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Biology

हौसले से अलग और बरकरार माउस सेरेब्रल Endothelium में Intracellular कैल्शियम और झिल्ली क्षमता का एक साथ माप

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

यहां का प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल है (1) हौसले से अलग बरकरार सेरेब्रल endothelial "ट्यूबों" और (2) endothelium के दौरान endothelial कैल्शियम और झिल्ली की क्षमता का एक साथ माप-hyperpolarization व्युत्पंन । इसके अलावा, इन तरीकों endothelial कोशिका कैल्शियम और व्यक्तिगत या इंटरैक्टिव प्रयोगात्मक चर के रूप में विद्युत संकेतन के औषधीय ट्यूनिंग के लिए अनुमति देते हैं ।

Abstract

सेरेब्रल धमनियों और उनके संबंधित microcirculation रक्त प्रवाह विनियमन के माध्यम से मस्तिष्क को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों उद्धार । Endothelial कोशिकाओं को ंयूरॉंस की चयापचय मांग को पूरा करने की जरूरत के रूप में रक्त वाहिकाओं और संवहनी व्यास में परिवर्तन कमान के लुमेन लाइन । झिल्ली की क्षमता (वीएम) और नाइट्रिक ऑक्साइड के hyperpolarization के प्राथमिक endothelial-निर्भर सिग्नलिंग मार्ग आमतौर पर मध्यस्थता vasodilation के समानांतर काम करते हैं और इससे रक्त प्रवाह में वृद्धि होती है । हालांकि संवहनी लंबाई के कई मिलीमीटर से अधिक vasodilation समंवय करने के लिए अभिंन, endothelium के घटकों-व्युत्पंन hyperpolarization (एध) ऐतिहासिक उपाय करने के लिए मुश्किल हो गया है । इन घटकों के एध हय intracellular ca2 + [ca2 +]मैं बढ़ाता है और छोटे और मध्यवर्ती कंडक्टर ca2 +-सक्रिय K+ (SKca/IKca) चैनल के बाद सक्रियण ।

यहां, हम माउस मस्तिष्क धमनियों से ताजा endothelium के अलगाव का एक सरलीकृत चित्रण प्रस्तुत; endothelial के एक साथ माप [सीए2 +]मैं और वीएम फ्रा का उपयोग-2 photometry और intracellular तेज इलेक्ट्रोड, क्रमशः; और एक सतत superfusion नमक समाधान और औषधीय एजेंटों के तहत शारीरिक स्थितियों (पीएच ७.४, ३७ डिग्री सेल्सियस) । विलिस के चक्र से पीछे मस्तिष्क धमनियों के पीछे संचार और basilar धमनियों से मुक्त हटा रहे हैं । एंजाइमी के पाचन साफ पीछे मस्तिष्क धमनी क्षेत्रों और बाद में trituration adventitia, perivascular नसों, और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को हटाने की सुविधा । परिणामस्वरूप पीछे मस्तिष्क धमनी endothelial "ट्यूबों" तो एक खुर्दबीन के नीचे सुरक्षित और एक कैमरा, photomultiplier ट्यूब का उपयोग कर जांच कर रहे हैं, और एक दो electrometers जबकि सतत superfusion के तहत । सामूहिक रूप से, इस विधि एक साथ endothelial में परिवर्तन का उपाय कर सकते है [Ca2 +]मैं और असतत सेलुलर स्थानों में वीएम , गैप जंक्शनों के माध्यम से एध के प्रसार के अलावा मिलीमीटर दूरी तक बरकरार endothelium. इस पद्धति के लिए एक उच्च मस्तिष्क endothelial कार्यों का प्रवाह विश्लेषण सामांय और रोगग्रस्त मस्तिष्क में रक्त प्रवाह विनियमन के तंत्र अंतर्निहित उपज की उंमीद है ।

Introduction

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मस्तिष्क भर में रक्त प्रवाह मस्तिष्क धमनियों और संवहनी नेटवर्क में धमनियों के बीच vasodilation के समन्वय द्वारा विनियमित है1. Endothelial कोशिकाओं मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों अस्तर संवहनी व्यास में परिवर्तन के रूप में न्यूरॉन्स1,2,3की चयापचय की मांग को पूरा करने के लिए आवश्यक. विशेष रूप से, endothelium-व्युत्पन्न hyperpolarization के दौरान (सामान्यतः एध के रूप में जाना जाता है), intracellular ca2 + ([ca2 +]i) और endothelial कोशिकाओं में विद्युत सिग्नलिंग vasodilation कोशिकाओं के बीच endothelial निर्देशांक और उनके धमनी विश्राम के लिए गैप जंक्शनों के माध्यम से चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के आसपास4. एध की शारीरिक दीक्षा क्रमिक रूप से जीक्यूकी उत्तेजना को जरूरत पर जोर देती रिसेप्टर्स (GPCRs), में वृद्धि [Ca2 +]मैं, और सक्रियण के endothelial छोटे और मध्यवर्ती-Ca2 +-सक्रिय कश्मीर+ (एसकेसीए/IKसीए) चैनलों को hyperpolarize सेरेब्रल endothelial झिल्ली क्षमता (वीएम)5,6,7. इस प्रकार, endothelial के अंतरंग संबंध [सीए2 +]मैं और वीएम रक्त प्रवाह विनियमन और कार्डियो करने के लिए अपरिहार्य के लिए अभिंन है-और मस्तिष्कवाहिकीय समारोह6,8। व्यापक साहित्य के दौरान, कई अध्ययनों पुराने रोगों के विकास के साथ संवहनी endothelial रोग के संघ की सूचना दी है (जैसे, उच्च रक्तचाप, मधुमेह, दिल की विफलता, कोरोनरी धमनी की बीमारी, क्रोनिक गुर्दे की विफलता, परिधीय धमनी रोग)9,10, शारीरिक रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग की स्थिति में endothelial समारोह का अध्ययन करने के महत्व का संकेत.

संवहनी endothelium hyperpolarization, vasodilation, और ऊतक छिड़काव के उत्पादन का अभिंन अंग है और इस प्रकार, इसकी देशी सेलुलर संपत्तियों की परीक्षा महत्वपूर्ण है । एक सामांय अध्ययन मॉडल के रूप में, माउस धमनी endothelial ट्यूब मॉडल की तैयारी कंकाल की मांसपेशी11,12,13आंत,14फेफड़ों के लिए, और हाल ही में मस्तिष्क6के लिए प्रकाशित किया गया है । एक साथ के अध्ययन [सीए2 +]मैं औरवी एम माप विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशी धमनी endothelium15,16 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लसीका पोत endothelium17के लिए प्रकाशित किया गया है । प्राथमिक endothelial ट्यूब दृष्टिकोण, अपने फायदे और नुकसान8 के एक व्यापक समीक्षा का उपयोग अध्ययन के अलावा अगर इस प्रायोगिक उपकरण एक विशिष्ट अध्ययन के लिए उपयुक्त है यह निर्धारित करने के लिए परामर्श किया जा सकता है । संक्षेप में, एक लाभ यह है कि endothelial कोशिका समारोह के प्रमुख शारीरिक घटकों (जैसे, Ca2 + आमद और intracellular रिलीज, hyperpolarization वीएम के ताकि नेर्ंस्ट क्षमता के लिए कश्मीर के लिए बनाए रखे जाते है वाया एसकेसीए/IKसीए सक्रियण, और गैप जंक्शनों के माध्यम से endothelial सेलुलर युग्मन) ऐसे perivascular तंत्रिका इनपुट, चिकनी मांसपेशी वोल्टेज-gated चैनल समारोह और सिकुड़ना के रूप में कारकों की स्थापना के बिना, रक्त परिसंचरण, और हार्मोनल प्रभाव8. इसके विपरीत, आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल संस्कृति के दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण परिवर्तन आकृति विज्ञान18 और आयन चैनल अभिव्यक्ति19 में एक तरह से है कि बहुत शारीरिक टिप्पणियों के लिए तुलना गड़बड़ाने कर सकते हैं निर्धारित पूर्व vivo या vivo में । सीमाएं इस तरह के एक प्रयोगात्मक अनुसूची में चिकनी मांसपेशी और प्रतिबंधित लचीलापन के रूप में रक्त के प्रवाह को विनियमित करने के लिए अन्य आवश्यक घटकों के साथ एकीकरण की कमी है, के रूप में इस मॉडल बेहतर बरकरार संवहनी खंड अलगाव के 4 एच के भीतर परीक्षण किया जाता है पशु से ।

एक पिछले वीडियो Socha और12 सहगल और हाल ही में प्रयोगात्मक विकास द्वारा लिखित प्रोटोकॉल से अंतरिम6,15,16में बिल्डिंग, हम इसके द्वारा ताजा endothelium के अलगाव का प्रदर्शन पीछे सेरेब्रल धमनियों और endothelial के एक साथ माप [सीए2 +]मैं और वीएम फ्रा का उपयोग-2 photometry और intracellular तेज इलेक्ट्रोड, क्रमशः. इसके अतिरिक्त, यह प्रयोग नमक समाधान और औषधीय एजेंटों की शारीरिक स्थितियों (पीएच ७.४, ३७ डिग्री सेल्सियस) के दौरान सतत superfusion पर जोर देता है । हम पीछे मस्तिष्क धमनी चुना, के रूप में यह संरचनात्मक अखंडता (गैप जंक्शनों के माध्यम से युग्मित कोशिकाओं) और पर्याप्त आयामों (चौड़ाई ≥ ५० µm, लंबाई ≥ ३०० µm) के साथ अलग endothelium पैदावार अंतर के लिए उत्तरदायी और सेलुलर के साथ संकेतन और बीच में endothelial कक्ष । इसके अलावा, कुतर पीछे सेरेब्रल धमनी के अध्ययन में काफी साहित्य में प्रतिनिधित्व कर रहे है और मौलिक endothelial संकेत तंत्र के शामिल परीक्षा, संवहनी विकास/ 21 , 22. इस प्रायोगिक आवेदन के लिए एक उच्च मस्तिष्क endothelial समारोह का प्रवाह विश्लेषण उपज की उंमीद है (और शिथिलता) और इस तरह भर में रक्त प्रवाह विनियमन की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अनुमति देगा एजिंग और neurodegenerative रोग के विकास ।

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Protocol

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निंनलिखित प्रयोगों का आयोजन करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि सभी पशु देखभाल का उपयोग करें और प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित कर रहे है और देखभाल और के उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद "गाइड के साथ समझौते में प्रदर्शन प्रयोगशाला पशु" (8वें संस्करण, २०११) और आने दिशानिर्देश । लोमा लिंडा यूनिवर्सिटी के IACUC ने पुरुष और महिला C57BL/6 चूहों (आयु सीमा: 3 से 30 एमओ) के लिए इस पांडुलिपि के लिए इस्तेमाल किए गए सभी प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी है ।

1. उपकरण और सामग्री

नोट: प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सामग्री का विवरण सामग्री, रिएजेंट, और नियमावली या संबंधित विक्रेताओं के साथ संबद्ध वेबसाइटों की तालिकामें पाया जा सकता है ।

  1. फ्लो चैंबर
    1. एक गिलास coverslip नीचे एक यांग एल्यूमीनियम मंच में एक superfusion चैंबर जकड़ना । एक कॉंपैक्ट एल्यूमीनियम मंच में चैंबर के साथ मंच सुरक्षित ।
    2. पिपेट लगाए रखने के लिए एल्यूमीनियम मंच पर मंच के प्रत्येक छोर पर एक micromanipulator सेट करें ।
      नोट: एक व्यावहारिक विकल्प के रूप में, प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए endothelial ट्यूब के अलगाव से संक्रमण की सुविधा के लिए सुरक्षित एक फ्लो चैंबर इकाई के साथ इस हस्तांतरणीय मंच तंत्र का उपयोग करें ।
  2. सूक्ष्मदर्शी
    1. का प्रयोग करें stereomicroscopes (5x 50x आवर्धन रेंज के लिए) स्थूल और सूक्ष्म-विच्छेदन प्रक्रियाओं के लिए फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोतों से सुसज्जित ।
    2. endothelial ट्यूबों की तैयारी के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप चरण कंट्रास्ट या अवकलन हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) संगत उद्देश्यों (10x, 20x, और 40x) और एक एल्यूमीनियम मंच के साथ सुसज्जित का उपयोग करें ।
    3. आंशिक रूप से पचा रक्त वाहिकाओं से endothelial ट्यूबों को अलग करने के लिए, एक microsyringe पंप endothelial ट्यूब तैयारी उपकरण के निकट नियंत्रक जगह है ।
    4. प्रयोगात्मक तंत्र के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट उद्देश्यों (20x और 40x, संख्यात्मक एपर्चर ०.७५) के अलावा मानक उद्देश्यों (4x और 10x) और एक कंपन अलगाव की मेज पर एक मैनुअल एल्यूमीनियम मंच के साथ सुसज्जित का उपयोग करें ।
  3. Intracellular रिकॉर्डिंग उपकरण
    1. अलग endothelial ट्यूबों में endothelial कोशिकाओं के वीएम रिकॉर्ड करने के लिए, संगत headstage के लिए electrometer कनेक्ट । यदि आवश्यक हो, एक समारोह जनरेटर कनेक्ट या प्रयोग के लिए electrometer को उत्तेजित करता है कि वर्तमान इंजेक्शन की आवश्यकता है ।
    2. एम्पलीफायर outputs एक डेटा अधिग्रहण प्रणाली के लिए कनेक्ट, श्रव्य आधार पर नज़र रखता है, और एक आस्टसीलस्कप. प्रयोगों के दौरान प्रवाह चैंबर निकास के पास संदर्भ इलेक्ट्रोड (एजी/AgCl गोली) सुरक्षित ।
    3. एक प्रतिदीप्ति प्रणाली इंटरफेस, उच्च तीव्रता चाप दीपक और बिजली की आपूर्ति, hyperswitch, photomultiplier ट्यूब (या PMT) के एकीकृत घटकों के साथ एक भामिति प्रणाली का प्रयोग करें, और कैमरा मापने के लिए [Ca2 +]मैं endothelial कोशिकाओं में ।
    4. प्रयोग के दौरान एक शारीरिक तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) को बढ़ाने और बनाए रखने के लिए एक इनलाइन हीटर से सुसज्जित तापमान नियंत्रक का उपयोग करें ।
    5. एक छह जलाशय एक इनलाइन प्रवाह नियंत्रण वाल्व के साथ एक वाल्व नियंत्रक से जुड़े मंच का प्रयोग करें endothelial ट्यूब चैंबर में सुरक्षित करने के लिए संबंधित समाधान के वितरण को नियंत्रित करने के लिए ।
  4. Micropipettes और तेज इलेक्ट्रोड
    नोट: trituration और अलग endothelial ट्यूबों के यांत्रिक स्थिरीकरण के लिए पिपेट निर्माण करने के लिए, पिपेट और एक माइक्रो-तोड़ने और आग चमकाने के लिए फोर्ज खींचने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक खींचने का उपयोग करें ।
    1. adventitia, चिकनी मांसपेशी, और आंशिक रूप से पचा धमनी खंड से endothelial ट्यूब अलग करने के लिए, trituration पिपेट (80 के एक आंतरिक टिप व्यास के साथ प्रत्येक तैयार-120 µm) के रूप में उपयुक्त, borosilicate ग्लास केशिका ट्यूबों का उपयोग कर, और आग टिप पॉलिश ।
    2. superfusion कक्ष के नीचे के खिलाफ endothelial ट्यूब सुरक्षित करने के लिए, एक कुंद, गोलाकार अंत (गर्मी पॉलिश, 100 के आयुध डिपो-150 µm; पतली दीवार borosilicate ग्लास ट्यूबों से तैयार) के साथ पिपेट पिनिंग का उपयोग करें ।
    3. एक endothelial सेल के वीएम रिकॉर्ड करने के लिए, के एक टिप प्रतिरोध के साथ तेज इलेक्ट्रोड तैयार ~ १५० ± 30 MΩ एक इलेक्ट्रॉनिक खींचने का उपयोग कर कांच केशिका ट्यूब से ।

2. समाधान और औषधियां तैयार करना

  1. शारीरिक नमक समाधान (PSS)
    1. दवा की तैयारी के साथ एक प्रयोग के लिए, का उपयोग कर PSS के 1 एल की एक ंयूनतम तैयार: १४० mm NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl2, 1 मिमी MgCl2, 10 मिमी N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic एसिड (HEPES), और 10 मिमी ग्लूकोज ।
    2. विच्छेदन के लिए आवश्यक समाधान तैयार करने के लिए, मस्तिष्क धमनी के अलगाव, और endothelial ट्यूब की तैयारी, PSS कमी CaCl2 (शूंय Ca2 + pss) तैयार करें ।
    3. ultrapure में सभी समाधान तैयार ज2हे, ७.४ के लिए पीएच समायोजित, उंहें एक फिल्टर के माध्यम से बंध्याकरण (०.२२ µm ताकना आकार), और सुनिश्चित करें कि समाधान के परासरणीयता २९० और ३०० mOsm के बीच है ।
      नोट: समाधान लगभग दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. 10% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)
    1. 10% BSA तैयार करने के लिए, 10 मिलीलीटर शून्य Ca2 + PSS के एक चोंच में lyophilized पाउडर के 1 जी भंग ।
    2. तेल फिल्म के साथ चोंच कवर और कई घंटे की अवधि के पास करने के लिए BSA भंग करने के लिए धीमी सरगर्मी के साथ, अनुमति देते हैं ।
    3. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज प्लस एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर अंतिम समाधान फ़िल्टर और 1 मिलीलीटर aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा करने के लिए बनाते हैं ।
  3. विच्छेदन समाधान
    1. विच्छेदन समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, BSA के ५०० µ l जोड़ें (10%) शून्य Ca के ४९.५ मिलीलीटर के लिए2 + PSS.
    2. तैयारी के तुरंत बाद, धमनी विच्छेदन के लिए एक पेट्री डिश में इस विच्छेदन समाधान स्थानांतरण ।
  4. पृथक्करण समाधान
    1. ५० मिलीलीटर की पृथक्करण तैयार करने के लिए, 5 µ l के CaCl2 (1 M) और ५०० µ l के BSA (10%) के लिए ४९.५ मिलीलीटर शूंय Ca2 + PSS जोड़ें । कमरे के तापमान (आरटी) पर बैठने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
  5. एंजाइमों
    1. धमनी क्षेत्रों के आंशिक पाचन के लिए, ०.३१ मिलीग्राम/एमएल papain, ०.५ मिलीग्राम/एमएल dithioerythritol, ०.७५ मिलीग्राम/एमएल collagenase (प्रकार एच ब्लेंड), और ०.१३ मिलीग्राम/एमएल elastase के साथ पाचन समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार ।
      नोट: एंजाइम गतिविधियों भिन्न हो सकते हैं; हालांकि, हमारे सफल प्रोटोकॉल के लिए, वाणिज्यिक आपूर्ति की एंजाइम गतिविधियों निम्नानुसार इस्तेमाल किया गया है: papain ≥ 10 इकाइयों/ collagenase ≥ 1 इकाइयों/मिलीग्राम, एन के लिए-[3-(2-Furyl) acryloyl]-लियू-Gly-समर्थक-ाला या FALGPA सब्सट्रेट कारोबार; और elastase ≥ 5 यूनिट/
  6. फ्रा-2 और औषधीय एजेंटों की तैयारी
    1. तैयार स्टॉक एकाग्रता (1 मिमी) के फ्रा-2 DMSO में डाई हूं । ४९५ µ l को लोड करने के लिए PSS के 5 µ l को जोड़कर एक कार्य एकाग्रता (10 µ m) तैयार करें ।
    2. उपयुक्त के रूप में PSS में औषधीय एजेंटों (जैसे, एटीपी) की कार्य सांद्रता के ≥ ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
  7. समाधान का आयोजन
    1. एक किा समाधान तैयार करना, 2 M KCl, KCl को भंग करके, ५० मिलीलीटर एच 2ओ में (७.४५५ ग्राम KCl) ।
    2. तेज इलेक्ट्रोड backfilling करने से पहले समाधान को ०.२२ µm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें.
  8. Propidium आयोडाइड (०.१%)
    1. भंग 10 मिलीग्राम lyophilized propidium आयोडाइड के 10 मिलीलीटर में 2 मीटर KCl.
    2. अच्छी तरह से मिश्रण और आरटी पर स्टोर ।

3. विच्छेदन और मस्तिष्क धमनी का अलगाव

नोट: सभी विच्छेदन प्रक्रियाओं stereomicroscopes और फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोतों द्वारा प्रदान की रोशनी के माध्यम से (50x तक) नमूना आवर्धन की आवश्यकता है । मस्तिष्क और धमनियों के अलगाव के लिए विच्छेदन प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए, तेज विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करें । Microdissection उपकरण को अलग और स्वच्छ धमनियों में शामिल किया गया है ठीक इत्तला दे दी संदंश और Vannas शैली विच्छेदन कैंची (3 से ९.५ mm ब्लेड) ।

  1. माउस मस्तिष्क का अलगाव
    1. Anesthetize एक C57BL/6 माउस (3-30 महीने पुराने, पुरुष या महिला) isoflurane की साँस लेना के माध्यम से (2 के लिए 3%-3 मिनट), तो तुरंत संज्ञाहरण के पूर्ण प्रेरण निंनलिखित जानवर decapitate । एक stereomicroscope के तहत एक पेट्री डिश में सिर प्लेस (व्यास 10 सेमी, गहराई १.५ सेमी) ठंड युक्त (4 डिग्री सेल्सियस) शूंय Ca2 + PSS ।
    2. माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखना, खोपड़ी पर त्वचा और बालों को हटाने और ठंड शून्य Ca 2 के साथ अत्यधिक रक्त को हटाने+ PSS. केवल मानक विच्छेदन कैंची (जैसे, 24 मिमी ब्लेड), पश्चकपाल हड्डी के साथ शुरू करने और खोपड़ी की नाक की हड्डी के माध्यम से विस्तार के सुझावों का उपयोग कर एक चीरा बनाओ ।
    3. खोपड़ी के साथ ध्यान से खुले मोटे-इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर चीरा, और अलग संयोजी ऊतक विलिस की एक बरकरार सर्कल के साथ मस्तिष्क को अलग करने के लिए ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, Littauer हड्डी काटने संदंश खोपड़ी खोलने के लिए और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. धीरे खून निकालने के लिए एक चोंच में ठंड शून्य सीए2 + PSS के साथ अलग मस्तिष्क धो लें । मस्तिष्क धमनियों के अलगाव के लिए शीत विच्छेदन समाधान युक्त चैंबर में ऊपर का सामना करना पड़ ब्रेन ventral पक्ष प्लेस (आंकड़ा 1a).
  2. मस्तिष्क धमनियों का अलगाव
    नोट: पीछे मस्तिष्क धमनी इस प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिनिधि मस्तिष्कवाहिकीय endothelial अध्ययन मॉडल के रूप में चुना गया है ।
    1. शीत विच्छेदन स्टेनलेस स्टील पिंस (व्यास ०.२ मिमी, लंबाई ~ 11-12 मिमी) का उपयोग कर एक लकड़ी का कोयला-सिलिकॉन बहुलक कोटिंग नीचे (गहराई ≥ ५० सेमी) एक गिलास पेट्री पकवान में डाला जा करने के लिए प्रयोग में अलग मस्तिष्क सुरक्षित ।
    2. विच्छेदन के दौरान PSS के एक ठंडा तापमान बनाए रखने के लिए, एक विच्छेदन एक सर्द प्रणाली द्वारा ठंडा लगातार एक 1:1 पानी-ईथीलीन ग्लाइकोल मिश्रण सायक्लिंग चैंबर का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, विच्छेदन ताजा बर्फ पर किया जा सकता है ।
    3. शल्य चिकित्सा के पीछे मस्तिष्क धमनियों को अलग (~ ०.३ करने के लिए ०.५ सेमी क्षेत्रों, कोई अक्षीय तनाव) पीछे से संचार और basilar धमनियों microdissection उपकरणों का उपयोग Vannas शैली कैंची और तेज ठीक-इत्तला दे दी संदंश (आंकड़ा 1b ). पेट्री डिश (चित्रा 1C) में विच्छेदन समाधान में दोनों अलग पीछे मस्तिष्क धमनियों को सुरक्षित करने के लिए स्टेनलेस स्टील पिंस (व्यास ०.१ मिमी, लंबाई ~ 13-14 मिमी) का उपयोग करें ।
    4. अलग पीछे मस्तिष्क धमनियों को ध्यान से संयोजी ऊतक को हटाने के द्वारा सावधानी से साफ-इत्तला दे दी संदंश (चित्रा 1 डी) । एंजाइमी पाचन के लिए (1-2 मिमी) क्षेत्रों में बरकरार धमनियों में कटौती (चित्रा १ d; इनसेट) ।

4. Endothelial ट्यूब और Superfusion की तैयारी

नोट: endothelial ट्यूब पहले वर्णित के रूप में तैयार है12, मस्तिष्क धमनी6के लिए संशोधनों के साथ ।

  1. उद्देश्यों (10x, 20x, और 40x), एक कैमरा, और एक एल्यूमीनियम चरण एक चैंबर और micromanipulators धारण के साथ सुसज्जित एक खुर्दबीन का उपयोग कर trituration उपकरण तैयार करें । चरण और नमूना (चित्रा 2a) के बगल में एक पंप नियंत्रक के साथ एक microsyringe सुरक्षित ।
  2. पूरी तरह से खनिज तेल के साथ एक trituration पिपेट backfill और यह माइक्रो सिरिंज पिस्टन पर सुरक्षित । फिर, माइक्रो-पंप नियंत्रक के साथ सिरिंज का उपयोग, पिपेट में हवा के बुलबुले के अभाव को सुनिश्चित करते हुए खनिज तेल के शीर्ष पर पिपेट (~ १३० nl) में पृथक्करण समाधान को वापस ले.
  3. एक 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब (चित्रा 2 बी), जिसमें ०.३१ मिलीग्राम/एमएल papain, ०.५ मिलीग्राम/एमएल dithioerythritol, ०.७५ मिलीग्राम/एमएल collagenase, और ०.१३ मिलीग्राम/एमएल elastase में पृथक्करण समाधान के 1 मिलीलीटर में बरकरार धमनी क्षेत्रों प्लेस । आंशिक पाचन के लिए 10-12 मिनट के लिए ३४ ° c पर मशीन ।
  4. पाचन के बाद, नए पृथक्करण समाधान के ~ 5 मिलीलीटर के साथ एंजाइम समाधान की जगह । एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, RT पर पृथक्करण समाधान युक्त एक चैंबर में एक खंड स्थानांतरण.
  5. चैंबर में पृथक्करण समाधान में पिपेट प्लेस और यह पचा पोत के एक छोर के करीब स्थिति । कोमल trituration (चित्रा 2c; इनसेट) के लिए पंप नियंत्रक पर 2 से 5 nL/एस की सीमा के भीतर एक दर निर्धारित करें ।
  6. 200x आवर्धन के लिए 100x के माध्यम से देखने के दौरान, वापस लेने और एक endothelial ट्यूब का उत्पादन करते हुए चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं अलग कर देना करने के लिए धमनी खंड बेदखल । यदि आवश्यक हो तो ध्यान से महीन-इत्तला संदंश को endothelial ट्यूब से अलग असंबद्ध adventitia और आंतरिक लोचदार लेमिना का प्रयोग करें । पुष्टि करें कि सभी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं असंबद्ध रहे है और केवल endothelial कोशिकाओं एक अक्षुण्ण "ट्यूब" (चित्रा 2c) के रूप में रहते हैं ।
  7. micromanipulators का उपयोग करना, कांच पर endothelial ट्यूब के प्रत्येक छोर को सुरक्षित superfusion चैंबर के कवर स्लिप borosilicate ग्लास लगाए पिपेट (चित्रा 2d) का उपयोग कर ।
  8. धो-बाहर असंबद्ध adventitia और चैंबर से चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और 2 मिमी CaCl2 PSS के साथ पृथक्करण समाधान की जगह । superfusion और प्रयोगात्मक रिग के माइक्रोस्कोप पर सुरक्षित endothelial ट्यूब के साथ मोबाइल मंच स्थानांतरण ।
  9. प्रयोग के दौरान 6 साफ ५० एमएल जलाशयों (चित्रा 3ए) के PSS और संबंधित दवा समाधान के निरंतर वितरण के लिए उपयोग करते हैं, के रूप में उपयुक्त । जब वैक्यूम चूषण करने के लिए प्रवाह फ़ीड मिलान लामिना प्रवाह के साथ संगत के रूप में भर प्रवाह की दर को मैन्युअल रूप से सेट करने के लिए इनलाइन प्रवाह नियंत्रण वाल्व का उपयोग करें । पृष्ठभूमि डेटा और डाई लोडिंग रिकॉर्डिंग से पहले ≥ 5 मिनट के लिए endothelial ट्यूब के superfusion के लिए चैंबर (चित्र 3 बी) के लिए PSS उद्धार ।

5. डाई लोड, धो-आउट, और तापमान सेटिंग्स

  1. [Ca2 +]मैंमापने के लिए photometry प्रणाली के सभी घटकों को चालू करें । 400x आवर्धन पर endothelial ट्यूब देखने के लिए प्रयोगात्मक रिग (चित्रा 3) पर माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें, और photometry प्रणाली सॉफ्टवेयर सुइट का उपयोग कर भामिति विंडो में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
  2. endothelial ट्यूब के व्यास को मापने और ३४० और ३८० एनएम (≥ 10 हर्ट्ज) पर वैकल्पिक उत्तेजना के दौरान ५१० एनएम उत्सर्जन के साथ समझौते में रिकॉर्ड पृष्ठभूमि autofluorescence मूल्यों ।
  3. को मापने के लिए [Ca2 +]मैं प्रतिक्रियाओं, फ्रा के साथ endothelial ट्यूब लोड-2 हूं डाई (10 µ एम अंतिम एकाग्रता) आरटी में और अनुमति ~ 30-प्रकाश के अभाव में 40 मिनट ।
  4. के लिए ताजा PSS के साथ endothelial ट्यूब के superfusion पुनः आरंभ करें ~ 30-40 मिनट धोने के लिए बाहर अतिरिक्त डाई और अनुमति intracellular फ्रा-2 de-esterify के लिए हूं । वॉश-आउट अवधि के दौरान, एक इनलाइन हीटर के साथ तापमान नियंत्रक (चित्रा 3) का उपयोग कर, फिर से ३७ ° c करने के लिए आरटी से तापमान बढ़ाएं, तो प्रयोग भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ।
    नोट: आरटी के बीच अनुशंसित वृद्धिशील संक्रमण ३७ ° c हर कदम पर एक ≥ 5 मिनट equilibration समय के साथ तीन कदम (जैसे, 5 डिग्री सेल्सियस) पर जोर देता है ।

6. [Ca2 +]i और Vm का एक साथ माप

  1. अन्य सभी उपकरण और वीएम को मापने के लिए electrometer सॉफ्टवेयर सुइट को चालू करें ( चित्रा 3, चित्रा 4देखें). तदनुसार डेटा प्राप्ति दर समायोजित करें (≥ 10 हर्ट्ज).
  2. 2 मीटर KCl के साथ एक तेज इलेक्ट्रोड और backfill खींचो । डाई स्थानांतरण के माध्यम से सेलुलर युग्मन के अध्ययन के लिए, backfill 2 मीटर KCl में ०.१% propidium आयोडाइड भंग के साथ microelectrodes ।
  3. एक चांदी के तार पर इलेक्ट्रोड सुरक्षित एक micromanipulator के साथ सुरक्षित एक electrometer सिर मंच से जुड़ी पिपेट धारक में क्लोराइड के साथ लेपित. micromanipulator का उपयोग संक्षेप में इलेक्ट्रोड की नोक को कक्ष में बहते हुए PSS में रखने के लिए करें, जबकि 4x उद्देश्य के माध्यम से देखते हुए ।
  4. मैदान स्नान क्षमता के अनुरूप के रूप में 0 के लिए आराम वीएम सेट करें । सिर्फ endothelial ट्यूब के एक सेल पर इलेक्ट्रोड की नोक स्थिति । यदि वांछित, electrometers करने के लिए लिंक श्रव्य आधार पर नज़र रखता है संभावित रिकॉर्डिंग के साथ ध्वनि पिच सहयोगी का उपयोग करें ।
  5. 40x उद्देश्य का उपयोग कर 400x के लिए आवर्धन बढ़ाएँ और इलेक्ट्रोड की नोक की आवश्यकता के रूप में पुन: स्थिति. photometry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर भामिति विंडो को समायोजित ~ ५० ८० endothelial कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
  6. धीरे micromanipulator का उपयोग कर endothelial ट्यूब की कोशिकाओं में से एक में इलेक्ट्रोड जगह और आराम वीएम को स्थिर करने के लिए ≥ 2 मिनट प्रतीक्षा करें । इसी तरह, पहले इलेक्ट्रोड के साथ मद्धिम पहले सेल से दूसरे सेल में एक दूसरे इलेक्ट्रोड (दूरी ≥ १०० µm) डालें.
  7. एक बार आराम वीएम इसकी उंमीद मूल्यों पर स्थिर है (-30 से-४० एमवी)6, प्रकाश के अभाव में प्रतिदीप्ति अंतरफलक पर पीएमटी पर बारी और intracellular के अधिग्रहण शुरू [2 सीए +] रोमांचक फ्रा- 2 एकांतर से (10 हर्ट्ज) पर ३४० और ३८० एनएम जबकि ५१० एनएम में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन इकट्ठा ।
    नोट: का परीक्षण करने के लिए सेलुलर विद्युत युग्मन, वर्तमान (± 0.5-3 ना, ~ 20 एस पल्स अवधि) "1 साइट" के रूप में एक electrometer के माध्यम से दिया जा सकता है, और वीएम के परिवर्तन के रूप में एक और electrometer के साथ दर्ज किया जा सकता है "साइट 2" (दूरी ≥ १०० µm)
  8. एक बार वीएम के एक साथ माप और [Ca2 +]मैं स्थापित कर रहे हैं, की अनुमति ~ 5 endothelial ट्यूब के superfusion के लिए एक निरंतर लामिना प्रवाह दर पर PSS के साथ दवाओं के आवेदन से पहले मिनट ।
  9. लगातार प्रवाह दर के साथ superfusion चैंबर के लिए PSS में तैयार दवा (उदा., एटीपी) लागू करें । ~ 3 मिनट (या दवा की कैनेटीक्स के लिए उपयुक्त समय की अवधि) के बाद, PSS Vm तक और F३४०/३८० अनुपात उनकी आधारभूत स्थितियों के लिए वापसी तक के साथ धो लें । समाधान के प्रत्येक संक्रमण के दौरान अस्थाई फोटोमीटर और electrometer सॉफ्टवेयर suites भर में सिंक्रनाइज़ के रूप में संबंधित रिकॉर्डिंग मार्क ।
  10. एक बार प्रयोग किया जाता है, micromanipulator और नोटिस वीएम ~ 0 एमवी के रूप में स्नान इलेक्ट्रोड द्वारा संदर्भित का उपयोग कर सेल से इलेक्ट्रोड को वापस ले । Vm और [Ca2 +] के संबंधित रिकॉर्डिंग रोकेंमैं और डेटा विश्लेषण के लिए फ़ाइल पर रिकॉर्ड सहेजें ।

7. सेल के दृश्य को सेल युग्मन

  1. propidium आयोडाइड के माध्यम से सेल-टू-सेल कल्पना करने के लिए, एक अपेक्षाकृत उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x या 60x फ्लोरोसेंट उद्देश्य का उपयोग करें (जैसे, ०.९५) और rhodamine फिल्टर ठोस राज्य रोशनी, एक उच्च संकल्प कैमरा के साथ सेट (जैसे, 16- मेगापिक्सल), और एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर सुइट ।

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Representative Results

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ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रदर्शन संलग्न आंकड़ों में दिखाया गया है । एक मस्तिष्क एक युवा वयस्क पुरुष C57BL/6N माउस (5 महीने) से अलग आंकड़ा 1aमें दिखाया गया है । पीछे सेरेब्रल धमनियों ध्यान से विलिस के सर्कल से अलग कर रहे हैं, संयोजी ऊतक के बिना हटा दिया, और क्षेत्रों में कटौती (आंकड़ा 1b-D). आंशिक रूप से पचा धमनी क्षेत्रों से, बरकरार endothelial ट्यूब का उत्पादन किया और ग्लास कवर स्लिप पर पिन लगाए पिपेट का उपयोग कर सुरक्षित है । कोमल यांत्रिक खिंचाव पोत tortuosity बिना vivo लंबाई में लगभग रैखिक करने के लिए दो पिन पिपेट का उपयोग कर लागू किया जाता है । इस पांडुलिपि (चित्रा 2a-डी) में आगे स्पष्ट किया गया है । Endothelial पीछे मस्तिष्क धमनियों से अलग ट्यूबों ~ 90-चौड़ाई में 100 µm और ≥ ३०० µm लंबाई में हैं । ट्यूब फ्रा के साथ भरी हुई है-2 के बाद से धो के साथ बाहर PSS । [ca2 +के एक साथ माप]मैं और वीएम endothelial ट्यूब में ca द्वारा किया जाता है2 + photometry के रूप में अच्छी तरह से तेज इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (प्रयोगात्मक रिग 3 चित्रा और चित्रा 4में दिखाया गया).

endothelial ट्यूब के कार्यात्मक आकलन शारीरिक शर्तों के तहत प्रवाह कक्ष में एटीपी के रूप में एक शास्त्रीय endothelial GPCR एगोनिस्ट लागू करने के द्वारा किया जाता है । जैसा चित्र 5में दिखाया गया है, [Ca2 +]मैं और वीएम एटीपी (१०० µ एम) के जवाब में एक साथ दर्ज कर रहे हैं । Vm (≥ 5 mV) का एक महत्वपूर्ण hyperpolarization एक intracellular के साथ concomitantly होता है [ca2 +]मैं वृद्धि, यह दर्शाता है कि [ca2 +] में वृद्धिमैं एसकेसीए/IKसीए चैनलों को सक्रिय करता है और इस तरह की अनुमति देता है K+ प्लाज्मा झिल्ली भर समाप्ति एध का उत्पादन करने के लिए । वर्तमान इंजेक्शन का उपयोग कर सेलुलर युग्मन का सबूत (± ०.५ 3 ना, ~ 20 एस दालों) हमारे हाल ही में प्रकाशित काम में पाया जा सकता है (संदर्भ6, चित्रा 1) । ध्यान दें कि propidium आयोडाइड इस तरह के inositol trisphosphate (आईपी3, ~ ४२० डीए), चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर, ~ ३२९ डीए) के रूप में गैप जंक्शनों के माध्यम से गुजर के लिए जाना जाता दूसरा संदेशवाहक के संदर्भ में ~ ६६८ दा के एक बड़े पैमाने पर है ।

Figure 1
चित्रा 1 : मस्तिष्क से दिमागी धमनी का अलगाव. (एक) बरकरार धमनियों के साथ अलग मस्तिष्क (सफेद तीर dessection समाधान में पीछे मस्तिष्क धमनी इंगित करता है) । () पीछे मस्तिष्क धमनी का बढ़ाया देखें (सफेद तीर; ~ 3x बनाम पैनल ए) । () अलग पीछे मस्तिष्क धमनियों नमूना डिश में स्टेनलेस स्टील पिंस के साथ सुरक्षित । () संयोजी ऊतक को हटाने के पीछे मस्तिष्क धमनियों । इनसेट धमनियों के कट क्षेत्रों से पता चलता है; स्केल बार = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2 : सेरेब्रल endothelial ट्यूब की तैयारी. () आंशिक रूप से पच धमनी क्षेत्रों triturating के लिए इस्तेमाल उपकरण; एक = micromanipulator, बी ट्यूब तैयार करने के लिए = चैंबर, सी = एल्यूमिनियम चरण, डी = microsyringe, ई = माइक्रोस्कोप, एफ = microsyringe पंप नियंत्रक । () धमनी के खंड (एंजाइमी पाचन के लिए समाधान में सफेद तीर) । () trituration द्वारा तैयार Endothelial ट्यूबों; अ = trituration पिपेट, ब = बरकरार endothelial ट्यूब. इनसेट adventitia और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को दूर करने के लिए trituration प्रक्रिया से पता चलता है; स्केल बार = १०० µm. (D) एक बरकरार endothelial ट्यूब पर सुरक्षित ग्लास कवर स्लिप पिन पिपेट के साथ; एक = पिन पिपेट, बी = बरकरार endothelial ट्यूब के व्यास के साथ ~ १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3 : superfusion और एक साथ के लिए उपकरण [Ca2 +] मैं व वीरेंद्र मी माप । () endothelial ट्यूब और तापमान नियंत्रण के superfusion के लिए उपकरण, एक = उच्च तीव्रता चाप लैंप बिजली की आपूर्ति, बी = प्रतिदीप्ति प्रणाली इंटरफेस, सी = तापमान नियंत्रक, डी = छह-superfusion प्रणाली के जलाशयों, e = फाइबर ऑप्टिक प्रकाश सूत्रों, च = वाल्व नियंत्रक, जी = hyperswitch के [Ca2 +]मैं photometry प्रणाली । () Superfusion चैंबर तंत्र; ए और बी = headstages, सी = जमीन इलेक्ट्रोड, डी = इनलाइन हीटर, ई = superfusion टयूबिंग, एफ = निर्वात चूषण, जी = superfusion चैंबर, एच = एल्यूमीनियम चरण होल्डिंग चैंबर. () एक कंपन अलगाव सारणी पर प्रायोगिक मंच; एक = कैमरा के साथ सेल फ्रेमन अनुकूलक, बी = माइक्रोस्कोप प्रकाश, सी = माइक्रोस्कोप, डी = एल्यूमिनियम चरण, headstage नियंत्रण के लिए ई = micromanipulator, च = कंपन अलगाव तालिका । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और डेटा रिकॉर्डिंग के संचालन के लिए उपकरण । एक = आस्टसीलस्कप, बी = समारोह जनरेटर, सी = श्रव्य आधार पर नजर रखने, डी = 50/60 हर्ट्ज शोर फिल्टर, ई और एफ = electrometers, जी = डेटा अधिग्रहण प्रणाली । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक साथ [Ca2 +] मैं व वीरेंद्र मी रिकॉर्डिंग । (एक) अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि (400x) एक माउस मस्तिष्क धमनी endothelial ट्यूब भामिति विंडो में प्रयोग के लिए एक 40x उद्देश्य का उपयोग करने के लिए समायोजित की । एक तेज इलेक्ट्रोड के रूप में एक कक्ष में रखा गया है छवि (सफेद तीर) के शीर्ष पर दिखाया गया है. () एटीपी (१०० µ एम) के जवाब में एफ३४०/३८० अनुपात (ऊपर) और वीएम (नीचे) के एक साथ माप के लिए कच्चे निशान । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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हाल की घटनाओं के प्रकाश में6,15,16,17, अब हम विधि को अलग करने के लिए माउस मस्तिष्क धमनी endothelium की तैयारी में एक साथ माप के लिए [Ca2 +] मैं और वीएम अंतर्निहित एध लगातार ३७ डिग्री सेल्सियस पर ~ 2 एच के लिए । हालांकि तकनीकी रूप से मुश्किल है, हम सेल को मापने के लिए सेल युग्मन के रूप में अच्छी तरह से कर सकते है (संदर्भ6, चित्रा 1 देखें) । इस तरीके में, हम असतत उपाय कर सकते है और एक साथ संकेत घटनाओं का आयोजन किया । एक खाते के लिए सामांय चुनौतियों का सामना करना पड़ा जबकि अलग माउस धमनी endothelium से परामर्श संदर्भ11,12। हम माउस मस्तिष्क धमनियों को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम पर जोर, endothelial के हमारे विशेष माप [सीए2 +]मैं और वीएम, समस्या निवारण के लिए सुझाव, और के प्रकाश में वैकल्पिक तरीकों के लिए विचार प्रयोगात्मक शक्तियों के नीचे कमजोरियों/

पीछे मस्तिष्क धमनी चिकनी मांसपेशी और endothelial कोशिकाओं को नुकसान के बिना विलिस और संयोजी ऊतक के सर्कल से सावधान अलगाव की आवश्यकता है । सर्जिकल उपकरण (संदंश और कैंची) माउस microcirculation विच्छेदन प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त होना चाहिए, जबकि स्वच्छ, तेज किनारों के साथ बनाए रखा । कंकाल की मांसपेशी के सापेक्ष12, हम दो तिहाई और papain, collagenase, और dithioerythritol की सांद्रता द्वारा एंजाइमी गर्मी के लिए समय अवधि कम जबकि empirically के एक elastase अनुकूलित एकाग्रता का उपयोग जोड़ने । मस्तिष्क धमनी endothelial ट्यूबों को अलग करने में लगातार सफलता के लिए, यह बैचों में एंजाइमों (2 से 4 शीशियों) का उपयोग करें और शेल्फ जीवन की आवृत्ति के साथ समझौते में लगातार विनिर्माण प्रथाओं के साथ एक उच्च संमानित विक्रेता से आदेश महत्वपूर्ण है । यहां तक कि एंजाइम गतिविधि में एंजाइम की एक बहुत से अगले करने के लिए भिन्नता के लिए क्षमता के साथ, यह सुझाव दिया है कि एंजाइम सांद्रता बनाए रखा जा सकता है, जबकि 10 से 12 मिनट के भीतर पाचन के समय का अनुकूलन. यह ध्यान देने योग्य बात है कि न तो लिंग और न ही पशु की आयु (३ से ३० माह) हमारे अनुभव में सेरेब्रल धमनियों से पृथक endothelium की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा रही है. इस प्रकार, यह अनुशंसित है कि एंजाइम कॉकटेल और एंजाइम पाचन के समय की संरचना की उंर और लिंग पर अध्ययन में ही रहते हैं ।

के रूप में बल दिया, सावधानी adventitia और धुरी के आकार का चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं से endothelium के कोमल trituration और अलगाव के दौरान की आवश्यकता है ताकि endothelial कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए12। trituration कदम के लिए, चिपचिपा खनिज तेल सूक्ष्म सिरिंज और जलीय pss के पिस्टन के बीच एक हाइड्रोलिक माध्यम के रूप में कार्य करता है को वापस लेने या पोत pss में नहाया क्षेत्रों बेदखल । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अगर पोत खंड खनिज तेल संपर्क, इस कदम को खनिज तेल और PSS के अनुक्रमिक backfilling के साथ एक साफ trituration पिपेट का उपयोग कर दोहराया जाना चाहिए । एक प्रयोग से पहले, यह अनुशंसा की जाती है कि vivo लंबाई में एक लगभग रैखिक संभव हद तक endothelial ट्यूब करने के लिए बहाल किया जा, जिससे व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक "फ्लैट" ग्रहण, अनुदैर्ध्य आकृति विज्ञान (जैसे, व्यास ~ 5 µm; लंबाई ~ १०० µm; मोटाई ~ ०.५ µm)8. हालांकि, अक्षीय तनाव हद तक लागू नहीं किया जाना चाहिए, जहां नमूनों के किनारों पर कोशिकाओं संबंधित लगाए पिपेट नीचे से दूर खींच रहे हैं और इस तरह के दौरान विश्वसनीय सेलुलर माप के लिए यांत्रिक स्थिरता समझौता प्रयोग.

भामिति [ca2 +]मैं इस तकनीक में इस्तेमाल प्रणाली को मापने endothelial की सतत माप के लिए उपयुक्त है [2 ca +]मैं ratiometric फ्रा-2 डाई का उपयोग कर । व्यक्तिगत प्रोटोकॉल आमतौर पर पिछले ≥ 10 मिनट के बिना महत्वपूर्ण photobleaching कर सकते हैं । इसके अलावा, हम सामांयतः [Ca2 +] को मापने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करें क्योंकि यह समय पर डेटा अधिग्रहण और माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के लगातार आंदोलन में ठहराव के लिए के रूप में वीएम माप के लिए तेज इलेक्ट्रोड सुरक्षित करने के लिए आवश्यक है । ध्यान दें कि यह एक भामिति दृष्टिकोण है कि केवल वैश्विक, औसत [Ca2 +] एकाधिक कक्षों के बीच कब्जा है । सामान्य तौर पर, के लिए [Ca2 +]मैं माप, हम औषधीय एजेंटों के लिए endothelial सेल प्रतिक्रियाओं के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए photometry सिफारिश (जैसे, पीक और पठार चरणों का समय पाठ्यक्रम) जबकि योजनाओं को सुरक्षित करने के लिए मानक फोकल या multiphoton माइक्रोस्कोपी12,23का उपयोग कर microdomain संकेतन घटनाओं quantitate करने के लिए आगे बढ़ें ।

तीव्र इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी दृष्टिकोण शारीरिक कोशिकीय तैयारी में एकीकृत वीएम रिकॉर्डिंग के लिए उत्तरदायी है. intracellular वीएम की माप तक कई महत्वपूर्ण कदम है कि या तो सुविधा या माप की सफलता काटना कर सकते है के साथ सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । सबसे पहले, प्रयोगकर्ता के लिए लगातार एक टिप प्रतिरोध के साथ तेज इलेक्ट्रोड विनिर्माण के लिए एक गिलास खींचने पर इष्टतम कार्यक्रम की स्थिति निर्धारित करने की जरूरत है ~ १५० ± 30 MΩ । एक संदर्भ के रूप में एक रेशा गर्मी रैंप परीक्षण पढ़ने का उपयोग करना, यह अनुशंसित है कि प्रयोगकर्ता पैरामीटर empirically, विशेष रूप से "गर्मी" सेटिंग में भिंनता के संबंध में निर्धारित करते हुए खींच के समय को अधिकतम । अगले, micromanipulators, headstages, पिपेट धारकों के यांत्रिक स्थिरता, और नमूना बिल्कुल महत्वपूर्ण है । एक कंपन अलगाव तालिका के लिए स्पष्ट आवश्यकता के अलावा, प्रयोगकर्ता सभी फिटिंग सुरक्षित है कि सुनिश्चित करने की आवश्यकता होगी और चारों ओर और जोड़तोड़ के नीचे मंच क्षेत्र साफ है । आदर्श रूप में, बाहरी शोर की हद तक कम किया जाना चाहिए कि तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के संकल्प के भीतर है 1 एमवी. हमारे अनुभव में, शोर का सबसे आम स्रोत चांदी के तार पिपेट धारक में सुरक्षित है कि एक पर्याप्त क्लोराइड कोटिंग या प्रतिस्थापन पूरी तरह की जरूरत है । यदि आम 50/60 हर्ट्ज शोर मौजूद है, "हम मुंह बंद करने" प्रौद्योगिकी इस्तेमाल किया जा सकता है और एक आधुनिक electrometer के साथ मानक आता है. यदि शोर पूरी तरह से विकराल दिखाई देता है, तो देखें कि क्या वहां स्नान या ओवरफ़्लो में एक रिसाव है, जहां PSS तापमान नियंत्रण के लिए प्रतिरोधों के साथ संपर्क में आ जाएगा जांच करें । यदि जटिलताओं एक स्थिर वीएम संकेत प्राप्त करने के साथ रहना, बिजली डोरियों और टी connectors की अखंडता की जांच करें ।

पूरी तरह से, अगर एक तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की स्थापना असफल है, यह आमतौर पर एक अनुचित इलेक्ट्रोड के कारण है, यांत्रिक अस्थिरता, या गरीब सेलुलर स्वास्थ्य. वैकल्पिक रूप से, प्रयोगकर्ता भी व्यक्ति पर पैच-दबाना तकनीक के एक विंयास पर विचार करना चाहते हो सकता है, बिजली से जोड़ा कोशिकाओं जहां पूरे सेल धाराओं और एक आयन चैनल रिकॉर्डिंग पर जानकारी प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर के सामान्य चुनौतियों का सामना करना पड़ा (जैसे, विषम intracellular लोडिंग, ब्लीचिंग, अंशांकन का उपयोग ionophores, शील डिटेक्शन रिज़ॉल्यूशन), वोल्टेज-संवेदी रंजक जैसे डि-8-ANEPPS भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ।

रक्त प्रवाह विनियमन में endothelium की हमारी समझ के लिए और मस्तिष्क भर में एक तेजी से उंर बढ़ने मानव आबादी और क्रोनिक हृदय और neurodegenerative रोगों की बढ़ती घटनाओं के साथ महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, हम एक महत्वपूर्ण मस्तिष्क धमनी से बरकरार endothelium को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं, जो दिमाग में अन्य संवहनी संरचनाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, हम अंतर्निहित [Ca2 +]मैं और वीएमके एक साथ माप के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण दिखाते हैं । अंत में, दोहरे intracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग करना, गैप जंक्शनों के माध्यम से सेल-टू-सेल युग्मन भी मूल्यांकन किया जा सकता है । सावधानीपूर्वक नियोजित औषधीय और/या आनुवंशिक हस्तक्षेप के साथ, वर्तमान प्रोटोकॉल यथोचित और मात्रात्मक अपने मूल रूप में मस्तिष्क endothelial समारोह के अध्ययन शामिल हैं । हमारी उंमीद है कि experimenters से निर्माण और इस जानकारी के अनुकूलन के लिए संवहनी जीव विज्ञान और सामांय में तंत्रिका विज्ञान अग्रिम होगा । विशेष रूप से, यह आम प्रयोगात्मक बिजली की माप के साथ शामिल संघर्ष को पूरी तरह से कम देखने के संतोषजनक होगा । हालांकि इस प्रोटोकॉल एक खड़े अकेले किसी भी तरह से तकनीक का सेट नहीं है, यह एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ठीक कैसे endothelial शारीरिक निर्धारकों संवहनी प्रतिरोध में परिवर्तन में अनुवाद और कैसे वे ठीक-ट्यून विनियमन रक्त प्रवाह की शर्तों के सापेक्ष स्वास्थ्य बनाम रोग के प्रतिनिधि ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए चार्ल्स हेविट धंयवाद जबकि उपकरणों की स्थापना और वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक आपूर्ति । हम एक अतिरिक्त औंधा माइक्रोस्कोप और electrometer, क्रमशः के साथ हमें प्रदान करने के लिए डीआरएस. शॉन एम विल्सन और क्रिस्टोफर जी विल्सन, प्रसवकालीन जीव विज्ञान के लिए LLU केंद्र से, धन्यवाद । इस शोध में नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट R00-AG047198 (EJB) और लोमा लिंडा यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के नए फैकल्टी स्टार्ट-अप फंड का सपोर्ट किया गया है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
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  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
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हौसले से अलग और बरकरार माउस सेरेब्रल Endothelium में Intracellular कैल्शियम और झिल्ली क्षमता का एक साथ माप
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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