Summary

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Published: January 20, 2019
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Summary

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Abstract

Artères cérébrales et leur respectif microcirculation livrent l’oxygène et des nutriments à la régulation du débit du cerveau via le sang. Les cellules endothéliales ligne la lumière des vaisseaux sanguins et les modifications de la commande de diamètre vasculaire au besoin pour répondre à la demande métabolique des neurones. Principales voies de signalisation dépendant de l’endothélium de l’Hyperpolarisation du potentiel de membrane (Vm) et l’oxyde nitrique fonctionnent généralement en parallèle de médiation une vasodilatation et d’augmenter ainsi la circulation sanguine. Bien que partie intégrante de la coordination de vasodilatation au cours de plusieurs millimètres de longueur vasculaire, les composants de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (EDH) ont été historiquement difficiles à mesurer. Ces composants d’EDH entraînent intracellulaire Ca2 + [Ca2 +]j’ai augmente ainsi que l’activation subséquente de petit – et intermédiaires conductance Ca2 +-activé K+ (SKCa/IKCa) canaux.

Nous présentons ici une illustration simplifiée de l’isolement des frais endothélium des artères cérébrales de souris ; mesures simultanées d’endothéliales [Ca2 +]i et Vm par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement ; et une superfusion continue de solutions salines et des agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Les artères cérébrales postérieures de la cercle de Willis sont supprimés sans le communiquer postérieur et les artères basilaires. Il facilite digestion enzymatique des segments postérieurs nettoyés d’artériels cérébrales et la trituration subséquente de l’adventice, nerfs périvasculaires et des cellules musculaires lisses. Qui en résulte postérieures cérébrales artérielles endothéliales « tubes » sont ensuite fixés sous un microscope et examinés à l’aide d’une caméra, tube photomultiplicateur, et un ou deux électromètres sous superfusion continue. Collectivement, cette méthode permet de mesurer simultanément variations endothéliales [Ca2 +]i et Vm dans des endroits discrets cellulaires, en plus de la diffusion de l’EDH par l’intermédiaire de jonctions jusqu’à des distances de millimètre le long de l’intact endothélium. Cette méthode est censée produire une analyse de haut-débit des fonctions endothéliales cérébrales qui sous-tendent les mécanismes de régulation du débit sanguin dans le cerveau normal et malade.

Introduction

Le débit sanguin dans le cerveau est réglementé par la coordination de la vasodilatation des artères cérébrales et les artérioles dans réseaux vasculaires1. Cellules endothéliales tapissant de résistance cérébral artères commande changements de diamètre vasculaire au besoin afin de répondre à la demande métabolique des neurones1,2,3. En particulier, au cours de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (communément appelé EDH), intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]i) et signalisation électrique dans les cellules endothéliales vasodilatation coordonnée entre les cellules endothéliales et leur cellules musculaires lisses environnantes par jonctions lacunaires pour relaxation artérielle4. Ouverture physiologique d’EDH implique séquentielle stimulation de Gq-récepteurs couplés (RCPG), une augmentation de [Ca2 +]iet activation endothéliale petit – et intermédiaire-Ca2 +-activé K+ (SKCa/IKCa) canaux pour hyperpolarisent membrane endothéliale cérébrale potentielle (Vm)5,6,7. Ainsi, la relation intime entre endothéliales [Ca2 +]i et Vm est partie intégrante de la régulation du débit sanguin et indispensables à la cardio – et cérébrovasculaires fonction6,8. Tout au long de la littérature plus large, de nombreuses études ont signalé à l’association de la dysfonction endothéliale vasculaire avec le développement des maladies chroniques (p. ex., hypertension, diabète, insuffisance cardiaque, maladie coronarienne, l’insuffisance rénale chronique, la maladie artérielle périphérique)9,10, ce qui indique l’importance d’étudier la fonction endothéliale dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Endothélium vasculaire fait partie intégrante de la production de l’Hyperpolarisation, vasodilatation et perfusion tissulaire et l’examen de ses propriétés cellulaires natives est donc cruciale. Comme un modèle d’étude générale, préparation du modèle souris tube endothélium artériel a été publiée avant pour le muscle squelettique11,12,13de tube digestif, poumon14et, récemment, pour le cerveau6. Études de simultanée [Ca2 +]i et Vm mesures en particulier ont été publiées pour le muscle squelettique endothélium artériel15,16 comme vaisseau lymphatique endothélium17. En plus des études primaires utilisant l’approche le tube endothéliale, un examen approfondi de ses avantages et ses inconvénients8 peut être consulté pour déterminer si cet outil expérimental est approprié pour une étude spécifique. En bref, un avantage est que les composantes physiologiques clés de la fonction des cellules endothéliales sont retenus (p. ex., influx de Ca2 + , et intracellulaire, l’Hyperpolarisation des Vm atteignant le potentiel de Nernst pour K+ par l’intermédiaire SKCa/IKCa activation et endothéliales couplage intercellulaire via les jonctions lacunaires) sans confusionnelles comme entrée de nerfs périvasculaires, fonction de muscle lisse les canaux voltage-dépendants et la contractilité, circulation du sang et les influences hormonales8. En revanche, approches de la culture cellulaire couramment utilisés introduisent des changements significatifs dans la morphologie18 et ion channel expression19 d’une manière qui peut obscurcir grandement les comparaisons avec les observations physiologiques déterminées ex vivo ou in vivo. Limitations incluent un manque d’intégration avec d’autres composants essentiels de régulation de la circulation sanguine, telles que les muscles lisses et une flexibilité limitée dans une planification expérimentale, que ce modèle est testé idéalement moins de 4 h d’isolement segment vasculaire intact de l’animal.

Construction d’un protocole vidéo précédent écrit par Socha et Segal12 et récents développements expérimentaux dans le provisoire6,15,16, nous démontrons par les présentes l’isolement de l’endothélium frais de les artères cérébrales postérieures et des mesures simultanées d’endothéliales [Ca2 +]i et Vm par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement. En outre, cette expérience comporte superfusion continue de solutions salines et agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Nous avons choisi l’artère cérébrale postérieure, car il donne endothélium isolé avec l’intégrité structurale (cellules couplés à travers les jonctions lacunaires) et dimensions suffisantes (largeur ≥ 50 µm, longueur ≥300 µm) se prête pour intra – et intercellulaires de signalisation le long et parmi cellules endothéliales. En outre, les études de l’artère cérébrale postérieure rongeur sont largement représentées dans la littérature et englobent l’examen des mécanismes de signalisation endothéliales fondamentales, développement/vieillissement vasculaire et pathologie20, 21 , 22. cette application expérimentale devrait donner une analyse de haut-débit de la fonction endothéliale cérébrale (et dysfonctionnement) et permettra ainsi des progrès importants dans la compréhension de la régulation du débit sanguin dans l’ensemble vieillissement et le développement de maladies neuro-dégénératives.

Protocol

Avant d’effectuer les expériences suivantes, s’assurer que tous les soins des animaux utilisent et protocoles sont approuvées par l’animalerie institutionnels et utiliser Comité (IACUC) et interprétés en accord avec le Conseil National de recherches ” “Guide pour le soin et l’utilisation de Les animaux de laboratoire” ” (8ème édition, 2011) et les directives de l’arrivée. L’IACUC de l’Université de Loma Linda a approuvé tous les protocoles utilisés pour ce manuscrit p…

Representative Results

La démonstration schématique du protocole décrit ci-dessus est indiquée dans les figures ci-jointe. Un cerveau isolé de l’adulte jeune souris C57BL/6N mâle (5 mois) est montré dans la Figure 1 a. Les artères cérébrales postérieures sont soigneusement isolés depuis le cercle de Willis, enlevé sans tissu conjonctif et coupées en segments (Figure 1 b-D). De segments artériels partiellement digérée…

Discussion

À la lumière des récents développements6,15,16,17, nous démontrons maintenant la méthode pour isoler l’endothélium artériel cérébral de souris en préparation pour la mesure simultanée de la [Ca2 +] i et Vm sous-jacent EDH régulièrement pendant environ 2 h à 37 ° C. Bien que techniquement difficile, nous pouvons mesurer la cellule-cellule d’ac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Charles Hewitt excellente assistance technique lors de l’établissement des équipements et des fournitures nécessaires pour les protocoles actuels. Nous remercions les Drs Sean M. Wilson et Christopher G. Wilson, depuis le centre de dégroupage pour biologie périnatale, pour nous avoir fourni un microscope inversé supplémentaire et l’électromètre, respectivement. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) et de nouveaux fonds de démarrage de faculté faculté de médecine de l’Université de Loma Linda. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

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Cite This Article
Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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