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Biology

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Abstract

Zerebralen Arterien und ihre jeweiligen Mikrozirkulation liefern Sauerstoff und Nährstoffe an das Gehirn über Blut Durchflussregulierung. Endothelzellen säumen das Lumen der Blutgefäße und Befehl Änderungen im vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen. Primäre Endothel-abhängige Signalwege der Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) und Stickoxid-arbeiten in der Regel parallel zur Vermittlung Vasodilatation und steigern somit die Durchblutung. Obwohl integrale zur Koordinierung der Vasodilatation über mehrere Millimeter der vaskulären Länge wurden Bestandteile der Endothel-derived Hyperpolarisation (EDH) historisch schwierig zu messen. Diese Komponenten des EDH beinhalten intrazellulären Ca2 + [Ca2 +]ich erhöht und anschließende Aktivierung von klein - und Mittelstufe Leitwert Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle.

Hier präsentieren wir Ihnen eine vereinfachte Darstellung der Isolation des frischen Endothel von Maus zerebralen Arterien; gleichzeitige Messung von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.; und eine kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Hintere Hirnarterien aus dem Kreis von Willis entfernt die hinteren kommunizieren und die Kameraausrüstung Arterien frei. Enzymatische Verdauung von gereinigten hinteren zerebralen arteriellen Segmente und anschließenden Verreibung erleichtert die Entfernung der Adventitia, perivaskuläre Nerven und glatten Muskelzellen. Resultierende hintere zerebrale arterielle Endothelzellen "Röhren" sind dann unter dem Mikroskop gesichert und mit einer Kamera, Photomultiplier Tube, und ein bis zwei Stromzähler unter kontinuierlicher Superfusion untersucht. Gemeinsam kann diese Methode gleichzeitig Änderungen in Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm in diskreten zellulären lagen, neben der Verbreitung des EDH durch Lücke Kreuzungen bis zu Millimeter Abstand entlang der intakten messen Endothel. Diese Methode wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zugrunde liegenden Blut fließen Regulationsmechanismen im normalen und kranken Gehirn endothelialen Gehirnfunktionen ergeben.

Introduction

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Blutfluss im Gehirn wird durch die Koordination der Vasodilatation bei zerebralen Arterien und Arteriolen in vaskulären Netzwerken1geregelt. Endothelzellen Futter zerebralen Arterien Befehl Widerstandsänderungen vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen1,2,3. Insbesondere während der Endothel-derived Hyperpolarisation (allgemein bekannt als EDH) intrazelluläre Ca2 + ([Ca2 +]ich) und elektrische Signalisierung in Endothelzellen koordinieren Vasodilatation unter den Endothelzellen und ihre umgebenden glatten Muskelzellen durch Gap Junctions für arterielle Entspannung4. Physiologische Einleitung des EDH beinhaltet nacheinander Stimulierung des G-Q-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), eine Zunahme [Ca2 +]ichund Aktivierung von Endothelzellen kleine und Intermediate-Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle zu zerebralen Endothelzellen Membran potenzielle (Vm)5,6,7hyperpolarize. So ist das innige Verhältnis von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm Blut Durchflussregulierung integraler Bestandteil und unverzichtbar für Kardio- und zerebrovaskuläre Funktion6,8. In der breiteren Literatur haben zahlreiche Studien die Assoziation von vaskulären endothelialen Dysfunktion mit der Entwicklung von chronischen Krankheiten (z.B. Bluthochdruck, Diabetes, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheit, chronische Niereninsuffizienz, berichtet. periphere Herzkrankheit)9,10, was die Bedeutung des Studiums Endothelfunktion in physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Vaskulären Endothel ist ein wesentlicher Bestandteil für die Produktion von Hyperpolarisation, Vasodilatation und Gewebedurchblutung und somit Prüfung seiner nativen zellulären Eigenschaften entscheidend. Als eine allgemeine Studienmodell Vorbereitung des arteriellen endothelial Rohr Mausmodells vor Skelettmuskulatur11,12, Darm13, Lunge14, und vor kurzem für das Gehirn6erschienen. Studien zur gleichzeitigen [Ca2 +]ich und Vm Messungen sind insbesondere für skelettartigen Muskel arteriellen Endothel15,16 , sowie Lymphgefäßsystem Endothel17erschienen. Neben Primärstudien unter Verwendung des endothelialen Rohr Ansatzes kann ein umfassender Überblick über die vor- und Nachteile8 konsultiert werden, um festzustellen, ob diese experimentelle Werkzeug für eine spezifische Studie geeignet ist. Kurz gesagt, ein Vorteil ist, dass die physiologische Schlüsselkomponenten der endothelial Zelle Funktion beibehalten werden (z. B., Ca2 + Zustrom und intrazellulären freilassen, Hyperpolarisation der Vm bis das Nernst-Potenzial für K+ über SKCa/IKCa Aktivierung und endotheliale interzellulären Kopplung über Lücke Kreuzungen) ohne Störfaktoren wie perivaskuläre Nerven Input, glatte Muskulatur Voltage-gated Kanal Funktion und Kontraktilität, Zirkulation von Blut und hormonelle Einflüsse8. Im Gegensatz dazu häufig verwendete Zelle Kultur Ansätze einzuführen erhebliche Veränderungen in der Morphologie18 und Ionen-Kanal Ausdruck19 in einer Weise, die Vergleiche auf physiologische Beobachtungen bestimmt ex Vivo stark verschleiern kann oder in Vivo. Einschränkungen umfassen eine mangelnde Integration mit anderen wesentlichen Komponenten für die Regulierung der Durchblutung, wie glatte Muskulatur und eingeschränkte Flexibilität in einem experimentellen Zeitplan, wie dieses Modell optimal innerhalb von 4 h der intakten Kreislauf Segment isoliert getestet wird vom Tier.

Gebäude aus einem vorherigen video Protokoll verfasst von Socha und Segal12 und experimentellen Entwicklungen in der interim6,15,16, zeigen wir Ihnen hiermit die Isolation der frischen Endothel von hinteren Hirnarterien und gleichzeitige Messungen von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.. Darüber hinaus beinhaltet dieses Experiment kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Wir entschieden uns für die hinteren zerebralen Arterie wie es isolierte Endothel mit der strukturellen Integrität (Zellen über Gap Junctions verbunden) und ausreichend Abmessungen (Breite ≥50 µm, Länge ≥300 µm) für Intra- und interzellulären Signal entlang und unter ergibt Endothelzellen. Darüber hinaus Studien der Nager hinteren zerebralen Arterie werden im Wesentlichen in der Literatur dargestellt und umfassen die Prüfung der grundlegenden endotheliale Signalisierung Mechanismen, vaskuläre Entwicklung/Altern und Pathologie20, 21 , 22. Diese experimentelle Anwendung wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zerebralen Endothelfunktion (und Dysfunktion) führen und ermöglicht dadurch erhebliche Fortschritte im Verständnis der Blut-Durchfluss-Verordnung in der gesamten Altern und die Entwicklung der Neurodegenerative Erkrankung.

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Protocol

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Bevor Sie die folgenden Experimente durchführen, sicherzustellen, dass alle Tierpflege verwenden und Protokolle sind vom Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit der National Research Council " "Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren" " (8th Edition, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Die IACUC der Loma Linda Universität genehmigt alle Protokolle für diese Handschrift für männliche und weibliche C57BL/6 Mäusen (Altersgruppe: 3 bis 30 Mo).

1. Geräte und Materialien

Hinweis: Details für das Protokoll benötigten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien, Reagenzien, und Handbücher oder Websites, die mit dem jeweiligen Anbieter.

  1. Strömungsraum
    1. Befestigen Sie eine superfusion Kammer mit einem Glasboden Deckglas in einem Gehäuse aus eloxiertem Aluminium-Plattform. Sichern Sie die Plattform mit Kammer in eine kompakte Aluminium-Bühne.
    2. Legen Sie einen Mikromanipulator an jedem Ende der Plattform, auf der Aluminium-Bühne für die Abhaltung der pinning Pipette.
      Hinweis: Als eine praktische Option verwenden dieses Gerät übertragbar Bühne mit einer Kammer Flusseinheit gesichert, um den Übergang von der Isolierung der endothelialen Röhre zur Leistung der Experimente.
  2. Mikroskope
    1. Verwendung Stereomikroskope (5 X 50 X Vergrößerungsbereich) ausgestattet mit Fiber optic Lichtquellen für Makro und Mikro-Dissektion Verfahren.
    2. Verwenden Sie für Vorbereitung der endothelialen Röhren einem inversen Mikroskop mit Phase Kontrast oder Differential Interferenz Kontrast (DIC) kompatible Ziele (10 X, 20 X und 40 X) und ein Aluminium-Bühne ausgestattet.
    3. Um endotheliale Röhren aus teilweise verdaute Blutgefäße zu isolieren, platzieren Sie eine Pumpensteuerung Microsyringe neben der endothelialen Rohr Vorbereitung Apparat.
    4. Verwenden Sie für die experimentelle Vorrichtung, einem inversen Mikroskop ausgestattet mit standard Zielen (4 X und 10 X) neben fluoreszierende Ziele (20 X 40 X, numerische Apertur 0,75) und eine manuelle Aluminium-Bühne auf einem Rütteltisch Isolierung.
  3. Intrazelluläre Recording-Equipment
    1. Um Vm von Endothelzellen in isolierten endotheliale Röhren aufzuzeichnen, schließen Sie das Elektrometer an kompatiblen Headstage an. Bei Bedarf verbinden Sie ein Funktionsgenerator oder Stimulator mit Elektrometer für Experimente, für die Stromeinspeisung erforderlich.
    2. Schließen Sie den Verstärker Ausgänge an ein Datenerfassungssystem, akustische Grundlinie Monitoren und einem Oszilloskop. Sichern Sie die Bezugselektrode (Ag/AgCl Pellet) in der Nähe der Fluss Kammer während der Experimente.
    3. Verwenden Sie ein photometrisches System mit integrierten Komponenten einer Fluoreszenz System Schnittstelle, hohe Intensität Bogenlampe und macht Lieferung, Hyperswitch, Photomultiplier Röhre (oder PMT), und Kamera [Ca2 +]ich in Endothelzellen messen.
    4. Verwenden Sie einen Temperaturregler ausgestattet mit einer Inline-Heizung zu erhöhen und eine physiologische Temperatur (37 ° C) während des Experiments.
    5. Verwenden Sie eine sechs-Reservoir-Plattform mit einem Ventil-Controller mit einer Inline-Stromregelventil verbunden, um die Lieferung der jeweiligen Lösungen an die Endothelzellen Röhre sicherte sich in der Kammer zu steuern.
  4. Mikropipetten und scharfen Elektroden
    Hinweis: Herstellung von Pipetten Verreibung und die mechanische Stabilisierung der isolierten endotheliale Rohre verwenden eine elektronische Abzieher für das Ziehen der Pipetten und ein Mikro-Schmiede für das brechen und Feuer polieren.
    1. Um die teilweise verdaute arteriellen Segment Adventitia, glatte Muskelzellen und Endothelzellen Rohr trennen, Zerreibung Pipetten (jeweils mit einem internen Tipp-Durchmesser von 80 – 120 µm) gegebenenfalls mit Borosilikatglas Kapillarröhrchen, vorbereiten und Feuer Polieren Sie die Spitze.
    2. Verwenden, um die endotheliale Rohr gegen die Unterseite der superfusion Kammer befestigen pinning Pipetten mit einem abgestumpften, kugelförmige Ende (Wärme-poliert, OD von 100 – 150 µm; aus Borosilikatglas dünnwandige Rohre vorbereitet).
    3. Zum Aufzeichnen von Vm einer endothelial Zelle bereiten scharfe Elektroden mit einem Tipp-Widerstand von ~ 150 ± 30 MΩ aus Glas Kapillarröhrchen mit einem elektronischen Puller.

2. Vorbereitung der Lösungen und Medikamente

  1. Physiologische Salzlösung (PSS)
    1. Für ein Experiment mit Medikament Vorbereitungen, bereiten ein Minimum von 1 L mit PSS: 140 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Säure (HEPES) und 10 mM Glukose.
    2. Um die gewünschten Lösungen Dissektion vorzubereiten, bereiten Isolierung der zerebralen Arterie und Vorbereitung der endothelialen Rohr PSS CaCl2 (null Ca2 + PSS) fehlt.
    3. Bereiten Sie alle Lösungen in hochreinen entionisiertem H2O, anpassen des pH-Werts 7,4, durch einen Filter (0,22 µm Porengröße) zu sterilisieren und sicherzustellen, dass die Osmolalität der Lösungen zwischen 290 und 300 mOsm.
      Hinweis: Lösungen können etwa zwei Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
  2. 10 % Rinderserumalbumin (BSA)
    1. Um 10 % BSA vorzubereiten, lösen Sie 1 g des lyophilisierten Pulvers in ein Becherglas von 10 mL Null Ca2 + PSS.
    2. Decken Sie das Becherglas mit Paraffin Film und lassen Sie einen Zeitraum von mehreren Stunden passieren, mit langsamen Rühren die BSA aufzulösen.
    3. Filtern Sie die endgültige Lösung mit einer 10 mL Spritze plus 0,22 µm Filter und machen Sie 1 mL Aliquote bei-20 ° c gelagert werden
  3. Dissektion Lösung
    1. Um 50 mL der Dissektion Lösung vorzubereiten, fügen Sie 500 µL der BSA (10 % hinzu) zu 49,5 mL Null Ca2 + PSS.
    2. Sofort nach der Zubereitung übertragen Sie diese Dissektion-Lösung in eine Petrischale für arterielle Dissektion.
  4. Dissoziation-Lösung
    1. Um 50 mL der Dissoziation Lösung vorzubereiten, fügen Sie 5 µL CaCl2 (1 M) und 500 µL der BSA (10 %) auf 49,5 mL Null Ca2 + PSS. Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) sitzen.
  5. Enzyme
    1. Bereiten Sie teilweise Verdauung der arteriellen Segmente 1 mL der Aufschlusslösung mit 0,31 mg/mL Papain, 0,5 mg/mL Dithioerythritol, 0,75 mg/mL Kollagenase (Typ H Mischung) und 0,13 mg/mL Elastase.
      Hinweis: Enzym-Aktivitäten können variieren; aber für unsere erfolgreichen Protokolle kommerziell gelieferte Enzymaktivitäten werden wie folgt: Papain ≥10 Einheiten/mg; Kollagenase ≥1 Einheiten/mg, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala oder FALGPA Untergrund Umsatz; und Elastase ≥ 5 Einheiten/mg.
  6. Vorbereitung von Fura-2 und pharmakologische Wirkstoffe
    1. Bereiten Sie Lager Konzentration (1 mM) von Fura-2 AM Farbstoff in DMSO. Bereiten Sie eine arbeiten-Konzentration (10 µM) 495 µL PSS für laden 5 µL Lager hinzu.
    2. Bereiten Sie ≥50 mL Konzentrationen von pharmakologischen Wirkstoffen (z. B. ATP) arbeiten in PSS entsprechend vor.
  7. Durchführung von Lösung
    1. Bereiten Sie eine Durchführung von Lösung, 2 M KCl, durch Auflösen von KCl entionisiertem H2O (7,455 g KCl in 50 mL H2O).
    2. Filtern Sie der Lösung durch einen 0,22 µm Spritze Filter vor der Verfüllung der scharfen Elektroden.
  8. Propidium Jodid (0,1 %)
    1. 10 mg gefriergetrockneten Propidium Jodid in 10 mL 2 M KCl auflösen.
    2. Gut mischen und speichern bei RT

(3) Dissektion und Isolierung von zerebralen Arterie

Hinweis: Alle Dissektion Verfahren erfordern Probe Vergrößerung (bis zu 50 X) über Stereomikroskope und Beleuchtung von Fiber optic Lichtquellen zur Verfügung gestellt. Zum Ausführen der Dissektion Verfahren zur Isolierung des Gehirns und der Arterien einsetzen Sie geschärften Dissektion Instrumente. Mikrodissektion Werkzeuge zu isolieren und reinigen die Arterien sind geschärft feine Spitzen Pinzette und Vannas Stil Dissektion Schere (3 bis 9,5 mm klingen).

  1. Isolierung von Gehirn der Maus
    1. Eine C57BL/6-Maus (3-30 Monate alt, männlich oder weiblich) über Inhalation von Isofluran (3 % für 2 – 3 min.) zu betäuben, dann das Tier sofort nach vollständige Induktion der Anästhesie zu enthaupten. Legen Sie den Kopf in eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Tiefe 1,5 cm), kalt (4 ° C) enthält Null Ca2 + PSS unter einem Stereomikroskop.
    2. Unter dem Mikroskop betrachten, die Haut und die Haare über den Schädel entfernen Sie und übermäßigen Blut mit kaltem Null Ca2 + PSS. Machen Sie einen Schnitt mit nur die Spitzen der standard Dissektion Schere (z. B. 24 mm Klinge), beginnend mit dem Hinterhauptsbein und Verlängerung bis durch die nasale Knochen des Schädels.
    3. Öffnen Sie den Schädel sorgfältig entlang der Schnitt mit groben gekippt Zange und separate Bindegewebe, um das Gehirn mit einem intakten Kreis von Willis zu isolieren.
      Hinweis: Alternativ können Littauer Knochen schneiden Zangen verwendet werden, öffnen den Schädel und das Gehirn aussetzen.
    4. Waschen Sie vorsichtig dem isolierte Gehirn mit kalten Null Ca2 + PSS in ein Becherglas, Blut zu entfernen. Legen Sie die Gehirn ventralen Seite nach oben in eine Kammer mit kalten Dissektion Lösung für die Isolierung der Hirnarterien (Abbildung 1A).
  2. Isolierung der Hirnarterien
    Hinweis: Die hintere zerebrale Arterie wurde als eine repräsentative zerebrovaskuläre endotheliale Studienmodell für dieses Protokoll ausgewählt.
    1. Sichern Sie das isolierte Gehirn in kalten Dissektion Lösung mit Edelstahlstiften (Durchmesser 0,2 mm, Länge ~ 11 – 12 mm) in ein Holzkohle-infundiert Silikon-Polymer Beschichtung der Unterseite (Tiefe ≥50 cm) eines Glases Petrischale eingefügt werden soll.
    2. Verwenden Sie eine Dissektion Kammer durch ein Kühlsystem kontinuierlich Radfahren ein 1:1 Wasser-Ethylen-Glykol-Gemisch gekühlt, um eine gekühlte Temperatur von PSS während Dissektion beizubehalten. Alternativ kann die Dissektion auf frisches Eis durchgeführt werden.
    3. Chirurgisch zu isolieren, die hinteren Hirnarterien (~0.3 auf 0,5 cm Segmente, keine axiale Spannung) an der hinteren Kommunikation und basilaris Arterien mit Mikrodissektion Instrumente Vannas Stil Schere und geschärften feine Spitzen Pinzette (Abbildung 1 b ). Verwenden Sie Edelstahlstiften (Durchmesser 0,1 mm, Länge ~ 13 – 14 mm) sicher isoliert beide hintere Hirnarterien in die Dissektion-Lösung in der Petrischale (Abbildung 1).
    4. Reinigen Sie sorgfältig isolierten hinteren Hirnarterien, indem Bindegewebe mit geschärften feine Spitzen Pinzette (Abbildung 1). Intakte Arterien in Segmente geschnitten (Länge 1 – 2 mm) für die enzymatische Verdauung (Abbildung 1; Einschub).

4. Vorbereitung der endothelialen Rohr- und Superfusion

Hinweis: Die endotheliale Röhre ist bereit, wie zuvor beschrieben12, mit Modifikationen für die zerebralen Arterie-6.

  1. Bereiten Sie die Verreibung Vorrichtung unter Verwendung eines Mikroskops mit Zielen (10 X, 20 X und 40 X), eine Kamera und ein Aluminium-Bühne mit einer Kammer und Mikromanipulatoren ausgestattet. Sichern Sie eine Microsyringe mit einer Pumpensteuerung neben der Bühne und Probe (Abbildung 2A).
  2. Völlig Hinterfüllung eine Verreibung pipette mit Mineralöl und sichern Sie ihn über den Mikro-Spritze-Kolben. Dann, mit der Mikro-Spritze mit Pumpensteuerung, Dissoziation Lösung in die Pipette zurückziehen (~ 130 nl) auf dem Mineralöl und gleichzeitig das Fehlen von Luftblasen in der Pipette.
  3. Platzieren Sie intakt arteriellen Segmente in 1 mL der Lösung der Dissoziation in einer Glasröhre 10 mL (Abb. 2 b), mit 0,31 mg/mL Papain, 0,5 mg/mL Dithioerythritol, 0,75 mg/mL Kollagenase und Elastase 0,13 mg/mL. Bei 34 ° C für 10 – 12 min für teilweise Verdauung inkubieren.
  4. Nach der Verdauung ersetzen der Enzymlösung mit ~ 5 mL frisches Dissoziation Lösung. Mit einer 1-mL-Pipette übertragen Sie ein Segment in eine Kammer, die die Dissoziation Lösung bei RT
  5. Legen Sie die Pipette in die Dissoziation-Lösung in der Kammer, und positionieren Sie es in der Nähe von einem Ende des verdauten Schiffes. Legen Sie einen Preis im Bereich von 2 bis 5 nL/s auf die Pumpensteuerung für sanfte Verreibung (Abbildung 2, Einschub).
  6. Während der Anzeige durch 100 X 200 X Vergrößerung, zurückziehen und Auswerfen der arteriellen Segments zu glatten Muskelzellen zu trennen, während die Herstellung einer endothelialen Rohres. Bei Bedarf verwenden Sie sorgfältig feine Spitzen Pinzette dissoziierten Adventitia und internen elastischen Lamina aus der endothelialen Tube zu trennen. Bestätigen Sie, dass alle glatten Muskelzellen getrennt sind und dass nur Endothelzellen als eine intakte "Tube" (Abbildung 2).
  7. Mit Mikromanipulatoren, sichern Sie jedes Ende der endothelialen Röhre auf das Deckglas Glas der superfusion Kammer mit Borosilikatglas anheften Pipetten (Abb. 2D).
  8. Wash-Out distanzierte Adventitia und glatten Muskelzellen aus der Kammer und ersetzen die Dissoziation-Lösung mit 2 mM CaCl2 PSS. Die mobile Plattform mit gesicherten endotheliale Rohr auf das Mikroskop der superfusion und experimentelle Rig zu übertragen.
  9. Verwenden Sie 6 saubere 50 mL Stauseen (Abbildung 3A) für kontinuierliche Lieferung von PSS und jeweiligen Droge Lösungen während des Experiments, je nach Bedarf. Verwenden Sie das Inline-Stromregelventil, um manuell die Durchflussmenge im ganzen als konsistent mit Laminar-Flow eingestellt, während passender Strömung zu Vakuum-Saug-feed. Liefern Sie PSS an die Kammer (Abb. 3 b) für die Superfusion der endothelialen Röhre für ≥ 5 min vor der Aufnahme die Hintergrunddaten und Farbstoff laden.

(5) Farbstoff Last, auswaschen und Temperatureinstellungen

  1. Schalten Sie alle Komponenten des Systems zur Messung [Ca2 +]ichPhotometrie. Verwenden Sie das Mikroskop auf das experimentelle Rig (Abbildung 3), um das Endothel Rohr auf 400 X Vergrößerung und Fokus auf Zellen in der photometrischen Fenster mithilfe der Photometrie-System-Software-Suite anzuzeigen.
  2. Messen Sie den Durchmesser der endothelialen Röhre und zeichnen Sie Autofluoreszenz Hintergrundwerte in Übereinstimmung mit 510 nm Emission während Alternative Erregung bei 340 und 380 nm (≥10 Hz auf).
  3. [Ca2 +]ich Antworten zu messen, laden die endotheliale Röhre mit Fura-2 bin färben (10 µM Endkonzentration) bei RT und erlauben ~ 30 – 40 min in der Abwesenheit von Licht.
  4. Starten Sie Superfusion der endothelialen Röhre mit frischen PSS für ~ 30-40 min zum Auswaschen überschüssige Farbstoff und ermöglichen intrazellulären Fura-2, de-esterify bin. Während der Wash-Out-Zeit erhöhen Sie die Temperatur allmählich von RT auf 37 ° C mit dem Temperatur-Controller (Abbildung 3A) mit einer Inline-Heizung, dann bei 37 ° C während des Experiments beibehalten.
    Hinweis: Die empfohlene schrittweise Übergang zwischen RT auf 37 ° C umfasst drei Schritte (z. B. 5 ° C) mit einer ≥5 min Gleichgewichtherstellung Zeit bei jedem Schritt.

(6) die gleichzeitige Messung von [Ca2 +]Ich und Vm

  1. Schalten Sie alle anderen Geräte und die Elektrometer-Software-Suite für die Messung von Vm (siehe Abbildung 3, Abbildung 4). Erwerb der Datenrate entsprechend anpassen (≥10 Hz).
  2. Ziehen Sie eine scharfe Elektrode und Hinterfüllung mit 2 M KCl. Für Studien der interzellulären Kopplung der Mikroelektroden über Dye-Transfer, Hinterfüllung mit 0,1 % Propidium Jodid aufgelöst in 2 M KCl.
  3. Sichern Sie die Elektrode über ein Silberdraht mit Chlorid in der Pipette Halterung befestigt, Elektrometer Kopf frühzeitig gesichert mit einem Mikromanipulator beschichtet. Verwenden Sie die Mikromanipulator, um kurz die Spitze der Elektrode in die fließende PSS in der Kammer während der Anzeige durch das Objektiv 4 X position.
  4. Die ruhenden Vm auf 0 als konsistent mit geerdeten Badewanne potenzielle gesetzt. Position der Spitze der Elektrode nur über eine Zelle der endothelialen Röhre. Falls gewünscht, verwenden Sie akustische Grundlinie Monitoren verbunden mit Stromzähler, die möglichen Aufnahmen Tonhöhe zugeordnet.
  5. Erhöhen Sie Vergrößerung auf 400 x 40 X Objektiv mit und positionieren Sie die Spitze der Elektrode neu zu, je nach Bedarf. Passen Sie das photometrische Fenster mit der Photometrie Software auf ~ 50 bis 80 Endothelzellen konzentrieren.
  6. Sanft legen Sie die Elektrode in eine der Zellen der endothelialen Röhre mit dem Mikromanipulator und warten Sie ≥2 min für den ruhenden Vm zu stabilisieren. In ähnlicher Weise legen Sie eine zweite Elektrode in einer anderen Zelle (Entfernung ≥100 µm) aus der ersten Zelle mit ersten Elektrode aufgespießt.
  7. Sobald Ruhe Vm mit seiner erwarteten Werte stabil ist (-30 bis-40 mV)6, Einschalten der PMT auf der Fluoreszenz-Schnittstelle in der Abwesenheit von Licht und Erwerb von intrazellulären [Ca2 +]ich durch spannende Fura-2 abwechselnd beginnen (10 Hz) bei 340 und 380 nm beim Sammeln von Fluoreszenzemission bei 510 nm.
    Hinweis: Testen Sie interzelluläre elektrische Kopplung, aktuelle (± 0,5-3 nA, ~ 20 s Pulsdauer) als "Seite 1" über ein Elektrometer geliefert werden können, und Änderungen von Vm erfasst werden, mit einem anderen Elektrometer als "Seite 2" (Entfernung ≥100 µm).
  8. Nachdem simultane Messungen Vm und [Ca2 +]ich eingerichtet wurden, können Sie ~ 5 min für die Superfusion der endothelialen Rohr mit PSS mit einer konstanten Laminar-Flow-Rate vor der Anwendung von Medikamenten.
  9. Wenden Sie das Medikament (z. B. ATP) an die superfusion Kammer mit konstantem Volumenstrom in PSS vorbereitet. Nach ca. 3 min (oder einen Zeitraum für die Kinetik des Medikaments) zurück waschen mit PSS bis Vm und F340/f380 Verhältnis an ihrer Grundlinie Bedingungen. Markieren Sie jeweiligen Aufnahmen als zeitlich synchronisierte über die Photometer und Elektrometer Software-Suiten, bei jedem Übergang von Lösungen.
  10. Sobald das Experiment geschehen ist, die Zelle mit dem Mikromanipulator Elektrode entziehen und bemerken Vm ~ 0 mV wie referenziert durch die Bad-Elektrode. Stoppen Sie jeweiligen Aufnahmen von Vm und [Ca2 +]ich und speichern Sie die Datensätze auf Datei für die Datenanalyse.

(7) Visualisierung von Zelle zu Zelle Kupplung

  1. Zell-Zell-Kopplung über Propidium Jodid zu visualisieren, verwenden Sie ein 40 X oder 60 X fluoreszierende Ziel mit ein relativ hoher numerischer Apertur (z. B. 0,95) und Rhodamin Filtersatz mit Solid-State-Beleuchtung, eine hochauflösende Kamera (z. B. 16- Megapixel) und eine imaging-Software-Suite.

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Representative Results

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Die schematische Demonstration des oben beschriebenen Protokolls ist in den beigefügten Abbildungen gezeigt. Abbildung 1Azeigt eine Gehirn von einem jungen Erwachsenen männlichen C57BL/6N Maus (5 Monate) isoliert. Hintere Hirnarterien sind sorgfältig isoliert aus dem Kreis von Willis, ohne Bindegewebe entfernt, und schneiden Sie in Segmente (Abbildung 1 b-D). Aus teilweise verdaute arteriellen Segmente das intakte Endothel Rohr hergestellt und auf das Glas-Deckglas mit pinning Pipetten gesichert. Sanfte mechanische Dehnung wird mit zwei pinning Pipetten, lineare in-vivo Länge ohne Schiff Schlängelung ungefähre aufgetragen. Dies ist weiter in der Handschrift (Abbildung 2A-D) geklärt. Endotheliale Rohre isoliert vom hinteren Hirnarterien sind ca. 90 – 100 µm in Breite und ≥300 µm in der Länge. Das Rohr ist vollgepackt mit Fura-2 durch Auswaschen mit PSS gefolgt bin. Gleichzeitige Messung von [Ca2 +]ich und Vm in der endothelialen Röhre erfolgt durch Ca2 + Photometrie als auch scharfe Elektrode Elektrophysiologie (experimentelle Rig, dargestellt in Abbildung 3 und Abbildung 4).

Funktionelle Beurteilung der endothelialen Röhre erfolgt durch einen klassischen endotheliale GPCR-Agonisten wie ATP in den Strömungsraum unter physiologischen Bedingungen anwenden. Wie in Abbildung 5gezeigt, [Ca2 +]ich und Vm erfasst gleichzeitig als Reaktion auf ATP (100 µM). Eine bedeutende Hyperpolarisation von Vm (≥5 mV) tritt begleitend mit einem intrazellulären [Ca2 +]ich Anstieg, darauf hinweist, dass ein Anstieg der [Ca2 +]ich SKCa/IK aktiviertCa -Kanäle und ermöglicht damit K+ Ausfluss in der Plasmamembran, EDH zu produzieren. Nachweis der interzellulären Kopplung mit Strominjektion (± 0,5 bis 3 nA, ~ 20 s-Pulse) finden Sie in unserer kürzlich veröffentlichten Arbeit (Referenz6, Abbildung 1). Beachten Sie, dass diese Propidium Jodid hat eine Masse von ~ 668 Da in Bezug auf sekundäre Botenstoffe, die für die Übergabe durch Gap Junctions wie Inositol-Trisphosphate (IP3, ~ 420 Da), zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP, Da ~ 329) bekannt.

Figure 1
Abbildung 1 : Isolierung der zerebralen Arterie aus Gehirn. (A) Gehirn isoliert mit intakten Arterien (weißer Pfeil zeigt die hintere zerebrale Arterie) in Dessection Lösung. (B) Magnified Anzeigen der hinteren zerebralen Arterie (weißer Pfeil; ~ 3 X Vs. A Panel). (C) isolierte hinteren Hirnarterien mit Edelstahlstiften in Probe Schale gesichert. (D) hinteren Hirnarterien nach Entfernung des Bindegewebes. Sehen Sie geschnittene Segmente der Arterien; Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vorbereitung der zerebralen Endothelzellen Rohr. (A) Ausrüstung für die teilweise verdaute arteriellen Segmente verreiben; ein = Mikromanipulator, b = Kammer für die Zubereitung von Rohr, C = Aluminium-Stufe, d = Microsyringe, e = Mikroskop, f = Microsyringe Pumpensteuerung. (B) arterielle Segmenten (weisse Pfeile) Lösung für die enzymatische Verdauung. (C) Endothelzellen Röhren durch Verreibung vorbereitet; eine Verreibung = Pipette, b = intakte Endothel Rohr. Sehen Sie die Verreibung Prozess Adventitia und glatten Muskelzellen zu entfernen; Maßstabsleiste = 100 µm. (D) eine intakte Endothel Rohr gesichert auf das Glas-Deckglas mit pinning Pipette; ein = anheften Pipette, b = intakte Endothel Rohr mit Durchmesser von ca. 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Ausrüstung für die superfusion und gleichzeitige [Ca2 +[ ] Ich und V m Messungen. (A) Ausrüstung für die Superfusion von endothelialen Rohr und Temperaturregelung, ein = hohen Intensität Bogenlampe Stromversorgung b Fluoreszenz Systemschnittstelle, C = = Temperaturregler, d = 6-Stauseen der superfusion System e = Fiber optic Light Quellen, f = Stellungsregler, g = Hyperswitch [Ca2 +]ich Photometrie Systems. (B) Superfusion Kammer Apparate; ein und b = Headstages, C = Masseelektrode, d = Inline Heizung, e = superfusion Schlauch, f = Vakuum Saug, g superfusion Kammer, h = = Aluminium Stufe hält die Kammer. (C) experimentelle Plattform auf einem Rütteltisch Isolierung; ein = Zelle Rahmung Adapter mit Kamera, b = Mikroskop Licht, c Mikroskop, d = = Aluminium Stufe e = Mikromanipulator zur Headstage Steuerung, f = Isolierung Vibrationstisch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Ausrüstung für den Betrieb von Elektrophysiologie und Datenaufzeichnung. ein = Oszilloskop, b = Funktionsgenerator, C = akustische Grundlinie Monitor, d = 50/60 Hz Rauschfilter, e und f = Stromzähler, g = Datenerfassungssystem. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Gleichzeitige [Ca2 +[ ] Ich und V m Aufnahmen. (A) Differential Interferenz-Kontrast Bild (400 X) einer Maus zerebralen arteriellen endothelial Röhre für Experiment in photometrischen Fenster mit einem 40 X Objektiv angepasst. Eine scharfe Elektrode wird in einer Zelle platziert, wie gezeigt an der Spitze des Bildes (weißer Pfeil). (B) Raw Spuren für die gleichzeitige Messung von F340/f380 Verhältnis (oben) und Vm (unten) als Reaktion auf ATP (100 µM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Angesichts der jüngsten Entwicklungen6,15,16,17zeigen wir nun die Methode zur Isolierung Maus zerebralen arteriellen Endothel in Vorbereitung für die gleichzeitige Messung von [Ca2 +] i und Vm zugrunde liegenden EDH konsequent für ~ 2 h bei 37 ° C. Obwohl es technisch schwierig ist, messen wir Zell-zu-Zell-Kupplung sowie (siehe Referenz6, Abbildung 1). Auf diese Weise können wir diskret und durchgeführten Veranstaltungen gleichzeitig Signale messen. Einen Überblick über die allgemeine Herausforderungen beim isolieren Maus arteriellen Endothel finden Sie Referenzen11,12. Wir legen Wert auf wichtige Schritte für die Isolierung von Maus Hirnarterien, unsere besonderen Messungen von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm, Vorschläge zur Fehlerbehebung und Überlegungen zu alternativen Methoden auf der Grundlage von experimentelle Stärken/Schwächen unten.

Die hintere zerebrale Arterie erfordert die sorgfältige Isolierung aus dem Kreis von Willis und Bindegewebe ohne Beschädigung, glatte Muskelzellen und Endothelzellen. Chirurgische Instrumente (Zangen und Scheren) sollte für Maus Mikrozirkulation Dissektion Verfahren beibehalten, mit sauberen, scharfen Kanten geeignet. Im Vergleich mit skelettartigen Muskel12, wir den Zeitraum für die enzymatische Inkubation von zwei Drittel und die Konzentrationen von Papain, Kollagenase und Dithioerythritol um die Hälfte reduziert beim Einsatz einer empirisch optimierten Konzentration der Elastase hinzufügen. Für gleich bleibenden Erfolg zerebralen arteriellen endothelial Rohre zu isolieren ist es wichtig auf Bestellung Enzyme in den Reihen (2 bis 4 Fläschchen) von einem renommierten Hersteller mit konsistenten Herstellungspraxis in Übereinstimmung mit der Häufigkeit der Verwendung und Haltbarkeit. Sogar mit dem Potential für Variation der Enzym-Aktivität aus einer Menge von Enzym zum nächsten wird vorgeschlagen, Enzymkonzentrationen beibehalten werden, bei gleichzeitiger Optimierung der Zeit der Verdauung innerhalb von 10 bis 12 Minuten. Es ist erwähnenswert, dass weder das Geschlecht noch Alter des Tieres (3 bis 30 Monate) ein erhebliches Hindernis zur Vorbereitung des isolierten Endothel von Hirnarterien in unsere Erfahrung gewesen ist. Daher empfiehlt es sich, dass die Zusammensetzung des Enzyms cocktail und Zeit der Enzym-Verdauung in Studien auf Alter und Geschlecht unverändert.

Wie betont wird, ist Vorsicht geboten bei sanften Verreibung und Isolierung von dem Endothel von Adventitia und glatten Muskelzellen spindelförmig zur Vermeidung von Schäden an Endothelzellen12. Verreibung Schritt dient die Viskose Mineralöl als hydraulische Medium zwischen den Kolben der Mikro-Spritze und die wässrige PSS um zurückzuziehen oder Auswerfen Schiff Segmente in PSS gebadet. Es sei darauf hingewiesen, dass wenn das Schiff-Segment das Mineralöl kontaktiert, dieser Schritt muss wiederholt werden mit einer sauberen Verreibung Pipette mit sequentiellen Verfüllung von Mineralöl und PSS. Bevor ein Experiment empfiehlt es sich, dass eine etwa linear in Vivo -Länge der endothelialen Röhre soweit möglich, wiederhergestellt werden wobei einzelne Zellen eine "flache", längs Morphologie (z. B. Durchmesser ~ 5 µm, Länge ca. 100 µm übernehmen; Dicke ~0.5 µm)8. Jedoch sollten Axialspannung nicht angewendet werden, in dem Maße, wo Zellen an den Rändern der Probe Weg von unter jeweiligen pinning Pipetten und damit kompromittierende mechanische Stabilität für zuverlässige zellulären Messungen während ziehen, der Experimentieren Sie.

Die photometrische [Ca2 +]ich Mess-System verwendet, bei dieser Technik eignet sich für kontinuierliche Messungen von Endothelzellen [Ca2 +]i mit ratiometrischen Farbstoff Fura-2. Einzelne Protokolle können in der Regel ≥10 min. ohne signifikante Immunofluoreszenz dauern. Darüber hinaus verwenden wir häufig dieses Ansatzes zur Messung [Ca2 +]ich , denn es ist offen für rechtzeitige Pausen in der Datenerfassung und häufige Bewegung der Mikroskop-Ziele nach Bedarf scharfe Elektroden für Vm Messungen zu sichern. Beachten Sie, dass dies eine photometrische Ansatz, der nimmt nur global gemittelt [Ca2 +]ich unter mehreren Zellen. In der Regel für [Ca2 +]ich Messungen empfehlen wir Photometrie für die erste Charakterisierung von Endothelzellen Antworten auf pharmakologische Wirkstoffe (z.B., zeitlicher Verlauf der Peak und Plateau Phasen) gleichzeitig sichern will fahren Sie mit quantitate Microdomain Signalisierung Ereignisse mithilfe von standard multiphoton oder konfokalen Mikroskopie12,23.

Der scharfe Elektrode Elektrophysiologie Ansatz ist zugänglich für integrierte Vm Aufnahmen im physiologischen mehrzelligen Vorbereitungen. Die Messung der intrazellulären Vm ist bei weitem die technisch anspruchsvolle mit zahlreichen kritischen Schritte, die zu erleichtern oder Erfolg der Messungen zu verwischen. Als erstes muss der Experimentator bestimmen, die optimale Programmbedingungen auf ein Glas Abzieher für die Herstellung von Spitzer Elektroden mit einem Tipp-Widerstand von ~ 150 ± 30 konsequent MΩ. Ein Filament Rampe Hitzetest lesen als Referenz verwenden, empfiehlt sich der Experimentator Parameter empirisch bestimmen, insbesondere im Hinblick auf Unterschiede in der Einstellung "Heat" bei gleichzeitiger Maximierung der Zeit ziehen. Nächste, mechanische Stabilität der Mikromanipulatoren, Headstages, Pipette Inhaber und Probe ist absolut entscheidend. Abgesehen von der offensichtlichen Notwendigkeit für eine Isolierung Vibrationstisch müssen der Experimentator sicherstellen, dass alle Armaturen sicher sind und der Bühnenbereich rund um und unter die Manipulatoren sauber ist. Im Idealfall überflüssige Lärm reduziert werden sollte, die Auflösung der Aufnahmen scharf Elektrode innerhalb von 1 ist mV. Nach unserer Erfahrung ist die häufigste Ursache des Geräuschs Silberdraht in der Pipette-Inhaber, der Notwendigkeit einer ausreichenden Chlorid-Beschichtung oder Ersatz insgesamt ist gesichert. Wenn gemeinsame 50/60 Hz-Rauschen vorhanden ist, "hum-Stummschaltung" Technologie eingesetzt werden und ist serienmäßig mit einem modernen Elektrometer. Wenn Lärm völlig unüberschaubar erscheint, überprüfen Sie, ob gibt es ein Leck in der Badewanne oder Überlauf PSS in Kontakt mit Widerständen zur Temperaturregelung kommen. Wenn Komplikationen bleiben mit dem Erwerb von eine stabile V-m -Signal, überprüfen Sie die Integrität der elektrischen Leitungen und t-Stücke.

Insgesamt ist, wenn die Einrichtung eine scharfen Elektrode Aufnahme fehlgeschlagen ist, es häufig aufgrund einer ungeeigneten Elektrode, mechanische Instabilität oder schlechte zelluläre Gesundheit. Alternativ kann der Experimentator wollen auch eine Konfiguration der Patch-Clamp-Technik auf einzelne, elektrisch abgekoppelt Zellen prüfen, wo Informationen über die ganze Zelle Strömungen und einzelne Ionen-Kanal Aufnahmen erhalten werden können. Obwohl vor der allgemeinen Herausforderungen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. heterogene intrazellulären be-, , Bleichen, Kalibrierung mit Ionophores, bescheidenen Auflösung) Farbstoffe Spannung-empfindlichen wie Di-8-ANEPPS sind auch im Handel erhältlich.

Unser Verständnis von dem Endothel in Blut Durchflussregulierung, und im gesamten Gehirn ist von entscheidender Bedeutung, mit einer rasch alternden Bevölkerung und der steigenden Inzidenz von chronischen Herz-Kreislauf- und Neurodegenerative Erkrankungen. So bieten wir eine Methode zur Isolierung von intakten Endothelium von einem zerebralen Lebensader, die an anderen vaskulären Strukturen im Gehirn angepasst werden kann. Darüber hinaus zeigen wir einen sinnvoller Ansatz für die gleichzeitige Messung von zugrunde liegenden [Ca2 +]ich und Vm. Zu guter Letzt kann Zell-zu-Zell-Kupplung durch Gap Junctions mit dual intrazellulären Elektroden, auch bewertet werden. Mit sorgfältig geplanten pharmakologische und/oder genetische Interventionen umfasst das aktuelle Protokoll einigermaßen und quantitativ Untersuchung der zerebralen Endothelfunktion in gediegener Form. Unsere Erwartung ist, dass die Experimentatoren bauen aus und passen diese Informationen, um die vaskuläre Biologie und Neurowissenschaften im Allgemeinen zu fördern. Insbesondere wäre es befriedigend zu sehen, gemeinsame experimentellen Schwierigkeiten mit elektrischen Messungen insgesamt minimiert. Dieses Protokoll ist, zwar keine Stand-alone-Reihe von Techniken mit allen Mitteln einsetzbar als komplementären Ansatz zu bestimmen, genau wie endotheliale biophysikalische Determinanten übersetzen Änderungen in Gefäßwiderstand und wie sie Verordnung anpassen des Blutflusses im Vergleich zu Bedingungen, die repräsentativ für Gesundheit Vs. Krankheit.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Charles Hewitt für ausgezeichnete technische Unterstützung beim Aufbau, Ausrüstung und Zubehör für die aktuellen Protokolle erforderlich. Wir danken Dr. Sean M. Wilson und Christopher G. Wilson aus dem ETA-Zentrum für perinatale Biologie, für die uns mit einer zusätzlichen inversen Mikroskop und Elektrometer, bzw.. Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant R00-AG047198 (EJB) und Loma Linda University School of Medicine neue Fakultät für Start-up-Fonds unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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