Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Summary

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Abstract

Artères cérébrales et leur respectif microcirculation livrent l’oxygène et des nutriments à la régulation du débit du cerveau via le sang. Les cellules endothéliales ligne la lumière des vaisseaux sanguins et les modifications de la commande de diamètre vasculaire au besoin pour répondre à la demande métabolique des neurones. Principales voies de signalisation dépendant de l’endothélium de l’Hyperpolarisation du potentiel de membrane (V_m) et l’oxyde nitrique fonctionnent généralement en parallèle de médiation une vasodilatation et d’augmenter ainsi la circulation sanguine. Bien que partie intégrante de la coordination de vasodilatation au cours de plusieurs millimètres de longueur vasculaire, les composants de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (EDH) ont été historiquement difficiles à mesurer. Ces composants d’EDH entraînent intracellulaire Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_j’ai augmente ainsi que l’activation subséquente de petit – et intermédiaires conductance Ca^{2 +}-activé K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canaux.

Nous présentons ici une illustration simplifiée de l’isolement des frais endothélium des artères cérébrales de souris ; mesures simultanées d’endothéliales [Ca^{2 +}]_i et V_m par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement ; et une superfusion continue de solutions salines et des agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Les artères cérébrales postérieures de la cercle de Willis sont supprimés sans le communiquer postérieur et les artères basilaires. Il facilite digestion enzymatique des segments postérieurs nettoyés d’artériels cérébrales et la trituration subséquente de l’adventice, nerfs périvasculaires et des cellules musculaires lisses. Qui en résulte postérieures cérébrales artérielles endothéliales « tubes » sont ensuite fixés sous un microscope et examinés à l’aide d’une caméra, tube photomultiplicateur, et un ou deux électromètres sous superfusion continue. Collectivement, cette méthode permet de mesurer simultanément variations endothéliales [Ca^{2 +}]_i et V_m dans des endroits discrets cellulaires, en plus de la diffusion de l’EDH par l’intermédiaire de jonctions jusqu’à des distances de millimètre le long de l’intact endothélium. Cette méthode est censée produire une analyse de haut-débit des fonctions endothéliales cérébrales qui sous-tendent les mécanismes de régulation du débit sanguin dans le cerveau normal et malade.

Introduction

Le débit sanguin dans le cerveau est réglementé par la coordination de la vasodilatation des artères cérébrales et les artérioles dans réseaux vasculaires¹. Cellules endothéliales tapissant de résistance cérébral artères commande changements de diamètre vasculaire au besoin afin de répondre à la demande métabolique des neurones^1,2,3. En particulier, au cours de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (communément appelé EDH), intracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) et signalisation électrique dans les cellules endothéliales vasodilatation coordonnée entre les cellules endothéliales et leur cellules musculaires lisses environnantes par jonctions lacunaires pour relaxation artérielle⁴. Ouverture physiologique d’EDH implique séquentielle stimulation de G_q-récepteurs couplés (RCPG), une augmentation de [Ca^{2 +}]_iet activation endothéliale petit – et intermédiaire-Ca^{2 +}-activé K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canaux pour hyperpolarisent membrane endothéliale cérébrale potentielle (V_m)^5,6,7. Ainsi, la relation intime entre endothéliales [Ca^{2 +}]_i et V_m est partie intégrante de la régulation du débit sanguin et indispensables à la cardio – et cérébrovasculaires fonction^6,8. Tout au long de la littérature plus large, de nombreuses études ont signalé à l’association de la dysfonction endothéliale vasculaire avec le développement des maladies chroniques (p. ex., hypertension, diabète, insuffisance cardiaque, maladie coronarienne, l’insuffisance rénale chronique, la maladie artérielle périphérique)^9,10, ce qui indique l’importance d’étudier la fonction endothéliale dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Endothélium vasculaire fait partie intégrante de la production de l’Hyperpolarisation, vasodilatation et perfusion tissulaire et l’examen de ses propriétés cellulaires natives est donc cruciale. Comme un modèle d’étude générale, préparation du modèle souris tube endothélium artériel a été publiée avant pour le muscle squelettique^11,12,¹³de tube digestif, poumon¹⁴et, récemment, pour le cerveau⁶. Études de simultanée [Ca^{2 +}]_i et V_m mesures en particulier ont été publiées pour le muscle squelettique endothélium artériel^15,16 comme vaisseau lymphatique endothélium¹⁷. En plus des études primaires utilisant l’approche le tube endothéliale, un examen approfondi de ses avantages et ses inconvénients⁸ peut être consulté pour déterminer si cet outil expérimental est approprié pour une étude spécifique. En bref, un avantage est que les composantes physiologiques clés de la fonction des cellules endothéliales sont retenus (p. ex., influx de Ca^{2 +} , et intracellulaire, l’Hyperpolarisation des V_m atteignant le potentiel de Nernst pour K⁺ par l’intermédiaire SK_Ca/IK_Ca activation et endothéliales couplage intercellulaire via les jonctions lacunaires) sans confusionnelles comme entrée de nerfs périvasculaires, fonction de muscle lisse les canaux voltage-dépendants et la contractilité, circulation du sang et les influences hormonales⁸. En revanche, approches de la culture cellulaire couramment utilisés introduisent des changements significatifs dans la morphologie¹⁸ et ion channel expression¹⁹ d’une manière qui peut obscurcir grandement les comparaisons avec les observations physiologiques déterminées ex vivo ou in vivo. Limitations incluent un manque d’intégration avec d’autres composants essentiels de régulation de la circulation sanguine, telles que les muscles lisses et une flexibilité limitée dans une planification expérimentale, que ce modèle est testé idéalement moins de 4 h d’isolement segment vasculaire intact de l’animal.

Construction d’un protocole vidéo précédent écrit par Socha et Segal¹² et récents développements expérimentaux dans le provisoire^6,15,16, nous démontrons par les présentes l’isolement de l’endothélium frais de les artères cérébrales postérieures et des mesures simultanées d’endothéliales [Ca^{2 +}]_i et V_m par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement. En outre, cette expérience comporte superfusion continue de solutions salines et agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Nous avons choisi l’artère cérébrale postérieure, car il donne endothélium isolé avec l’intégrité structurale (cellules couplés à travers les jonctions lacunaires) et dimensions suffisantes (largeur ≥ 50 µm, longueur ≥300 µm) se prête pour intra – et intercellulaires de signalisation le long et parmi cellules endothéliales. En outre, les études de l’artère cérébrale postérieure rongeur sont largement représentées dans la littérature et englobent l’examen des mécanismes de signalisation endothéliales fondamentales, développement/vieillissement vasculaire et pathologie^{20, 21 , 22}. cette application expérimentale devrait donner une analyse de haut-débit de la fonction endothéliale cérébrale (et dysfonctionnement) et permettra ainsi des progrès importants dans la compréhension de la régulation du débit sanguin dans l’ensemble vieillissement et le développement de maladies neuro-dégénératives.

Protocol

Avant d’effectuer les expériences suivantes, s’assurer que tous les soins des animaux utilisent et protocoles sont approuvées par l’animalerie institutionnels et utiliser Comité (IACUC) et interprétés en accord avec le Conseil National de recherches ” “Guide pour le soin et l’utilisation de Les animaux de laboratoire” ” (8ème édition, 2011) et les directives de l’arrivée. L’IACUC de l’Université de Loma Linda a approuvé tous les protocoles utilisés pour ce manuscrit p…

Representative Results

La démonstration schématique du protocole décrit ci-dessus est indiquée dans les figures ci-jointe. Un cerveau isolé de l’adulte jeune souris C57BL/6N mâle (5 mois) est montré dans la Figure 1 a. Les artères cérébrales postérieures sont soigneusement isolés depuis le cercle de Willis, enlevé sans tissu conjonctif et coupées en segments (Figure 1 b-D). De segments artériels partiellement digérée…

Discussion

À la lumière des récents développements^6,15,16,17, nous démontrons maintenant la méthode pour isoler l’endothélium artériel cérébral de souris en préparation pour la mesure simultanée de la [Ca^{2 +}] _i et V_m sous-jacent EDH régulièrement pendant environ 2 h à 37 ° C. Bien que techniquement difficile, nous pouvons mesurer la cellule-cellule d’ac…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55