हौसले से अलग और बरकरार माउस सेरेब्रल Endothelium में Intracellular कैल्शियम और झिल्ली क्षमता का एक साथ माप
Summary
यहां का प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल है (1) हौसले से अलग बरकरार सेरेब्रल endothelial “ट्यूबों” और (2) endothelium के दौरान endothelial कैल्शियम और झिल्ली की क्षमता का एक साथ माप-hyperpolarization व्युत्पंन । इसके अलावा, इन तरीकों endothelial कोशिका कैल्शियम और व्यक्तिगत या इंटरैक्टिव प्रयोगात्मक चर के रूप में विद्युत संकेतन के औषधीय ट्यूनिंग के लिए अनुमति देते हैं ।
Abstract
सेरेब्रल धमनियों और उनके संबंधित microcirculation रक्त प्रवाह विनियमन के माध्यम से मस्तिष्क को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों उद्धार । Endothelial कोशिकाओं को ंयूरॉंस की चयापचय मांग को पूरा करने की जरूरत के रूप में रक्त वाहिकाओं और संवहनी व्यास में परिवर्तन कमान के लुमेन लाइन । झिल्ली की क्षमता (वीएम) और नाइट्रिक ऑक्साइड के hyperpolarization के प्राथमिक endothelial-निर्भर सिग्नलिंग मार्ग आमतौर पर मध्यस्थता vasodilation के समानांतर काम करते हैं और इससे रक्त प्रवाह में वृद्धि होती है । हालांकि संवहनी लंबाई के कई मिलीमीटर से अधिक vasodilation समंवय करने के लिए अभिंन, endothelium के घटकों-व्युत्पंन hyperpolarization (एध) ऐतिहासिक उपाय करने के लिए मुश्किल हो गया है । इन घटकों के एध हय intracellular ca2 + [ca2 +]मैं बढ़ाता है और छोटे और मध्यवर्ती कंडक्टर ca2 +-सक्रिय K+ (SKca/IKca) चैनल के बाद सक्रियण ।
यहां, हम माउस मस्तिष्क धमनियों से ताजा endothelium के अलगाव का एक सरलीकृत चित्रण प्रस्तुत; endothelial के एक साथ माप [सीए2 +]मैं और वीएम फ्रा का उपयोग-2 photometry और intracellular तेज इलेक्ट्रोड, क्रमशः; और एक सतत superfusion नमक समाधान और औषधीय एजेंटों के तहत शारीरिक स्थितियों (पीएच ७.४, ३७ डिग्री सेल्सियस) । विलिस के चक्र से पीछे मस्तिष्क धमनियों के पीछे संचार और basilar धमनियों से मुक्त हटा रहे हैं । एंजाइमी के पाचन साफ पीछे मस्तिष्क धमनी क्षेत्रों और बाद में trituration adventitia, perivascular नसों, और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को हटाने की सुविधा । परिणामस्वरूप पीछे मस्तिष्क धमनी endothelial “ट्यूबों” तो एक खुर्दबीन के नीचे सुरक्षित और एक कैमरा, photomultiplier ट्यूब का उपयोग कर जांच कर रहे हैं, और एक दो electrometers जबकि सतत superfusion के तहत । सामूहिक रूप से, इस विधि एक साथ endothelial में परिवर्तन का उपाय कर सकते है [Ca2 +]मैं और असतत सेलुलर स्थानों में वीएम , गैप जंक्शनों के माध्यम से एध के प्रसार के अलावा मिलीमीटर दूरी तक बरकरार endothelium. इस पद्धति के लिए एक उच्च मस्तिष्क endothelial कार्यों का प्रवाह विश्लेषण सामांय और रोगग्रस्त मस्तिष्क में रक्त प्रवाह विनियमन के तंत्र अंतर्निहित उपज की उंमीद है ।
Introduction
मस्तिष्क भर में रक्त प्रवाह मस्तिष्क धमनियों और संवहनी नेटवर्क में धमनियों के बीच vasodilation के समन्वय द्वारा विनियमित है1. Endothelial कोशिकाओं मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों अस्तर संवहनी व्यास में परिवर्तन के रूप में न्यूरॉन्स1,2,3की चयापचय की मांग को पूरा करने के लिए आवश्यक. विशेष रूप से, endothelium-व्युत्पन्न hyperpolarization के दौरान (सामान्यतः एध के रूप में जाना जाता है), intracellular ca2 + ([ca2 +]i) और endothelial कोशिकाओं में विद्युत सिग्नलिंग vasodilation कोशिकाओं के बीच endothelial निर्देशांक और उनके धमनी विश्राम के लिए गैप जंक्शनों के माध्यम से चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के आसपास4. एध की शारीरिक दीक्षा क्रमिक रूप से जीक्यूकी उत्तेजना को जरूरत पर जोर देती रिसेप्टर्स (GPCRs), में वृद्धि [Ca2 +]मैं, और सक्रियण के endothelial छोटे और मध्यवर्ती-Ca2 +-सक्रिय कश्मीर+ (एसकेसीए/IKसीए) चैनलों को hyperpolarize सेरेब्रल endothelial झिल्ली क्षमता (वीएम)5,6,7. इस प्रकार, endothelial के अंतरंग संबंध [सीए2 +]मैं और वीएम रक्त प्रवाह विनियमन और कार्डियो करने के लिए अपरिहार्य के लिए अभिंन है-और मस्तिष्कवाहिकीय समारोह6,8। व्यापक साहित्य के दौरान, कई अध्ययनों पुराने रोगों के विकास के साथ संवहनी endothelial रोग के संघ की सूचना दी है (जैसे, उच्च रक्तचाप, मधुमेह, दिल की विफलता, कोरोनरी धमनी की बीमारी, क्रोनिक गुर्दे की विफलता, परिधीय धमनी रोग)9,10, शारीरिक रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग की स्थिति में endothelial समारोह का अध्ययन करने के महत्व का संकेत.
संवहनी endothelium hyperpolarization, vasodilation, और ऊतक छिड़काव के उत्पादन का अभिंन अंग है और इस प्रकार, इसकी देशी सेलुलर संपत्तियों की परीक्षा महत्वपूर्ण है । एक सामांय अध्ययन मॉडल के रूप में, माउस धमनी endothelial ट्यूब मॉडल की तैयारी कंकाल की मांसपेशी11,12,13आंत,14फेफड़ों के लिए, और हाल ही में मस्तिष्क6के लिए प्रकाशित किया गया है । एक साथ के अध्ययन [सीए2 +]मैं औरवी एम माप विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशी धमनी endothelium15,16 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लसीका पोत endothelium17के लिए प्रकाशित किया गया है । प्राथमिक endothelial ट्यूब दृष्टिकोण, अपने फायदे और नुकसान8 के एक व्यापक समीक्षा का उपयोग अध्ययन के अलावा अगर इस प्रायोगिक उपकरण एक विशिष्ट अध्ययन के लिए उपयुक्त है यह निर्धारित करने के लिए परामर्श किया जा सकता है । संक्षेप में, एक लाभ यह है कि endothelial कोशिका समारोह के प्रमुख शारीरिक घटकों (जैसे, Ca2 + आमद और intracellular रिलीज, hyperpolarization वीएम के ताकि नेर्ंस्ट क्षमता के लिए कश्मीर के लिए बनाए रखे जाते है वाया एसकेसीए/IKसीए सक्रियण, और गैप जंक्शनों के माध्यम से endothelial सेलुलर युग्मन) ऐसे perivascular तंत्रिका इनपुट, चिकनी मांसपेशी वोल्टेज-gated चैनल समारोह और सिकुड़ना के रूप में कारकों की स्थापना के बिना, रक्त परिसंचरण, और हार्मोनल प्रभाव8. इसके विपरीत, आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल संस्कृति के दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण परिवर्तन आकृति विज्ञान18 और आयन चैनल अभिव्यक्ति19 में एक तरह से है कि बहुत शारीरिक टिप्पणियों के लिए तुलना गड़बड़ाने कर सकते हैं निर्धारित पूर्व vivo या vivo में । सीमाएं इस तरह के एक प्रयोगात्मक अनुसूची में चिकनी मांसपेशी और प्रतिबंधित लचीलापन के रूप में रक्त के प्रवाह को विनियमित करने के लिए अन्य आवश्यक घटकों के साथ एकीकरण की कमी है, के रूप में इस मॉडल बेहतर बरकरार संवहनी खंड अलगाव के 4 एच के भीतर परीक्षण किया जाता है पशु से ।
एक पिछले वीडियो Socha और12 सहगल और हाल ही में प्रयोगात्मक विकास द्वारा लिखित प्रोटोकॉल से अंतरिम6,15,16में बिल्डिंग, हम इसके द्वारा ताजा endothelium के अलगाव का प्रदर्शन पीछे सेरेब्रल धमनियों और endothelial के एक साथ माप [सीए2 +]मैं और वीएम फ्रा का उपयोग-2 photometry और intracellular तेज इलेक्ट्रोड, क्रमशः. इसके अतिरिक्त, यह प्रयोग नमक समाधान और औषधीय एजेंटों की शारीरिक स्थितियों (पीएच ७.४, ३७ डिग्री सेल्सियस) के दौरान सतत superfusion पर जोर देता है । हम पीछे मस्तिष्क धमनी चुना, के रूप में यह संरचनात्मक अखंडता (गैप जंक्शनों के माध्यम से युग्मित कोशिकाओं) और पर्याप्त आयामों (चौड़ाई ≥ ५० µm, लंबाई ≥ ३०० µm) के साथ अलग endothelium पैदावार अंतर के लिए उत्तरदायी और सेलुलर के साथ संकेतन और बीच में endothelial कक्ष । इसके अलावा, कुतर पीछे सेरेब्रल धमनी के अध्ययन में काफी साहित्य में प्रतिनिधित्व कर रहे है और मौलिक endothelial संकेत तंत्र के शामिल परीक्षा, संवहनी विकास/ 21 , 22. इस प्रायोगिक आवेदन के लिए एक उच्च मस्तिष्क endothelial समारोह का प्रवाह विश्लेषण उपज की उंमीद है (और शिथिलता) और इस तरह भर में रक्त प्रवाह विनियमन की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अनुमति देगा एजिंग और neurodegenerative रोग के विकास ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल की घटनाओं के प्रकाश में6,15,16,17, अब हम विधि को अलग करने के लिए माउस मस्तिष्क धमनी endothelium की तैयारी में एक साथ माप के लिए [Ca2 +] मैं और वीएम अंतर्निह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए चार्ल्स हेविट धंयवाद जबकि उपकरणों की स्थापना और वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक आपूर्ति । हम एक अतिरिक्त औंधा माइक्रोस्कोप और electrometer, क्रमशः के साथ हमें प्रदान करने के लिए डीआरएस. शॉन एम विल्सन और क्रिस्टोफर जी विल्सन, प्रसवकालीन जीव विज्ञान के लिए LLU केंद्र से, धन्यवाद । इस शोध में नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट R00-AG047198 (EJB) और लोमा लिंडा यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के नए फैकल्टी स्टार्ट-अप फंड का सपोर्ट किया गया है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
References
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
- Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
- Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
- Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
- Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
- Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
- Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
- Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
- Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
- Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).
