toestroom en intracellulaire release, hyperpolarisatie van Vm tot de Nernst potentieel voor K+ via SKCa/IKCa activering en endotheel intercellulaire koppeling via de kruispunten van de kloof) zonder verstorende factoren zoals gerelateerde zenuw input, gladde spieren spanning-gated kanaal functie en contractility, omloop van het bloed en hormonale invloeden8. Daarentegen gebruikte cel cultuur benaderingen introduceren aanzienlijke veranderingen in de morfologie18 en ion kanaal expressie19 op een wijze die sterk vergelijkingen op fysiologische opmerkingen bepaald ex vivo kan verduisteren of in vivo. Beperkingen omvatten een gebrek aan integratie met andere essentiële onderdelen voor de regulering van de doorbloeding, zoals de gladde spieren en beperkte flexibiliteit in een experimentele planning, als dit model optimaal binnen de 4 uur van intact vasculaire segment isolatie getest is van het dier.
Gebouw uit een vorige video protocol geschreven door Socha en Segal12 en recente experimentele ontwikkelingen in de tussentijdse6,15,16, wij hierbij laten zien dat de isolatie van verse endotheel van posterieure cerebrale bloedvaten en gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk. Dit experiment houdt bovendien continu superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten tijdens de fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). We kozen de posterieure cerebrale slagader, zoals het levert geïsoleerde endotheel met de structurele integriteit (cellen gekoppeld via gap kruispunten) en voldoende afmetingen (breedte ≥50 µm, lengte ≥300 µm) vatbaar voor intra- en intercellulaire signalering langs en onder endotheliale cellen. Bovendien, studies van de knaagdier posterieure cerebrale slagader zijn sterk vertegenwoordigd in de literatuur en omvatten onderzoek van fundamentele endothelial signalering mechanismen, vasculaire ontwikkeling/veroudering en pathologie20, 21 , 22. deze experimentele toepassing wordt verwacht rendement van een analyse van de high-throughput of cerebrale endothelial functie (dysfunctie) en zal daardoor zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in het begrip van bloed stroom verordening gedurende veroudering en de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekte.
In het licht van recente ontwikkelingen6,15,16,17tonen we nu de methode om te isoleren muis cerebrale arteriële endotheel in voorbereiding voor gelijktijdige meting van [Ca2 +] Ik en Vm onderliggende EDH consequent over ~ 2 h bij 37 ° C. Hoewel het technisch moeilijk, kunnen we meten aan-cel koppeling ook (zie referentie6, figuur 1). Op…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Charles Hewitt voor uitstekende technische hulp nodig hebt bij het opzetten van apparatuur en benodigdheden die nodig zijn voor de huidige protocollen. Wij danken Drs. Sean M. Wilson en Christopher G. Wilson, vanuit het midden van de LLU voor perinatale biologie, voor het verstrekken van ons met een extra omgekeerde Microscoop en elektrometer, respectievelijk. Dit onderzoek is gesteund door de National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) en de Loma Linda University School of Medicine nieuw faculteit start-up middelen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
MgCl2 | Sigma | M2670 | |
CaCl2 | Sigma | 223506 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Elastase | Sigma | E7885 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |