Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Samtidiga mätningar av intracellulära kalcium och membranpotentialen i nyligen isolerade och intakt mus Cerebral endotel

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

Här finns protokoll för (1) nymalen isolera intakt cerebral endotelceller ”rör” och (2) samtidiga mätningar av endothelial kalcium och membranpotential som under endotel-derived hyperpolarisering. Dessutom tillåter dessa metoder för farmakologiska trimning av endotelceller kalcium och elektrisk signalering som enskilda eller interaktiva experimentella variabler.

Abstract

Cerebrala artärer och deras respektive mikrocirkulationen leverera syre och näringsämnen till hjärnan via blod flöde förordningen. Endotelceller linje lumen av blodkärl och kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller. Primära endothelial-beroende signalvägar av hyperpolarisering av membranpotentialen (Vm) och kväveoxid normalt i drift parallellt att medla vasodilatation och därmed öka blodflödet. Även om integrerad att samordna vasodilatation över flera millimetrar av vaskulär längd, har komponenter av endotel-derived hyperpolarisering (EDH) varit historiskt svårt att mäta. Dessa komponenter i EDH medför intracellulära Ca2 + [Ca2 +]jag ökar och efterföljande aktivering av små - och mellanliggande konduktans Ca2 +-aktiverade K+ (SKCa/IKCa) kanaler.

Här presenterar vi en förenklad illustration av isoleringen av färska endotel från mus cerebrala artärer; samtidiga mätningar av endothelial [Ca2 +]jag och Vm med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive; och en kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Bakre cerebrala artärer från Circle of Willis avlägsnas den bakre kommunicera och basilaris artärerna. Enzymatisk nedbrytning av rengjorda posterior cerebral arteriell segment och efterföljande sönderdelning underlättar borttagning av adventitia, perivaskulär nerver och glatta muskelceller. Resulterande posterior cerebral arteriell endothelial ”tuber” säkras sedan i Mikroskop och granskas med hjälp av en kamera, fotomultiplikatorn röret, och en till två elektrometrar medan under kontinuerlig superfusion. Sammantaget kan denna metod samtidigt mäta förändringar i endotel [Ca2 +]jag och Vm i diskreta cellulära platser, förutom att sprida EDH genom gap-junctions upp till millimeters avstånd längs intakt endotelet. Denna metod förväntas ge en hög genomströmning analys av hjärnfunktionerna endothelial underliggande mekanismer av blod flödesreglering i normal och sjuka hjärnan.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blodflödet i hela hjärnan regleras samordningen av vasodilatation bland cerebrala artärer och arterioler i vaskulär nätverk1. Endothelial celler som kantar cerebral motstånd artärer kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller1,2,3. I synnerhet under endotel-derived hyperpolarisering (vanligen kallas EDH), intracellulära Ca2 + ([Ca2 +]jag) och elektrisk signalering i endotelceller samordna vasodilatation bland endothelial celler och deras omgivande glatta muskelceller genom gap-junctions för arteriell avkoppling4. Fysiologiska inledandet av EDH sekventiellt innebär stimulering av Gq-kopplade receptorer (varandra), en ökning i [Ca2 +]jag, och aktivering av endotel små - och intermediate-Ca2 +-aktiverade K+ (SKCa/IKCa) kanaler till hyperpolarize cerebral endotelceller membranet potential (Vm)5,6,7. Således, det intima förhållandet mellan endotelceller [Ca2 +]jag och Vm är integrerad till blod flödesreglering och oumbärlig för hjärt- och cerebrovaskulär funktion6,8. Hela den breda litteraturen, har många studier rapporterat en sammanslutning av vaskulär endotelial dysfunktion med utvecklingen av kroniska sjukdomar (t.ex. hypertoni, diabetes, hjärtsvikt, kranskärlssjukdom, kronisk njursvikt, perifer artärsjukdom)9,10, som visar betydelsen av att studera endotelfunktion i såväl fysiologiska som patologiska förhållanden.

Vaskulära endotel är integrerad produktion av hyperpolarisering, vasodilatation och vävnadsperfusion och således undersökning av dess infödda cellulära egenskaper är avgörande. Som en allmän studie modell, har beredning av arteriell endothelial tube musmodell publicerats före för skelettmuskulaturen11,12, gut13, lung14, och nyligen det hjärna6. Studier av samtidiga [Ca2 +]jag och Vm mätningar har i synnerhet publicerats för skelettmuskulaturen arteriell endotel15,16 liksom lymfatiska kärl endotel17. Utöver primära studier utnyttjar metoden endothelial tube, kan en omfattande översyn av dess fördelar och nackdelar8 konsulteras för att avgöra om detta experimentella verktyg är lämpligt för en särskild studie. En fördel är i korthet att de viktiga fysiologiska komponenterna av endotelceller funktion lagras (t.ex., Ca2 + tillströmning och intracellulära release, hyperpolarisering av Vm upp till Nernst potential för K+ via SKCa/IKCa aktivering och endotel intercellulära koppling via gap föreningspunkter) utan störande faktorer såsom perivaskulär nerv input, glatt muskulatur spänningskänsliga kanal funktion och kontraktilitet, cirkulation av blod och hormonella influenser8. Däremot används ofta cell kultur metoder införa betydande förändringar i morfologi18 och ion kanal uttryck19 på ett sätt som avsevärt kan fördunkla jämförelser till fysiologiska observationer bestäms ex vivo eller in-vivo. Begränsningar inkluderar en bristande integration med andra väsentliga komponenter för att reglera blodflödet, till exempel muskulatur och begränsad flexibilitet i en experimentell schema, som denna modell testas optimalt inom 4 h intakt vaskulär segmentet isolering från djur.

Byggnad från en tidigare video protokollet författad av Socha och Segal12 och senaste experimentella utvecklingen i interimistiska6,15,16, Visa vi härmed isolering av färska endotel från bakre cerebrala artärer och samtidiga mätningar av endothelial [Ca2 +]jag och Vm med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive. Dessutom medför detta experiment kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Vi valde den bakre cerebral artären, som ger den isolerade endotel med strukturella integritet (celler tillsammans genom gap föreningspunkter) och tillräckliga dimensioner (bredd ≥ 50 µm, längd ≥300 µm) som är mottaglig för intra- och intercellulära signalering längs och bland endotelceller. Studier av den gnagare bakre cerebral artären är väsentligen representerade i litteraturen och dessutom omfatta undersökning av grundläggande endothelial signalering mekanismer, vaskulär utveckling/åldrande och patologi20, 21 , 22. denna experimentella ansökan förväntas ge en hög genomströmning analys av cerebral endotelfunktion (och dysfunktion) och därmed möjliggör betydande framsteg i förståelsen av blod flödesreglering i hela åldrande och utveckling av neurodegenerativa sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innan du utför följande experimenten, kontrollera att alla djurvård använder och protokoll är godkända av institutionella djur vård och använda kommittén (IACUC) och utförs i enlighet med National Research Council's Guide för skötsel och användning av Försöksdjur'' (8: e upplagan, 2011) och riktlinjerna som anländer. Den IACUC vid Loma Linda University har godkänt alla protokoll som används för detta manuskript för manliga och kvinnliga C57BL/6 möss (ålder: 3-30 mo).

1. utrustning och material

Obs: Detaljer för material som krävs för protokollet kan hittas i Tabellen av material, reagens, och manualer eller webbplatser som är associerade med respektive leverantörer.

  1. Flöde kammare
    1. Fäst en superfusion kammare med en glas täckglas botten till en anodiserad aluminium plattform. Säkra plattformen med kammare till en kompakt aluminium scen.
    2. Ställ in en micromanipulator i varje ände av plattformen på aluminium scenen för att hålla fastnålnings pipetten.
      Obs: Som ett praktiskt alternativ, Använd anslutningskontakten överlåtbara scenen med ett flöde kammare enhet säkrade för att underlätta övergången från isolering av endothelial röret till prestanda av experimenten.
  2. Mikroskop
    1. Användning stereomikroskop (5 x 50 x förstoring sortiment) utrustade med fiber optic ljuskällor för makro - och micro-dissektion förfaranden.
    2. För beredning av endothelial rör, Använd ett inverterat Mikroskop utrustat med fas kontrast eller differentialdelad störningar kontrast (DIC) kompatibla mål (10 x, 20 x och 40 x) och ett aluminium-Stadium.
    3. För att isolera endothelial rör från delvis smält blodkärl, placera en mikrosprutan pumpstyrningen intill endothelial tube förberedelse apparaten.
    4. För experimentell apparatur, använda en inverterade Mikroskop utrustade med standard mål (4 x och 10 x) förutom fluorescerande mål (20 x och 40 x, numeriska bländaröppningen 0,75) och en manuell aluminium scenen på ett bord för isolering av vibrationer.
  3. Intracellulära färdskrivare
    1. För att spela in den Vm av endotelceller i isolerade endothelial rör, Anslut elektrometer till den kompatibla headstage. Om det behövs ansluter du en funktionsgenerator eller stimulator till elektrometer för experiment som kräver nuvarande injektion.
    2. Anslut förstärkaren utgångar till ett system för datainsamling, hörbara baslinjen monitorer och ett oscilloskop. Säkra referenselektroden (Ag/Granulatfyllda pellets) nära avfarten flöde kammare under experiment.
    3. Använda en fotometriska system med integrerade komponenter för fluorescens system gränssnitt, hög intensitet Båglampa och makt leverans, hyperswitch, fotomultiplikatorn röret (eller PMT), och kameran att mäta [Ca2 +]jag i endotelceller.
    4. Använda en temperatur styrenhet utrustad med en inline värmare att höja och upprätthålla en fysiologisk temperatur (37 ° C) genom hela experimentet.
    5. Använd en sex-reservoaren plattform ansluten till en ventilregulatorn med en inline flödeskontrollventil för att kontroll av leverans av respektive lösningar till endotel röret säkrade i kammaren.
  4. Mikropipetter och skarpa elektroder
    Obs: För att tillverka pipetter för sönderdelning och mekaniska stabiliseringen av isolerade endothelial rör, Använd en elektronisk avdragare för att dra pipetterna och en mikro-smedja för att bryta och eld polering.
    1. För att separera adventitia, glatt muskulatur och endotel röret från delvis smält arteriell segment, förbereda sönderdelning pipetter (alla med en inre spets diameter 80-120 µm) i förekommande fall med hjälp av borosilikatglas kapillärrör, och brand polska spetsen.
    2. För att säkra endothelial röret mot botten av superfusion kammaren, använda fastnålnings pipetter med trubbiga, sfäriska ände (värme-polerad, OD 100 – 150 µm; beredd från tunnväggiga borosilikatglas rör).
    3. För att spela in Vm av en endotelceller, förbereda skarpa elektroder med ett tip motstånd ~ 150 ± 30 MΩ från glas kapillärrör med en elektronisk avdragare.

2. beredning av lösningar och droger

  1. Fysiologisk saltlösning (PSS)
    1. För ett experiment med läkemedelspreparat, förbereda minst 1 L PSS använder: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic syra (HEPES) och 10 mM glukos.
    2. För att förbereda de nödvändiga lösningarna för dissektion, förbereda isolering av cerebral artär och beredning av endothelial tube, PSS saknar CaCl2 (noll Ca2 + PSS).
    3. Förbereda alla lösningar i ultrarent avjoniserat H2O, justera pH till 7,4, sterilisera dem genom ett filter (0,22 µm porstorlek) och säkerställa att osmolalitet lösningar är mellan 290 och 300 mOsm.
      Obs: Lösningar kan lagras vid 4 ° C i cirka två veckor.
  2. 10% bovint serumalbumin (BSA)
    1. För att förbereda 10% BSA, lös upp 1 g av det frystorkade pulvret i en bägare av 10 mL noll Ca2 + PSS.
    2. Täck bägaren med paraffin film och låt under flera timmar att passera, med långsam omrörning för BSA att upplösa.
    3. Filtrera den slutliga lösningen med en 10 mL spruta plus ett 0,22 µm filter och göra 1 mL portioner ska lagras vid-20 ° C.
  3. Dissektion lösning
    1. För att förbereda 50 mL dissektion lösning, tillsätt 500 µL av BSA (10%) till 49,5 mL noll Ca2 + PSS.
    2. Omedelbart efter beredning, över dissektion lösningen i en petriskål för arteriell dissektion.
  4. Dissociation lösning
    1. För att förbereda dissociation lösning 50 mL, tillsätt 5 µL av CaCl2 (1 M) och 500 µL av BSA (10%) till 49,5 mL noll Ca2 + PSS. Låt lösningen stå i rumstemperatur (RT).
  5. Enzymer
    1. För partiell matsmältningen arteriell segment, förbereda 1 mL matsmältningen lösning med 0,31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL kollagenas (typ H blandning) och 0,13 mg/mL elastase.
      Obs: Enzymaktiviteter kan variera; dock för vår framgångsrika protokoll, kommersiellt medföljande Enzymaktiviteter har använts enligt följande: papain ≥10 enheter/mg; kollagenas ≥1 enheter/mg, för N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala eller FALGPA substrat omsättning; och elastase ≥ 5 enheter/mg.
  6. Beredning av Fura-2 och farmakologiska agenter
    1. Förbereda lager koncentration (1 mM) av Fura-2 AM färgämne i DMSO. Förbereda en arbetande koncentration (10 µM) genom att lägga 5 µL av lager till 495 µL av PSS för lastning.
    2. Bereda ≥50 mL arbetar koncentrationer av farmakologiska medel (t.ex. ATP) i PSS som är lämpligt.
  7. Bedriva lösning
    1. Förbereda en ledande lösning, 2 M KCl, genom upplösning KCl i avjoniserat H2O (7.455 g KCl i 50 mL H2O).
    2. Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter före återfyllning skarpa elektroderna.
  8. Propidium jodid (0,1%)
    1. Lös 10 mg frystorkade propidium jodid i 10 mL 2 M KCl.
    2. Blanda väl och förvara på RT.

3. dissektion och isolering av Cerebral artär

Obs: Alla dissektion procedurer kräver preparatet förstoring (upp till 50 x) via stereomikroskop och belysning som tillhandahålls av fiber optic ljuskällor. För att utföra dissektion förfaranden för isolering av hjärnan och artärer, använda vässade dissektion instrument. Lokalt verktyg att isolera och rengör artärer inkluderar vass spetsig pincett och Vännäs stil dissektion sax (3 till 9,5 mm blad).

  1. Isolering av mus hjärnan
    1. Söva en C57BL/6 mus (3-30 månader gamla, manlig eller kvinnlig) via inandning av isofluran (3% för 2 – 3 min) och sedan halshugga djuret omedelbart efter komplett induktion av anestesi. Placera huvudet i en petriskål (diameter 10 cm, djup 1,5 cm) som innehåller kall (4 ° C) noll Ca2 + PSS under ett stereomikroskop.
    2. Visning genom mikroskopet, ta bort huden och håret över skallen och överdriven blod med kalla noll Ca2 + PSS. Gör ett snitt med hjälp endast av tips standard dissektion sax (t.ex. 24 mm blad), börjar med Nackknölen och sträcker sig upp genom den nasala ben i skallen.
    3. Öppna skallen noga längs snittet med hjälp av grova-tipped pincett och separat bindväv för att isolera hjärnan med en intakt Circle of Willis.
      Obs: Alternativt kan Littauer ben-skärning tången användas till öppna skallen och utsätter hjärnan.
    4. Försiktigt tvätta isolerade hjärnan med kalla noll Ca2 + PSS i en bägare att avlägsna blod. Placera den hjärna ventrala sidan uppåt i en kammare som innehåller kall dissektion lösning för isolering av cerebrala artärer (figur 1A).
  2. Isolering av cerebrala artärer
    Obs: Den bakre cerebral artären har valts som en representativ cerebrovaskulär endotel studie modell för detta protokoll.
    1. Säkra isolerade hjärnan i kalla dissektion lösning med rostfritt stål stift (diameter 0,2 mm, längd ~ 11 – 12 mm) ska infogas i en kol-infunderas kisel polymer beläggning längst (djup ≥50 cm) ett glas petriskål.
    2. För att bibehålla en kyld temperatur på PSS under dissektion, Använd en dissektion kammare kyls av ett köldmedium system kontinuerligt cykling en 1:1 vatten-etylen glykol blandning. Alternativt, dissektion kan göras på färsk is.
    3. Kirurgiskt isolera bakre cerebrala artärer (~0.3 till 0,5 cm segment, ingen axiell spänning) från den bakre kommunicera och basilaris artärer med lokalt instrument Vännäs stil sax och vass spetsig pincett (figur 1B ). Använda rostfritt stål stift (diameter 0,1 mm, längd ~ 13 – 14 mm) till säkert både isolerade bakre cerebrala artärer i dissektion lösningen i petriskål (figur 1 c).
    4. Ren noggrant den isolera bakre cerebrala artärer genom att ta bort bindväv med vass spetsig pincett (figur 1 d). Skuren intakt artärer i segment (längd 1 – 2 mm) för enzymatisk nedbrytning (figur 1 d, infälld).

4. beredning av Endothelial Tube och Superfusion

Obs: Endothelial röret är beredd som tidigare beskrivits12, med ändringar för cerebral artär6.

  1. Förbered trituration apparaten med Mikroskop utrustat med mål (10 x, 20 x och 40 x), en kamera och en aluminium scenen håller en kammare och micromanipulators. Säkra en mikrosprutan med en pump controller bredvid scenen och preparatet (figur 2A).
  2. Helt återfyllning en sönderdelning pipett med mineralolja och säkra den över mikro-sprutan kolven. Sedan, med hjälp av mikro-spruta med pumpstyrningen, dra upp dissociation lösning i pipetten (~ 130 nl) ovanpå mineralolja samtidigt frånvaro av luftbubblor i pipetten.
  3. Placera intakt arteriell segment i 1 mL av dissociation lösning i en 10 mL glasrör (figur 2B), som innehåller 0,31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL kollagenas och 0,13 mg/mL elastase. Inkubera vid 34 ° C i 10 – 12 min för partiell matsmältningen.
  4. Efter matsmältningen, ersätta enzym lösningen med ~ 5 mL färsk dissociation. Med 1 mL pipett överföra ett segment i en kammare som innehåller dissociation lösningen på RT.
  5. Placera pipetten i dissociation lösningen i kammaren och placera den nära ena änden av smält fartyget. Ställa in en kurs inom spänna av 2 till 5 nL/s på pumpen controller för skonsam sönderdelning (figur 2 c, infälld).
  6. När du tittar igenom 100 x 200 x förstoring, återkalla och mata ut det arteriell segmentet för att dissociera glatta muskelceller samtidigt som det producerar en endothelial röret. Om nödvändigt, noggrant använda spetsig pincett för att separat dissocierade adventitia och intern elastisk lamina från endotelceller röret. Bekräfta att alla glatta muskelceller dissocieras och att endast endothelial celler förbli som en intakt ”tube” (figur 2 c).
  7. Använder micromanipulators, säkra varje ände av endothelial röret på glas cover slip superfusion avdelning med hjälp av borosilikatglas fästa pipetter (figur 2D).
  8. Wash-out separerade adventitia och glatta muskelceller från plenisalen och ersätt dissociation lösningen med 2 mM CaCl2 PSS. Överföra den mobila plattformen med säkrade endothelial röret på mikroskopet superfusion och experimentell rigg.
  9. Använd 6 ren 50 mL cisterner (figur 3A) för kontinuerlig leverans av PSS och respektive drog lösningar under experimentet, som är lämpligt. Använd den inline flödeskontrollventil manuellt ställa in flödet i hela som överensstämmer med laminärt flöde medan matchande flöde foder till dammsugning. Leverera PSS till kammaren (figur 3B) för superfusion av endothelial röret för ≥ 5 min innan inspelning bakgrundsdata och färgämne lastning.

5. färgämne belastning, Wash-Out och temperaturinställningar

  1. Slå på alla komponenter av fotometri systemet för mätning [Ca2 +]jag. Använda mikroskopet på experimentell riggen (figur 3 c) för att Visa endothelial röret på 400 x förstoring, och fokus på celler i fönstret fotometriska använda fotometri system software suite.
  2. Mät diametern på endotelceller röret och registrera autofluorescens bakgrundsnivåer i accord med 510 nm utsläpp under alternativa excitation vid 340 och 380 nm (≥10 Hz).
  3. För att mäta [Ca2 +]jag svaren, belastning endothelial röret med Fura-2 AM dye (10 µM slutlig koncentration) på RT och tillåta ~ 30 – 40 min i avsaknad av ljus.
  4. Starta om superfusion av endothelial röret med färska PSS för ~ 30 – 40 min till wash-out överskott färgämne och tillåta intracellulära Fura-2 är att de esterify. Under wash-out period, höja temperaturen gradvis från RT till 37 ° C med en inline värmare tempereringsaggregatet (figur 3A) och sedan underhålla vid 37 ° C under hela försöket.
    Obs: Rekommenderade inkrementell övergången mellan RT till 37 ° C omfattar tre steg (t.ex. 5 ° C) med ≥5 min Jämviktstiden tid vid varje steg.

6. samtidig mätning av [Ca2 +]jag och Vm

  1. Slå på all annan utrustning och elektrometer software suite för att mäta Vm (se figur 3, figur 4). Justera förvärv datahastighet (≥10 Hz).
  2. Dra en skarp elektrod och återfyllning med 2 M KCl. För studier av intercellulära koppling via dye överföring, återfyllning av mikroelektroder med 0,1% propidium jodid upplöst i 2 M KCl.
  3. Säkra elektroden över en silvertråd belagd med klorid i pipett innehavaren bifogas ett elektrometer huvud Stadium säkrat med en micromanipulator. Använda micromanipulator till kort Placera spetsen på elektroden in flödande PSS i kammaren när du tittar igenom syftet 4 x.
  4. Ange 0 som överensstämmer med jordat bad den vilande Vm potentiella. Placera spetsen på elektroden bara över en cell av endothelial röret. Om så önskas använda hörbara baslinjen bildskärmar kopplade till elektrometrar för att associera ljud pitch med potentiella inspelningar.
  5. Öka förstoringen till 400 x med målsättningen 40 x och åter Placera spetsen på elektroden som behövs. Justera fönstret fotometriska med programvaran fotometri för att fokusera på ~ 50 till 80 endotelceller.
  6. Försiktigt placera elektroden i en av cellerna av endothelial röret med hjälp av micromanipulator och vänta ≥ 2 min för Vila Vm att stabilisera. Anslut en andra elektrod i en annan cell (avstånd ≥100 µm) från den första cellen spetsad med första elektrod.
  7. När Vila Vm är stabilt på dess förväntade värden (-30 till -40 mV)6, slå på PMT på gränssnittet fluorescens i frånvaro av ljus och påbörja förvärv av intracellulära [Ca2 +]jag av spännande Fura-2 växelvis (10 Hz) på 340 och 380 nm samtidigt samla fluorescens utsläpp på 510 nm.
    Obs: Att testa intercellulära elektrisk koppling, nuvarande (± 0,5-3 nA, ~ 20 s pulslängd) kan levereras via en elektrometer som ”sida 1”, och ändringar av Vm kan registreras med en annan elektrometer som ”plats 2” (avstånd ≥100 µm).
  8. När samtidiga mätningar av Vm och [Ca2 +]jag är etablerade, Tillåt ~ 5 min för superfusion av endothelial röret med PSS vid en konstant laminärt flöde före applicering av droger.
  9. Applicera läkemedlet (t.ex. ATP) beredd PSS superfusion kammaren med det konstant flödet. Efter ~ 3 min (eller en tidsperiod som är lämplig för kineticsen av drogen) återvända tvätta med PSS tills Vm och F340f380 förhållandet till deras baslinjen villkor. Markera respektive inspelningar som temporally synkroniserade över fotometer och elektrometer programvara sviter under varje övergång av lösningar.
  10. När experimentet är gjort, frånträda till cellen med micromanipulator elektrod och märker Vm ~ 0 mV som refereras av bad elektroden. Stoppa respektive inspelningar av Vm och [Ca2 +]jag och spara posterna på fil för dataanalys.

7. visualisering av Cell-till-Cell koppling

  1. För att visualisera cell till cell koppling via propidium jodid, Använd en 40 x eller 60 x fluorescerande mål med en relativt hög numerisk bländare (t.ex. 0,95) och rodamin filter set med solid-state belysning, en högupplöst kamera (t.ex. 16- megapixlar), och en imaging software suite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den schematiska demonstrationen av det protokoll som beskrivs ovan är visas i bifogade figurer. En hjärna som isolerats från en ung vuxen manlig C57BL/6N mus (5 månader) visas i figur 1A. Bakre cerebrala artärer är omsorgsfullt isolerade från den Circle of Willis, tas bort utan bindväv och skuren i segment (figur 1B-D). Från delvis smält arteriell segment, intakt endotel röret produceras och säkrade på glas cover slip använder fastnålnings pipetter. Mild mekanisk stretch appliceras med hjälp av två fastnålnings pipetter för att approximera linjär invivo längd utan fartyget tortuosity. Detta har ytterligare förtydligats i manuskriptet (figur 2A-D). Endothelial rören isoleras från bakre cerebrala artärer är ~ 90 – 100 µm i bredd och ≥300 µm i längd. Röret är laddad med Fura-2 AM följt av wash-out med PSS. Samtidig mätning av [Ca2 +]jag och Vm i endotel röret utförs av Ca2 + fotometri samt skarpa elektrod elektrofysiologi (experimental rigg visas i figur 3 och figur 4).

Funktionell bedömning av endothelial röret utförs genom att tillämpa en klassisk endothelial GPCR agonist såsom ATP in i flödet kammaren under fysiologiska betingelser. I figur 5visas [Ca2 +]jag och Vm registreras samtidigt som svar på ATP (100 µM). En betydande hyperpolarisering av Vm (≥5 mV) sker samtidigt med en intracellulär [Ca2 +]jag ökning, som visar att en ökning av [Ca2 +]jag aktiverar SKCa/IKCa -kanaler och därmed tillåter K+ efflux över plasmamembranet att producera EDH. Bevis av intercellulära koppling använder aktuella injektion (± 0,5 till 3 nA, ~ 20 s pulser) kan hittas i vår nyligen publicerade arbete (referens6, figur 1). Observera att propidium jodid har en massa ~ 668 Da med hänvisning till andra linjens budbärare känd för passerar genom gap-junctions som inositol trisphosphate (IP-3, ~ 420 Da), cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP, ~ 329 Da).

Figure 1
Figur 1 : Isolering av cerebral artär från hjärnan. (A) hjärnan isolerade med intakt artärer (den vita pilen visar den bakre cerebral artären) i dessection lösning. (B) förstorad Visa av bakre cerebral artär (vit pil; ~ 3 x vs. Panel A). (C) isolerad bakre cerebrala artärer säkrade med rostfritt stål stift i preparatet maträtt. (D) bakre cerebrala artärer följande avlägsnande av bindväv. Infälld visar skär segment av artärer; Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Beredning av cerebral endotelceller tube. (A) utrustning som används för triturating delvis smält arteriell segment; en = micromanipulator, b = kammare för att förbereda tube, c = aluminium scenen, d = mikrosprutan, e = Mikroskop, f = mikrosprutan pumpstyrningen. (B) arteriell segment (vita pilar) i lösning för enzymatisk nedbrytning. (C) Endothelial rör utarbetats av sönderdelning; en = sönderdelning pipett, b = intakt endotel tube. Infälld visar trituration processen att ta bort adventitia och glatta muskelceller; Skalstapeln = 100 µm. (D) en intakt endotel tube säkrade på glas cover slip med fastnålnings pipett; en = fästa pipett, b = intakt endotel rör med diameter på ~ 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Utrustning för superfusion och samtidiga [Ca2 +] jag och V m mätningar. (A) utrustning för superfusion av endothelial röret och temperaturkontroll, en = hög intensitet Båglampa strömförsörjning, b = fluorescens systemgränssnitt, c = temperaturregulator, d = sex-reservoarer av superfusion system, e = fiber optic light källor, f = ventilregulatorn, g = hyperswitch [Ca2 +]jag fotometri system. (B) Superfusion kammare apparater; en och b = headstages, c = marken elektrod, d = inline värmare, e = superfusion slangar, f = vakuum sug, g = superfusion kammare, h = aluminium scenen håller kammaren. (C) experimentell plattform på en vibrationer isolering tabell; en = cell inramning adapter med kamera, b = Mikroskop ljus, c = Mikroskop, d = aluminium scenen, e = micromanipulator för headstage kontroll, f = vibrationer isolering tabell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Utrustning för elektrofysiologi och dataregistrering. en = oscilloskop, b = funktionsgenerator, c = hörbara baslinjen monitor, d = 50/60 Hz brusfilter, e och f = elektrometrar, g = system för datainsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Samtidiga [Ca2 +] jag och V m inspelningar. (A) Differential störningar kontrast bild (400 x) av en mus cerebral arteriell endothelial tube justerat för experiment fotometriska fönster med hjälp av ett 40 x-objektiv. En skarp elektrod placeras i en cell som visas överst i bilden (vit pil). (B) Raw spår för samtidig mätning av F340f380 baserat (överst) och Vm (nederst) som svar på ATP (100 µM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mot bakgrund av senaste utvecklingen6,15,16,17visar vi nu metoden för att isolera mus cerebral arteriell endotel i förberedelse för samtidig mätning av [Ca2 +] jag och Vm underliggande EDH konsekvent för ~ 2 timmar vid 37 ° C. Även om det är tekniskt svårt, kan vi mäta cell till cell koppling samt (se referens6, figur 1). På så sätt kan vi mäta diskret och genomförda signalering händelser samtidigt. För en redogörelse för de allmänna utmaningar samtidigt isolera mus arteriell endotel konsultera referenser11,12. Vi betonar kritiska steg för att isolera mus cerebrala artärer, vår särskilda mätningar av endothelial [Ca2 +]jag och Vm, förslag på felsökning och överväganden för alternativa metoder mot bakgrund experimentell styrkor/svagheter nedan.

Den bakre cerebral artären kräver noggrann isolering från Circle of Willis och bindväv utan skador till glatt muskulatur och endotelceller. Kirurgiska verktyg (pincett och sax) bör vara lämplig för mus mikrocirkulationen dissektion förfaranden förs med rena, skarpa kanter. Relativ till skelettmuskulaturen12, vi halveras tidsperioden för enzymatisk inkubation av två tredjedelar och koncentrationer av papain, kollagenas och dithioerythritol när du lägger till användning av ett empiriskt optimerad koncentration av elastase. För konsekvent framgång isolera cerebral arteriell endothelial rör, är det viktigt att beställa enzymer i omgångar (2 till 4 flaskor) från välrenommerade leverantör med konsekvent tillverkningssed i enlighet med frekvensen av användning och hållbarhet. Även med potential för variation i enzymaktivitet från en massa enzym till nästa föreslås det att enzymet koncentrationer upprätthållas samtidigt optimera tiden för matsmältningen inom 10-12 min. Det är värt att notera att varken kön eller ålder på djuret (3-30 månader) har varit en betydande barriär till utarbetandet av isolerade endotel från cerebrala artärer i vår erfarenhet. Det rekommenderas således att sammansättningen av enzymet cocktail och tid av enzymet matsmältningen förblir detsamma i studier på ålder och kön.

Som betonad, krävs försiktighet under skonsam sönderdelning och isolering av endotel från adventitia och spolformad glatta muskelceller för att undvika skador på endotelceller12. För det trituration steget fungerar trögflytande mineralolja som hydrauliska medium mellan pistongen av mikro-sprutan och vattenhaltiga PSS för att återkalla eller mata ut fartygssegment badar i PSS. Det bör noteras att om segmentet fartyg kontakter mineralolja, detta steg upprepas med ren sönderdelning pipett med sekventiell återfyllning av mineralolja och PSS. Innan ett experiment rekommenderas det att en ungefär linjär i vivo längd återställas till endotel röret så långt som möjligt, varigenom enskilda celler anta en ”platt”, längsgående morfologi (t.ex. diameter ~ 5 µm; längd ~ 100 µm; tjocklek ~0.5 µm)8. Axiell spänning bör dock inte tillämpas i den utsträckning där celler vid kanterna av preparatet drar bort från under respektive fastnålnings pipetter och därmed kompromissa mekanisk stabilitet för pålitlig cellulära mätningar under de experimentera.

Den fotometriska [Ca2 +]jag mätsystem som används i denna teknik är lämplig för kontinuerliga mätningar av endothelial [Ca2 +]jag använder proportionerlig Fura-2 färgämne. Enskilda protokoll kan vanligtvis pågå ≥10 min utan betydande fotoblekning. Vidare, vi vanligtvis använder denna metod för att mäta [Ca2 +]jag eftersom det är mottagliga för lägligt pauser i datainsamling och frekventa förflyttningar av Mikroskop mål som behövs för att säkra skarpa elektroder för Vm mätningar. Observera att detta är en fotometrisk metod som bara fångar globala, i genomsnitt [Ca2 +]jag bland flera celler. I allmänhet för [Ca2 +]jag mätningar rekommenderar vi fotometri för inledande karakterisering av endotelceller Svaren till farmakologiska medel (t.ex., tid under peak och platå faser) samtidigt planer på att Fortsätt att kvantifiera microdomain signalering händelser med hjälp av standard confocal eller multiphoton mikroskopi12,23.

Den skarpa elektrod elektrofysiologi strategin är mottaglig för integrerad Vm inspelningar i fysiologiska flercelliga preparat. Mätning av intracellulära Vm är överlägset den mest tekniskt utmanande med många kritiska steg som kan underlätta eller utplåna framgång av mätningar. Först experimenter behöver fastställa optimal programvillkor på en glas avdragare för konsekvent tillverkning vass elektroder med ett tip motstånd ~ 150 ± 30 MΩ. Med en glödtråd värme ramp test läsning som referens, rekommenderas det att experimenter fastställa parametrar empiriskt, särskilt med avseende på variationer i inställningen ”värme” samtidigt maximera tiden av pull. Nästa, mekanisk stabilitet av micromanipulators, headstages, pipett innehavare och preparatet är helt avgörande. Förutom uppenbara nödvändigheten för en vibrationer isolering tabell, kommer att försöksledaren behöva se till att alla kopplingar är säkra och att scenområdet runt och under manipulatorer är ren. Idealiskt, ovidkommande brus bör minskas i den utsträckning som upplösningen av skarpa elektrod inspelningar är inom 1 mV. Vår erfarenhet är den vanligaste källan till buller silvertråd säkrade i hållaren pipett som är i behov av en tillräcklig klorid beläggning eller ersättning helt och hållet. Om vanliga 50/60 Hz buller, ”hum ljuddämpning” teknik kan användas och levereras som standard med en modern elektrometer. Om buller visas helt ohanterligt, kontrollera om det finns en läcka i badet eller spill där PSS kommer i kontakt med motstånd för temperaturkontroll. Om komplikationer förblir med förvärva en stabil Vm signal, kontrollera integriteten för elektriska sladdar och t-kontakter.

Helt och hållet, om fastställande av en skarp elektrod inspelning är misslyckat, är det vanligen på grund av en olämplig elektrod, mekanisk instabilitet eller dålig cellulär hälsa. Alternativt kan experimenter också vill överväga en konfiguration av patch-clamp teknik på enskilda, elektriskt uncoupled celler där information om hela cellen strömmar och enda Jonen kanaliserar inspelningar kan erhållas. Även om inför allmänna utmaningar med att använda ett fluorescerande färgämne (t.ex., heterogena intracellulära lastning, blekning, kalibrering med jonoforer, blygsamma upptäckt upplösning), färgämnen spänningskänsliga såsom Di-8-ANEPPS är också kommersiellt tillgängliga.

Vår förståelse av endotel i blod flödesreglering till och hela hjärnan är avgörande med en snabbt åldrande befolkning och ökande förekomsten av kronisk hjärt- och neurodegenerativa sjukdomar. Således, vi tillhandahåller en metod för att isolera intakt endotel från en vital cerebral artär, som kan anpassas till andra vaskulära strukturer i hjärnan. Dessutom visar vi en användbar strategi för samtidiga mätningar av underliggande [Ca2 +]jag och Vm. Slutligen kan använder dubbla intracellulära elektroder, cell-till-cell koppling genom gap föreningspunkter också bedömas. Med noggrant planerade farmakologiska och/eller genetiska insatser omfattar det nuvarande protokollet rimligen och kvantitativt studiet av cerebral endotelfunktion i sin ursprungliga form. Vår förhoppning är att praktiker kommer att bygga från och anpassa denna information för att främja vaskulär biologi och neurovetenskap i allmänhet. Det vore särskilt tillfredsställande att se gemensamma experimentella kamper med elektriska mätningar minimerat alldeles. Men detta protokoll inte är en fristående uppsättning tekniker på något sätt, det kan användas som en kompletterande strategi att avgöra exakt hur endothelial biofysiska bestämningsfaktorer översätta till förändringar i vaskulär resistens och hur de finjustera förordning av blodflödet i förhållande till förhållanden som är representativa för hälsa vs. sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Charles Hewitt för utmärkt tekniskt bistånd samtidigt fastställa utrustning och förnödenheter som behövs för de aktuella protokollen. Vi tackar Drs. Sean M. Wilson och Christopher G. Wilson, från LLU Center för Perinatal biologi, för att ge oss en ytterligare inverterade mikroskopet och elektrometer, respektive. Denna forskning har stötts av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) och nya fakultetsmedel för start-up Loma Linda University School of Medicine. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).
Samtidiga mätningar av intracellulära kalcium och membranpotentialen i nyligen isolerade och intakt mus Cerebral endotel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter