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Biology

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

Abstract

대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (Vm) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아2 + [캘리포니아2 +] 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아2 +-K+ 를 활성화 (SKCa/IKCa) 채널.

여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 "튜브" 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아2 +] 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 Vm 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.

Introduction

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두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크1arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완4통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 Gq의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아2 +], 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca2 +의 활성화에서 증가-K활성화 + (SKCa/IKCa) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (Vm)5,,67. 따라서, 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 의 친밀 한 관계 혈액 흐름 조절에 필수적인 이며 불가결 하 심장-뇌혈관 기능6,8. 광범위 한 문학에 걸쳐 다 수의 연구 개발 (예: 고혈압, 당뇨병, 심장 마비, 관상 동맥 질환, 만성 신부전, 만성 질환의 혈관 내 피 기능 장애의 협회 보고 주변 동맥 질환)9,10, 생리 뿐만 아니라 병 적인 조건에서 내 피 기능 공부의 중요성을 나타내는.

혈관 내 피 hyperpolarization, 혈관 확장, 그리고 조직 관류의 생산에 필수적인 것 이며 따라서, 기본 셀룰러 속성의 검사는 중요 한. 일반 연구 모델로, 마우스 동맥 내 피 튜브 모델의 준비 게시 되었습니다 전에 골격 근11,12, 창 자13,14, 폐 그리고 최근 뇌6. 동시 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 측정 연구 특히 골격 근육 동맥 내 피15,16 뿐만 아니라 림프 혈관 내 피17출판 되었습니다. 내 피 튜브 접근을 이용 하 여 기본 연구, 뿐만 아니라 그것의 장단점과8 의 종합적인 검토는이 실험 도구는 특정 연구에 적합 여부를 확인 하 상담 수 있습니다. 간단히는 장점은 내 피 세포 기능의 주요 생리 적인 구성 요소 유지 됩니다 (예:, 캘리포니아2 + 유입 및 intracellular 자료, hyperpolarization Nernst 잠재력까지 Vm 의 k+ 통해 SKCa/IKCa 활성화 및 내 피 세포 결합을 통해 간격 접속점) 혈관 주위 신경 입력, 부드러운 근육 전압-문이 채널 기능 및 수축, 같은 요인을 혼동 없이 혈액, 그리고 호르몬 영향8의 순환. 대조적으로, 일반적으로 사용 되는 세포 문화 접근 소개 형태학18 및 이온 채널 식19 크게 생리 적인 관측 비보 전 결정에 대 한 비교를 난독 처리할 수 있습니다 방식에서에 중요 한 변경 또는 vivo에서. 이 모델은 그대로 혈관 세그먼트 격리의 4 h 이내 테스트 최적으로 혈액의 흐름, 부드러운 근육과 실험 일정에 제한 된 유연성 등 규제에 대 한 다른 필수 구성 요소와 통합의 부족 등 동물.

Socha 및 시걸12 및 중간6,,1516, 최근 실험 개발 저술로 이전 비디오 프로토콜에서 건물 이로써 설명에서 신선한 피 내 막의 절연 후부 대뇌 동맥 그리고 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극, 각각 사용 하 여 동시 측정. 또한,이 실험 생리 적인 조건 (pH 7.4, 37 ° C) 동안 소금 솔루션 및 약리 에이전트의 연속 superfusion를 수반 한다. 우리 후부 대뇌 동맥, 구조적 무결성 (셀 간격 접속점 통해 결합)와 충분 한 크기 (폭 50 µ m, 길이 ≥300 µ m) 내부 및 세포 신호 따라 중에 대 한 의무가 격리 endothelium 생성 선택 내 피 세포입니다. 또한, 설치류 후부 대뇌 동맥의 연구는 실질적으로 문학에서 나타내고 근본적인 내 피 신호 메커니즘, 혈관 개발/노화, 그리고 병 리20, 의 시험을 포함 21 , 22.이 실험의 대뇌 내 피 기능 (기능 장애) 높은 처리량 분석을 얻을 것으로 예상 된다 애플리케이션과 통해 혈액 흐름의 이해에서 중요 한 발전 그로 인하여 허용 한다 노화 및 신경 질환의 개발

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Protocol

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다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 "가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물' (8번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월).

1. 장비 및 재료

참고: 프로토콜에 필요한 자료의 세부 정보 테이블의 재료, 시 약설명서 또는 해당 공급 업체와 관련 된 웹사이트에서 찾을 수 있습니다.

  1. 흐름 챔버
    1. 양극 처리 한 알루미늄 플랫폼에 유리 coverslip 바닥 superfusion 챔버를 고정. 소형 알루미늄 단계에 챔버와 플랫폼을 확보.
    2. 알루미늄 고정 피 펫을 들고 무대에는 micromanipulator 플랫폼의 각 끝에 설정 합니다.
      참고: 실용적인 옵션으로이 양도 무대 장치를 사용 하 여 실험의 성능에 내 피 튜브의 격리에서 전환을 촉진 하기 위하여 보안 흐름 챔버 장치.
  2. 현미경
    1. 스테레오 현미경 사용 (5 x 50 x 배율 범위를) 매크로 및 마이크로 해 부 절차에 대 한 섬유 광섬유 광원을 갖추고 있습니다.
    2. 내 피 튜브의 준비에 대 한 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 호환 목표 (10 배, 20 x 40 x)와 알루미늄 단계는 거꾸로 한 현미경을 사용 합니다.
    3. 부분적으로 소화 혈관에서 내 피 튜브를 분리 하는 microsyringe 펌프 컨트롤러를 내 피 튜브 준비 장치에 인접 한 장소.
    4. 실험 기구에 대 한 표준 목표 (4 x 10 x) 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 목표 (20 x와 40 x, 숫자 조리개 0.75) 및 진동 절연 테이블에 수동 알루미늄 단계.
  3. 세포내 녹음 장비
    1. 격리 된 내 피 튜브에 내 피 세포의 Vm 를 기록 하는 전위 계 호환 headstage에 연결 합니다. 필요한 경우, 함수 발생기 또는 자극 전류 주입을 필요로 하는 실험에 대 한 전위 계를 연결 합니다.
    2. 데이터 수집 시스템, 가청 기준선 모니터, 오실로스코프를 앰프 출력을 연결 합니다. 실험 하는 동안 흐름 챔버 출구 근처 참조 전극 (Ag/AgCl 펠 릿)를 보호 합니다.
    3. 형광 시스템 인터페이스, 높은 강도 아크 램프와 전원 공급 장치, hyperswitch, 광 전 증폭 관 관 (PMT)의 통합된 구성 요소와 포토 메트릭 시스템을 사용 하 여 및 [캘리포니아2 +] 내 피 세포에서 측정 하는 카메라.
    4. 인라인 히터를 갖춘 온도 조절기를 사용 하 여 인상 하 고 실험을 통해 생리 적인 온도 (37 ° C)를 유지.
    5. 인라인 흐름 제어 밸브와 밸브 컨트롤러에 연결 된 6-저수지 플랫폼을 사용 하 여 내 피 튜브 챔버에 보안을 각각 솔루션의 배달 제어.
  4. Micropipettes와 날카로운 전극
    참고: 분쇄 및 절연된 내 피 튜브의 기계적인 안정화 펫을 제조 하는 펫 및 위반에 대 한 마이크로 포지 당기 전자 끌어당기는 사람을 사용 하 고 연마 화재.
    1. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 adventitia, 부드러운 근육과 내 피 튜브를 분리, 분쇄 펫 (각각 80-120 µ m의 내부 팁 직경), 붕 규 산 유리 모 세관 튜브를 사용 하 여 준비 하 고 화재 폴란드어는 팁.
    2. Superfusion 챔버의 하단에 대 한 내 피 튜브를 보안 하려면 고정 펫 무딘, 둥근 엔드 (열-광택, 100-150 µ m;의 OD 얇은 벽 붕 규 산 유리 관에서 준비).
    3. 내 피 세포의 Vm 를 기록 하려면 준비 ~ 150 ± 30의 팁 저항을 가진 날카로운 전극에서 전자를 끌어당기는 사람을 사용 하 여 유리 모 세관 튜브 m ω.

2입니다. 솔루션 및 약물의 준비

  1. 생리 적 소금물 (PSS)
    1. 약 준비와 함께 한 실험에 대 한 PSS를 사용 하 여 1 L의 최소 준비: 140 mM NaCl, KCl, 2mm CaCl2, 5mm 1 mM MgCl2, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic 산 (HEPES), 그리고 10 mM 포도 당.
    2. 해 부에 대 한 필요한 솔루션을 준비, 대뇌 동맥의 절연 및 내 피 튜브의 준비 준비 PSS CaCl2 (제로 캘리포니아2 + PSS) 부족.
    3. 초순 이온된 H2O에서에서 모든 솔루션을 준비 하 고, pH 7.4 조정 하 고 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)를 통해 그들을 소독 한 솔루션 osmolality 290와 300 mOsm 사이 인지 확인 하십시오.
      참고: 솔루션 4 ° C에서 약 2 주 동안 저장할 수 있습니다.
  2. 10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)
    1. 10 %BSA 준비 하려면 10 mL 0 캘리포니아2 + PSS의 비 커에 동결 건조 된 분말의 1 g을 분해.
    2. 파라핀 영화 비 커를 커버 하 고 통과, 해산 BSA에 대 한 느린 교 반으로 몇 시간의 기간을 허용.
    3. 10 mL 주사기 플러스 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 최종 솔루션을 필터링 하 고 1 mL aliquots-20 ° c.에 저장할 수
  3. 해 부 솔루션
    1. 해 부 솔루션 50 mL를 준비 하려면 BSA (10%)의 500 µ L 0 캘리포니아의2 + PSS 49.5 mL를 추가 합니다.
    2. 즉시 준비 후에,이 해 부 솔루션 동맥 해 부에 대 한 페 트리 접시에 전송 합니다.
  4. 분리 솔루션
    1. 분리 솔루션 50 mL를 준비 하려면 5 µ L CaCl2 (1 개 M)의 추가 0 캘리포니아의2 + PSS 49.5 ml BSA (10%)의 500 µ L. 실 온 (RT)에 앉아 솔루션을 수 있습니다.
  5. 효소
    1. 동맥 세그먼트의 부분 소화, 소화 솔루션 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라 (유형 H 조화)과 0.13 mg/mL elastase의 1 mL를 준비 합니다.
      참고: 효소 활동 다를 수 있습니다; 그러나, 우리의 성공적인 프로토콜에 대 한 상업적으로 제공 된 효소 활동 사용 되었습니다 다음과 같습니다: papain ≥10 단위/mg; mg/콜라 ≥1 단위, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala 또는 FALGPA 기판 매출;에 대 한 그리고 elastase ≥ 5 단위/밀리 그램.
  6. Fura-2 및 약리 에이전트의 준비
    1. Fura-2의 사진 농도 (1 mM) 준비 DMSO에 오전 염료. 로드에 대 한 PSS의 495 µ L에 주식의 5 µ L을 추가 하 여 작업 농도 (10 µ M)를 준비 합니다.
    2. 적절 한 PSS에 약리학 대리인 (예를 들어, ATP)의 농도의 50 mL를 준비 합니다.
  7. 솔루션을 실시
    1. 실시 준비 솔루션, 2 M KCl, KCl 이온 H2O (7.455 g 50 mL H2O KCl)을 용 해 하 여.
    2. 날카로운 전극 백필 이전 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
  8. Propidium 요오드 화물 (0.1%)
    1. 10ml 2 M KCl의 요오드 화 동결 건조 된 propidium의 10 mg을 디졸브.
    2. 잘 혼합 하 고 실시간 저장

3. 해 부 및 대뇌 동맥의 절연

참고: 모든 해 부 절차 스테레오 현미경 및 조명 섬유 광섬유 광원에 의해 제공을 통해 표본 확대 (최대 50 x) 필요 합니다. 두뇌 및 동맥의 격리에 대 한 해 부 절차를 수행 하려면 날카롭게 해 부 악기를 사용 합니다. 서 분리 하 고 동맥을 청소 도구 날카롭게 뾰족한 집게 등 욕실이 스타일 해 부가 위 (3 9.5 m m 블레이드).

  1. 마우스 뇌의 격리
    1. Anesthetize는 C57BL/6 마우스 (3-30 개월 이전, 남성 또는 여성)를 통해 흡입 isoflurane (2-3 분 동안 3%), 다음 완전 한 유도 마 취의 직후 동물 목을 벨. 페 트리 접시에 머리를 배치 (직경 10 ㎝, 깊이 1.5 c m) 제로 감기 (4 ° C)를 포함 된 Ca2 + PSS는 stereomicroscope에서.
    2. 현미경을 통해 봅니다, 두개골을 통해 피부와 머리카락을 제거 하 고 감기와 과도 한 혈액 제거 제로 캘리포니아2 + PSS. 절 개는 팁만 표준 해 부가 위 (예를 들어,: 24 m m 블레이드)의 시작 후 두 뼈 및 두개골의 코 뼈를 통해 확장을 사용 하 여 확인 합니다.
    3. 절 개는 그대로 원형 윌리스와 함께 뇌를 분리 거친 밀고 집게, 그리고 별도 결합 조직을 사용 하 여 함께 신중 하 게 두개골을 엽니다.
      참고: 또는, Littauer 뼈 절단 집게를 두개골을 열고 뇌를 노출 사용할 수 있습니다.
    4. 부드럽게 감기와 격리 된 두뇌 세척 제로 캘리포니아2 + 혈액을 제거 하는 비 커에 PSS. 뇌 복 부 측을 대뇌 동맥 (그림 1A)의 절연을 위한 차가운 해 부 솔루션을 포함 하는 챔버에 향하도록 놓습니다.
  2. 대뇌 동맥의 절연
    참고: 후부 대뇌 동맥이이 프로토콜에 대 한 대표적인 뇌혈관 내 피 연구 모델로 선정 되었습니다.
    1. 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 차가운 해 부 솔루션에서 격리 된 두뇌 확보 (직경 0.2 m m, 길이 ~ 11-12 m m) 숯 주입 실리콘 폴리머 코팅 유리 페 트리 접시의 하단 (깊이 50 cm)를 삽입할 수.
    2. 해 부 동안 PSS의 냉장된 온도 유지, 지속적으로 1:1 물-에틸렌 글리콜 혼합물을 순환 냉각 시스템에 의해 냉각 해 부 챔버를 사용 합니다. 또는 해 부 신선한 얼음에 수행할 수 있습니다.
    3. 수술 후부 통신 후부 대뇌 동맥 (0.5 cm 세그먼트에 ~0.3, 아니 축 긴장)와 서 악기 욕실이 스타일 위와 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1B 사용 하 여 두개골 기저 부 동맥을 분리 ). 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 (직경 0.1 m m, 길이 13 ~-14 m m)를 보안 둘 다 고립 된 페 트리 접시 (그림 1C)에 해 부 솔루션에 후부 대뇌 동맥.
    4. 결합 조직 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1D)를 사용 하 여 제거 하 여 격리 된 후부 대뇌 동맥을 신중 하 게 청소. 세그먼트로 그대로 동맥을 잘라 (길이 1-2 m m) (그림 1D; 인세트) 효소 소화.

4입니다. 내 피 튜브 및 Superfusion의 준비

참고: 내 피 튜브는 앞에서 설명한12, 대뇌 동맥6수정 준비가 되어 있습니다.

  1. 목표 (10 배, 20 x 40 x), 카메라, 및 챔버와 micromanipulators는 알루미늄 단계 현미경을 사용 하 여 분쇄 장치를 준비 합니다. 무대와 견본 (그림 2A)에 인접 한 펌프 컨트롤러는 microsyringe를 보안 합니다.
  2. 완전히 백필은 분쇄 미네랄 오일 플라스틱 하 고 마이크로 주사기 피스톤을 통해 그것을 확보. 그런 다음에 피펫으로 분리 솔루션 철회 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러를 사용 하 (~ 130 nl) 위에 피 펫에서 공기 방울의 부재를 보장 하면서 미네랄 오일.
  3. 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라, 그리고 0.13 mg/mL elastase 10 mL 유리 튜브 (그림 2B)에 분리 솔루션의 1 mL에 그대로 동맥 세그먼트를 놓습니다. 부분적인 소화에 대 한 10-12 분 34 ° C에서 품 어.
  4. 따라 소화, 효소 솔루션을 ~ 5 mL 신선한 분리 솔루션의 바꿉니다. 실시간에서 분리 솔루션이 포함 된 챔버에 한 세그먼트를 전송 1 mL 피 펫을 사용 하 여,
  5. 피펫으로 챔버에서 분리 솔루션에 배치 하 고는 소화의 1 개의 끝에 가까운 위치. 펌프 용 컨트롤러에 부드러운 분쇄 (그림 2C, 삽입) 2 ~ 5 nL/s의 범위 내에서 속도 설정 합니다.
  6. 100 x 200 x 확대를 통해 보기, 철회 하 고 부드러운 근육 세포는 내 피 튜브를 생산 하는 동안 해리를 동맥 세그먼트를 추출. 필요한 경우, 신중 하 게 사용 하 여 뾰족한 집게 내 피 튜브에서 별도 해리 adventitia 및 내부 탄력 있는 lamina. 모든 부드러운 근육 세포는 해리만 내 피 세포는 그대로 "튜브" (그림 2C)로 유지 확인 합니다.
  7. Micromanipulators를 사용 하 여, 펫 (그림 2D)를 고정 하는 붕 규 산 유리를 사용 하 여 superfusion 챔버의 유리 커버 슬립에 내 피 튜브의 각 끝을 보안 합니다.
  8. 워시 아웃 adventitia 및 평활 근 세포 챔버 및 바꾸기 2 mm CaCl2 PSS 분리 솔루션에서 해리 했다. Superfusion 및 실험 장비의 현미경에 보안된 내 피 튜브와 모바일 플랫폼을 전송 합니다.
  9. PSS 및 각각 마약 솔루션의 지속적인 납품을 위한 6 깨끗 한 50 mL 저수지 (그림 3A)를 사용 하 여 적절 한 실험 기간 동안. 인라인 흐름 제어 밸브를 사용 하 여 수동으로 설정 하려면 전체 유량 층 류와 진공 흡입을 피드 하는 흐름을 일치 하는 동안. 배경 데이터와 염료 로드를 기록 하기 전에 챔버 (그림 3B) ≥ 5 분 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 PSS 제공 합니다.

5. 염료 부하, 워시 아웃 및 온도 설정

  1. [캘리포니아2 +]측정 광도 측정 시스템의 모든 구성 요소를 켭니다. 실험 장비 (그림 3C)에 현미경을 사용 하 여 광도 측정 시스템 소프트웨어 제품군을 사용 하 여 광도 창 셀에 400 배 확대와에서 내 피 튜브 볼.
  2. 내 피 튜브의 직경을 측정 하 고 340 및 380 nm (≥10 Hz) 대체 여기 동안 510 nm 방출에 배경 autofluorescence 값을 기록 합니다.
  3. [캘리포니아2 +] 응답을 측정 하기 위해 부하 Fura-2 내 피 튜브 RT에 (10 µ M 최종 농도)를 염색 오전 및 ~ 30-40를 허용 빛의 부재에 분.
  4. Superfusion ~ 30-40에 대 한 신선한 PSS와 내 피 튜브의 다시 시작 워시 아웃 분 염료를 초과 하 고 세포내 Fura-2 드 esterify 야. 워시 아웃 기간 동안 RT에서 점차적으로 온도 37 ° c에서 인라인 히터로 온도 컨트롤러 (그림 3A)를 사용 하 여 다음 실험에 걸쳐 37 ° C에서 유지 합니다.
    참고: 권장된 증분 전환 RT 37 ° C에 ≥5 분 평형 시간 각 단계에서 3 단계를 (예: 5 ° C)을 수반 한다.

6. [캘리포니아2 +]i 와 Vm 동시 측정

  1. 다른 모든 장비 및 Vm 를 측정 하기 위한 전위 계 소프트웨어 제품군 ( 그림 3, 그림 4참조). 그에 따라 데이터 수집 속도 조정 (≥10 Hz).
  2. 날카로운 전극 및 2 M KCl 백필을 당겨. 세포의 연구에 대 한 커플링 염료 전송, 백필 통해는 microelectrodes 0.1 %propidium 요오드 화물 2 M KCl에에서 녹아 있는 함께.
  3. 실버 와이어는 micromanipulator 확보 하는 전위 계 머리 단계에 연결 된 피 펫 홀더에 염화 코팅에 전극을 보호 합니다. micromanipulator를 사용 하 여 간단히 4 x 목표 통해 보는 동안 챔버에 흐르는 PSS에 전극의 팁의 위치.
  4. 휴식 Vm 0 설정 일치 접지 목욕으로 잠재적인 합니다. 그냥 내 피 튜브의 셀 위에 전극의 끝을 놓습니다. 원하는 경우 가청 기준선 모니터 electrometers에 연결을 사용 하 여 잠재적인 녹음 사운드 피치 연관.
  5. 40 x 목표를 사용 하 여 x 400 배율 증가 하 고 필요에 따라 전극의 팁 위치. 50 ~ ~ 80 내 피 세포에 초점을 광도 측정 소프트웨어를 사용 하 여 광도 창을 조정 합니다.
  6. 부드럽게 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 내 피 튜브의 셀 중 하나에 놓고 안정 휴식 Vm 에 대 일 분을 기다립니다. 마찬가지로, 첫 번째 전극으로 찔 려 첫 번째 셀에서 다른 셀 (거리 ≥100 µ m)에서 두 번째 전극을 삽입 합니다.
  7. Vm 를 휴식 하는 것입니다 그것의 예상 값에 안정 되 면 (-40-30 mV)6, 빛의 부재에 형광 인터페이스에 PMT 설정 하 고 또는 세포내 [캘리포니아2 +]내가 흥미로운 Fura-2의 수집을 시작 (10 Hz)에 510에서 형광 방출 수집 하는 동안 340 및 380 nm nm.
    참고: 세포 전기 커플링, 현재 테스트 (± 0.5-3 나, ~ 20의 펄스 기간) "사이트 1", 전위 계 를 통해 하나를 배달 될 수 있다 그리고 Vm 의 변경으로 다른 전위 계를 기록 될 수 있습니다 "사이트 2" (거리 ≥100 µ m).
  8. Vm 및 [캘리포니아2 +]의 동시 측정, 설정 한 후 약물의 적용 전에 일정 층 유량에 PSS 함께 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 ~ 5 분 수 있습니다.
  9. 일정 유량과 superfusion 챔버를 PSS에 준비 약물 (예를 들어, ATP)를 적용 합니다. 후 ~ 3 분 (또는 약의 활동에 대 한 적절 한 기간), PSS Vm 까지 세척과 F340/F380 비율 그들의 초기 조건에 반환합니다. 솔루션의 각 전환 중 광도 전위 계 소프트웨어 스위트를 통해 일시적으로 동기화로 각각 녹화를 표시 합니다.
  10. 실험 완료 되 면, 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 셀에서 철회 고 Vm ~ 0 mV 목욕 전극에 의해 참조 된로. Vm 및 [캘리포니아2 +] 의 각각 녹음을 중지 하 고 파일에 데이터 분석에 대 한 레코드를 저장.

7. 셀 커플링의 시각화

  1. 셀 커플링을 통해 propidium 요오드 화물을 시각화 하려면 사용 40 x 또는 60 x 형광 목표는 상대적으로 높은 수 가늠 구멍 (예: 0.95) 및 솔리드 스테이트 조명, 고해상도 카메라 (예: 16-rhodamine 필터 설정 메가 픽셀), 및 이미징 소프트웨어 제품군.

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Representative Results

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위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 피 튜브 생산 이며 고정 펫을 사용 하 여 유리 커버 슬립에. 부드러운 기계 스트레치 선박 tortuosity 없이 선형 vivo에서 길이을 두 고정 펫을 사용 하 여 적용 됩니다. 이 원고 (그림 2A-D)에 더 명확히 되었습니다. 후부 대뇌 동맥에서 분리 된 내 피 튜브는 ~ 90-100 µ m 폭 및 ≥300 µ m 길이에서. 튜브와 로드 Fura 2 워시 아웃 PSS 다음 오전. [캘리포니아2 +]내가 내 피 튜브에 Vm 의 동시 측정은 날카로운 전극 전기 생리학 ( 그림 3그림 4에 표시 된 실험 장비) 뿐만 아니라 캘리포니아2 + 광도 의해 수행 됩니다.

내 피 튜브의 기능 평가 클래식 내 피 GPCR 주 작동 근 ATP 등 생리 적 조건 하에서 흐름 챔버에 적용 하 여 수행 됩니다. 그림 5에서처럼 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 기록 동시에 ATP에 대 한 응답에서 (100 µ M). Vm (mV ≥5)의 중요 한 hyperpolarization 발생 수반 증가 함께 세포내 [캘리포니아2 +] , [캘리포니아2 +] 상승 SKCa/IK 활성화 나타내는Ca 채널 그로 인하여 생산 EDH 플라즈마 막에 걸쳐 K+ 경과 수 있습니다. 현재 분사를 사용 하 여 작성 커플링의 증거 (± 0.5 ~ 3 나, ~ 20의 펄스) 우리의 최근에 출판 된 작품 (참조6, 그림 1)에서 찾을 수 있습니다. Note propidium 요오드 화물 그 두번째 메신저 이노 시 톨 trisphosphate (IP3, 420 ~ 다), 등 간격 접속점 순환 아데노신 monophosphate (캠프, 다 ~ 329) 통과 대 한 알려진 참조 ~ 668 다의 질량은.

Figure 1
그림 1 : 뇌에서 대뇌 동맥의 절연. (A) 두뇌 dessection 솔루션에서 그대로 동맥 (흰색 화살표 나타냅니다 후부 대뇌 동맥)와 격리. 후부 대뇌 동맥 (흰색 화살표; 3 x vs. 의 (B) 확대 보기 패널 A)입니다. (C) 절연된 후부 대뇌 동맥 견본 접시에 스테인레스 스틸 핀을 확보. (D) 후부 대뇌 동맥 결합 조직의 제거 다음. 삽입 표시 컷된 세그먼트의 동맥; 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 대뇌 내 피 튜브 준비. (A) 장비 분쇄 부분적으로 소화 동맥 세그먼트;에 사용 = micromanipulator, b = 튜브, c를 준비 하기 위한 챔버 알루미늄 단계, d = = microsyringe, 전자 현미경, = f = microsyringe 펌프 컨트롤러. (B) 동맥 세그먼트 (흰색 화살표) 효소 소화에 대 한 솔루션. (C) 내 피 튜브 준비한 분쇄; 분쇄 = 피 펫, b = 그대로 내 피 관. 인세트는 adventitia 및 평활 근 세포; 제거 하 분쇄 과정을 보여 줍니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (D)는 그대로 내 피 튜브 고정 피 펫;와 유리 커버 슬립에 고정 = 피 펫, b ~ 100 µ m.의 직경이 그대로 내 피 튜브 = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Superfusion 및 동시 장비 [Ca2 +] 그리고 V m 측정. 내 피 튜브 및 온도 제어의 superfusion (A) 장비는 = 강도 높은 아크 램프 전원 공급 장치, b 형광 시스템 인터페이스, c = 온도 컨트롤러, d = 6-superfusion 시스템의 저수지 = e = 광섬유 빛 소스, f = 밸브 컨트롤러, g = hyperswitch [캘리포니아2 +] 광도 측정 시스템의. (B) Superfusion 챔버 장치; b headstages, c = 접지 전극, d = 인라인 = 히터, e = superfusion 튜브, f 진공 흡입, g = superfusion 챔버, h = = 알루미늄 단계 챔버를 들고. 진동 절연 테이블; (C) 실험 플랫폼 카메라, = 셀 프레임 어댑터 b 현미경 빛, c = 현미경, d = = 알루미늄 단계, e = headstage 제어용 micromanipulator f = 진동 절연 테이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 운영 전기 생리학 및 데이터 기록에 대 한 장비. 오실로스코프, = b 함수 발생기, c = = 가청 기준선 모니터, d = 50/60 Hz 노이즈 필터, e 및 f = electrometers, g = 데이터 수집 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 동시 [Ca2 +] 그리고 V m 녹음. (A) 마우스 대뇌 동맥 내 피 튜브의 차동 간섭 콘트라스트 이미지 (400 x) 40 x 목표를 사용 하 여 광도 창에서 실험에 대 한 조정. 날카로운 전극 (흰색 화살표) 이미지의 상단에 표시 된 대로 셀에 배치 됩니다. (B) F340/F380 비율 (위)와 Vm (아래) ATP에 대 한 응답에서의 동시 측정에 대 한 원시 추적 (100 µ M). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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최근 개발6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아2 +]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. i 및 Vm EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조6, 그림 1 참조)을 측정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 우리 이산 하 고 실시 하는 이벤트를 동시에 신호를 측정할 수 있습니다. 마우스 동맥 피를 분리 하는 동안 직면 하는 일반적인 과제의 계정에 대 한 참조11,12를 참조 하십시오. 마우스의 대뇌 동맥, 내 피 [캘리포니아2 +] 하 고 Vm, 문제 해결을 위한 제안 및 고려 사항에 비추어의 다른 방법에 대 한 우리의 특정 측정 하기 위한 중요 한 단계를 강조 하는 우리 실험적 강점/약점 아래입니다.

후부 대뇌 동맥 평활 근과 내 피 세포에서 윌리스의 원 및 결합 조직 손상 없이 주의 절연을 해야합니다. 외과 도구 (집게와가 위)는 깨끗 하 고 선명한 가장자리를 유지 하는 동안 마우스 미세 해 부 절차에 적합 해야 합니다. 골격 근육12상대, 우리 감소 효소 인큐베이션 기간 2/3와 papain, 콜라, 그리고 dithioerythritol의 농도 의해 반 elastase의 경험적으로 최적화 된 농도의 사용을 추가 하는 동안. 대뇌 동맥 내 피 튜브 분리에 일관 된 성공을 위해 중요 하다 배치 (2 ~ 4 병)에 주문 효소에 일관 된 제조 관행의 사용 및 수명 주파수에 높은 평판 공급 업체에서. 다음에서 한 많은 효소의 효소 활동에 변화에 대 한 가능성도 함께 효소 농도 10 ~ 12 분 이내 소화의 시간을 최적화 하는 동안 유지 하는 것이 좋습니다. 그것은 그도 성별도 나이 (3 ~ 30 개월) 동물의 되었습니다 중요 한 장벽 격리 endothelium의 준비를 우리의 경험에의 하면 대뇌 동맥에서 지적 가치가 있다. 따라서, 효소 칵테일 및 효소 소화의 시간 구성 연령과 성별에 연구에서 동일을 유지 하는 것이 좋습니다.

강조, 주의 필요 부드러운 분쇄 및 격리 endothelium adventitia 및 스핀 들 모양의 부드러운 근육 세포의 내 피 세포12에 손상을 방지 하기 위해 합니다. 분쇄 단계에 대 한 점성 미네랄 오일 마이크로 주사기의 피스톤과 철회 하거나 PSS에서 목욕 하는 선박 세그먼트를 꺼내기 수성 PSS 사이 유압 매체 역할을 합니다. 그것은 그 선박 세그먼트 연락해 미네랄 오일,이 단계를 반복 해야 합니다 미네랄 오일과 PSS의 순차적 백필으로 깨끗 한 분쇄 피 펫을 사용 하 여 주목 한다. 실험 전에 것이 좋습니다 약 선형 vivo에서 길이, 가능한 범위 내 피 튜브 복원할 수 면 개별 셀 가정 "플랫", 경도 형태 (예를 들어, 지름 ~ 5 µ m, 길이 ~ 100 µ m; 두께 ~0.5 µ m)8. 그러나, 축 긴장 적용 해서는 안 어디는 시료의 가장자리에서 셀 각각 고정 펫 및 동안 신뢰할 수 있는 셀룰러 측정 함으로써 타협 기계적 안정성 밑에서 당기는 정도 실험입니다.

광도 [캘리포니아2 +]내가 측정 하는이 기술에 사용 되는 시스템은 내 피 [캘리포니아2 +]i 비율 Fura 2 염료를 사용 하 여 연속 측정에 적합 합니다. 개별 프로토콜 일반적으로 뜻깊은 photobleaching 없이 ≥10 분을 지난 수 있습니다. 또한, 우리는 일반적으로 데이터 수집 및 Vm 측정에 대 한 날카로운 전극 보호 하는 데 필요한 현미경 목표의 빈번한 움직임에 적시 일시 의무가 있기 때문에 [캘리포니아2 +] 측정을 위해이 방법을 사용 합니다. 이 방식은 한 광도만 글로벌, [캘리포니아2 +]내가 여러 셀 간에 평균 note. 일반적으로, [캘리포니아2 +] 측정을 위해 좋습니다 광도를 약리 에이전트 (예:, 시간 코스와 고원 단계의)에 대 한 내 피 세포 응답의 초기 특성에 대 한 계획을 확보 하는 동안 quantitate microdomain 신호 표준 confocal 또는 multiphoton 현미경12,23을 사용 하 여 이벤트를 진행 합니다.

날카로운 전극 전기 생리학 방법은 생리 다세포 준비에 통합된 Vm 녹음에 대 한 순종입니다. 세포내 Vm 의 측정은 지금까지 가장 기술적으로 도전적인 수많은 중요 한 단계를 촉진 하거나 측정의 성공을 없애다. 첫째,는 실험 일관 ~ 150 ± 30의 팁 저항을 가진 날카로운 전극 제조를 위한 유리 끌어당기는 사람에 최적의 프로그램 조건을 결정 하는 데 필요한 m ω. 참고로 읽고 필 라 멘 트 열 램프 테스트를 사용 하 여, 그는 실험 결정 매개 변수 경험적으로, 특히 풀의 시간을 극대화 하는 동안 "열"에 변화에 관하여 추천 된다. Micromanipulators, headstages, 피 펫 소유자, 및 견본의 다음, 기계적 안정성은 절대적으로 중요 합니다. 진동 절연 테이블에 대 한 명백한 필요 이외에 실험 모든 피팅 안전 하 고 무대 지역 주변과 조작자 아래는 깨끗 해야 합니다. 날카로운 전극 녹음의 해상도 1 내는 정도로 외부 잡음을 감소 해야 이상적으로, 뮤직 비디오. 우리의 경험에서 잡음의 가장 일반적인 소스는 전부 충분 한 염화 비닐 코팅 또는 교체 필요는 피 펫 홀더에 보안은 철사 이다. 일반적인 50/60 Hz 노이즈 있으면 "입을 흠" 기술 사용 될 수 있다 하 고 현대 전위 계도 표준 온다. 소음 완전히 관리 하기 어려운 경우, 있는지 여부는 목욕 또는 오버플로에 누출 PSS 온도 제어에 대 한 저항 접촉으로 올 것 이다 확인 합니다. 합병증 안정적인 Vm 신호 획득 유지, 전기 코드와 t-커넥터의 무결성을 확인 하십시오.

전부, 날카로운 전극 녹음은 설정 하는 경우 그것은 일반적으로 부적절 한 전극, 기계적인 불안정성, 또는 세포 건강. 또는,는 실험 또한 개별, 전기 uncoupled 셀 전체 셀 전류와 단일 이온 채널 녹음에 대 한 정보를 구할 수 있는 패치 클램프 기술의 구성을 고려 하는 것 좋습니다. 전압에 민감한 염료와 같은 디-8-ANEPPS도 있지만 (예:, 이종 세포내 로드, 표백, ionophores, 겸손 한 탐지 해상도 사용 하 여 교정) 형광 염료를 사용 하 여 일반적인도 전에 직면 하 고, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

혈액 흐름 조절 하 고 뇌 전체에 피에 대 한 우리의 이해는 빠르게 노화와 함께 중요 한 인구 및 만성 심혈 관 및 신경 퇴행 성 질환의 발생률이 상승. 따라서, 우리는 뇌의 다른 혈관 구조에 적응 될 수 있는 중요 한 대뇌 동맥에서 그대로 피를 격리 하기 위한 방법을 제공 합니다. 또한, 우리는 기본 [캘리포니아2 +]i 와 Vm의 동시 측정을 위한 유용한 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 듀얼 세포내 전극에 사용 하 여, 셀-간격 접속점 통해 커플링 수 또한 부과. 신중 하 게 계획 된 약리학 및 유전자 중재, 현재 프로토콜 합리적으로 그리고 양이 많게 포함 기본 형태로 뇌 내 피 기능 연구. 우리의 기대는 경험에서 구축 하 고이 정보를 미리 혈관 생물학 및 신경 과학 일반적 적응 이다. 특히, 전기 측정 전부 최소화와 관련 된 일반적인 실험적인 투쟁 보고 만족 스러운 것입니다. 이 프로토콜은 아니지만 어떠한 수단에 의해 기술의 독립 실행형 세트, 사용 될 수 있습니다 결정 하는 보완적인 접근 방식으로 정확 하 게 어떻게 내 피 생물 결정 혈관 저항에 어떻게 그들이 조정 규정 변경으로 번역 혈액의 건강 대. 질병의 조건에 상대 흐름.

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Disclosures

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 우수한 기술 지원 장비 및 현재 프로토콜에 필요한 용품을 설정 하는 동안 찰스 휴이 트 감사 합니다. 우리 감사 박사 숀 M. 윌슨과 크리스토퍼 G. 윌슨 Perinatal 생물학의 LLU 센터에서 제공 하는 추가 거꾸로 한 현미경 및 전위 계, 각각. 이 연구는 건강의 국가 학회 교부 금 R00 AG047198 (EJB) 및 Loma Linda 대학의 학부의 새로운 교수 창업 자금 지원 되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).
세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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