Här finns protokoll för (1) nymalen isolera intakt cerebral endotelceller ”rör” och (2) samtidiga mätningar av endothelial kalcium och membranpotential som under endotel-derived hyperpolarisering. Dessutom tillåter dessa metoder för farmakologiska trimning av endotelceller kalcium och elektrisk signalering som enskilda eller interaktiva experimentella variabler.
Cerebrala artärer och deras respektive mikrocirkulationen leverera syre och näringsämnen till hjärnan via blod flöde förordningen. Endotelceller linje lumen av blodkärl och kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller. Primära endothelial-beroende signalvägar av hyperpolarisering av membranpotentialen (Vm) och kväveoxid normalt i drift parallellt att medla vasodilatation och därmed öka blodflödet. Även om integrerad att samordna vasodilatation över flera millimetrar av vaskulär längd, har komponenter av endotel-derived hyperpolarisering (EDH) varit historiskt svårt att mäta. Dessa komponenter i EDH medför intracellulära Ca2 + [Ca2 +]jag ökar och efterföljande aktivering av små – och mellanliggande konduktans Ca2 +-aktiverade K+ (SKCa/IKCa) kanaler.
Här presenterar vi en förenklad illustration av isoleringen av färska endotel från mus cerebrala artärer; samtidiga mätningar av endothelial [Ca2 +]jag och Vm med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive; och en kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Bakre cerebrala artärer från Circle of Willis avlägsnas den bakre kommunicera och basilaris artärerna. Enzymatisk nedbrytning av rengjorda posterior cerebral arteriell segment och efterföljande sönderdelning underlättar borttagning av adventitia, perivaskulär nerver och glatta muskelceller. Resulterande posterior cerebral arteriell endothelial ”tuber” säkras sedan i Mikroskop och granskas med hjälp av en kamera, fotomultiplikatorn röret, och en till två elektrometrar medan under kontinuerlig superfusion. Sammantaget kan denna metod samtidigt mäta förändringar i endotel [Ca2 +]jag och Vm i diskreta cellulära platser, förutom att sprida EDH genom gap-junctions upp till millimeters avstånd längs intakt endotelet. Denna metod förväntas ge en hög genomströmning analys av hjärnfunktionerna endothelial underliggande mekanismer av blod flödesreglering i normal och sjuka hjärnan.
Blodflödet i hela hjärnan regleras samordningen av vasodilatation bland cerebrala artärer och arterioler i vaskulär nätverk1. Endothelial celler som kantar cerebral motstånd artärer kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller1,2,3. I synnerhet under endotel-derived hyperpolarisering (vanligen kallas EDH), intracellulära Ca2 + ([Ca2 +]jag) och elektrisk signalering i endotelceller samordna vasodilatation bland endothelial celler och deras omgivande glatta muskelceller genom gap-junctions för arteriell avkoppling4. Fysiologiska inledandet av EDH sekventiellt innebär stimulering av Gq-kopplade receptorer (varandra), en ökning i [Ca2 +]jag, och aktivering av endotel små – och intermediate-Ca2 +-aktiverade K+ (SKCa/IKCa) kanaler till hyperpolarize cerebral endotelceller membranet potential (Vm)5,6,7. Således, det intima förhållandet mellan endotelceller [Ca2 +]jag och Vm är integrerad till blod flödesreglering och oumbärlig för hjärt- och cerebrovaskulär funktion6,8. Hela den breda litteraturen, har många studier rapporterat en sammanslutning av vaskulär endotelial dysfunktion med utvecklingen av kroniska sjukdomar (t.ex. hypertoni, diabetes, hjärtsvikt, kranskärlssjukdom, kronisk njursvikt, perifer artärsjukdom)9,10, som visar betydelsen av att studera endotelfunktion i såväl fysiologiska som patologiska förhållanden.
Vaskulära endotel är integrerad produktion av hyperpolarisering, vasodilatation och vävnadsperfusion och således undersökning av dess infödda cellulära egenskaper är avgörande. Som en allmän studie modell, har beredning av arteriell endothelial tube musmodell publicerats före för skelettmuskulaturen11,12, gut13, lung14, och nyligen det hjärna6. Studier av samtidiga [Ca2 +]jag och Vm mätningar har i synnerhet publicerats för skelettmuskulaturen arteriell endotel15,16 liksom lymfatiska kärl endotel17. Utöver primära studier utnyttjar metoden endothelial tube, kan en omfattande översyn av dess fördelar och nackdelar8 konsulteras för att avgöra om detta experimentella verktyg är lämpligt för en särskild studie. En fördel är i korthet att de viktiga fysiologiska komponenterna av endotelceller funktion lagras (t.ex., Ca2 + tillströmning och intracellulära release, hyperpolarisering av Vm upp till Nernst potential för K+ via SKCa/IKCa aktivering och endotel intercellulära koppling via gap föreningspunkter) utan störande faktorer såsom perivaskulär nerv input, glatt muskulatur spänningskänsliga kanal funktion och kontraktilitet, cirkulation av blod och hormonella influenser8. Däremot används ofta cell kultur metoder införa betydande förändringar i morfologi18 och ion kanal uttryck19 på ett sätt som avsevärt kan fördunkla jämförelser till fysiologiska observationer bestäms ex vivo eller in-vivo. Begränsningar inkluderar en bristande integration med andra väsentliga komponenter för att reglera blodflödet, till exempel muskulatur och begränsad flexibilitet i en experimentell schema, som denna modell testas optimalt inom 4 h intakt vaskulär segmentet isolering från djur.
Byggnad från en tidigare video protokollet författad av Socha och Segal12 och senaste experimentella utvecklingen i interimistiska6,15,16, Visa vi härmed isolering av färska endotel från bakre cerebrala artärer och samtidiga mätningar av endothelial [Ca2 +]jag och Vm med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive. Dessutom medför detta experiment kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Vi valde den bakre cerebral artären, som ger den isolerade endotel med strukturella integritet (celler tillsammans genom gap föreningspunkter) och tillräckliga dimensioner (bredd ≥ 50 µm, längd ≥300 µm) som är mottaglig för intra- och intercellulära signalering längs och bland endotelceller. Studier av den gnagare bakre cerebral artären är väsentligen representerade i litteraturen och dessutom omfatta undersökning av grundläggande endothelial signalering mekanismer, vaskulär utveckling/åldrande och patologi20, 21 , 22. denna experimentella ansökan förväntas ge en hög genomströmning analys av cerebral endotelfunktion (och dysfunktion) och därmed möjliggör betydande framsteg i förståelsen av blod flödesreglering i hela åldrande och utveckling av neurodegenerativa sjukdomar.
Mot bakgrund av senaste utvecklingen6,15,16,17visar vi nu metoden för att isolera mus cerebral arteriell endotel i förberedelse för samtidig mätning av [Ca2 +] jag och Vm underliggande EDH konsekvent för ~ 2 timmar vid 37 ° C. Även om det är tekniskt svårt, kan vi mäta cell till cell koppling samt (se referens6, figur 1). På s?…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Charles Hewitt för utmärkt tekniskt bistånd samtidigt fastställa utrustning och förnödenheter som behövs för de aktuella protokollen. Vi tackar Drs. Sean M. Wilson och Christopher G. Wilson, från LLU Center för Perinatal biologi, för att ge oss en ytterligare inverterade mikroskopet och elektrometer, respektive. Denna forskning har stötts av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) och nya fakultetsmedel för start-up Loma Linda University School of Medicine. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
MgCl2 | Sigma | M2670 | |
CaCl2 | Sigma | 223506 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Elastase | Sigma | E7885 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |