Samtidiga mätningar av intracellulära kalcium och membranpotentialen i nyligen isolerade och intakt mus Cerebral endotel

Summary

Här finns protokoll för (1) nymalen isolera intakt cerebral endotelceller ”rör” och (2) samtidiga mätningar av endothelial kalcium och membranpotential som under endotel-derived hyperpolarisering. Dessutom tillåter dessa metoder för farmakologiska trimning av endotelceller kalcium och elektrisk signalering som enskilda eller interaktiva experimentella variabler.

Abstract

Cerebrala artärer och deras respektive mikrocirkulationen leverera syre och näringsämnen till hjärnan via blod flöde förordningen. Endotelceller linje lumen av blodkärl och kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller. Primära endothelial-beroende signalvägar av hyperpolarisering av membranpotentialen (V_m) och kväveoxid normalt i drift parallellt att medla vasodilatation och därmed öka blodflödet. Även om integrerad att samordna vasodilatation över flera millimetrar av vaskulär längd, har komponenter av endotel-derived hyperpolarisering (EDH) varit historiskt svårt att mäta. Dessa komponenter i EDH medför intracellulära Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_jag ökar och efterföljande aktivering av små – och mellanliggande konduktans Ca^{2 +}-aktiverade K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanaler.

Här presenterar vi en förenklad illustration av isoleringen av färska endotel från mus cerebrala artärer; samtidiga mätningar av endothelial [Ca^{2 +}]_jag och V_m med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive; och en kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Bakre cerebrala artärer från Circle of Willis avlägsnas den bakre kommunicera och basilaris artärerna. Enzymatisk nedbrytning av rengjorda posterior cerebral arteriell segment och efterföljande sönderdelning underlättar borttagning av adventitia, perivaskulär nerver och glatta muskelceller. Resulterande posterior cerebral arteriell endothelial ”tuber” säkras sedan i Mikroskop och granskas med hjälp av en kamera, fotomultiplikatorn röret, och en till två elektrometrar medan under kontinuerlig superfusion. Sammantaget kan denna metod samtidigt mäta förändringar i endotel [Ca^{2 +}]_jag och V_m i diskreta cellulära platser, förutom att sprida EDH genom gap-junctions upp till millimeters avstånd längs intakt endotelet. Denna metod förväntas ge en hög genomströmning analys av hjärnfunktionerna endothelial underliggande mekanismer av blod flödesreglering i normal och sjuka hjärnan.

Introduction

Blodflödet i hela hjärnan regleras samordningen av vasodilatation bland cerebrala artärer och arterioler i vaskulär nätverk¹. Endothelial celler som kantar cerebral motstånd artärer kommando förändringar i vaskulär diameter som behövs för att möta den metaboliska efterfrågan av nervceller^1,2,3. I synnerhet under endotel-derived hyperpolarisering (vanligen kallas EDH), intracellulära Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_jag) och elektrisk signalering i endotelceller samordna vasodilatation bland endothelial celler och deras omgivande glatta muskelceller genom gap-junctions för arteriell avkoppling⁴. Fysiologiska inledandet av EDH sekventiellt innebär stimulering av G_q-kopplade receptorer (varandra), en ökning i [Ca^{2 +}]_jag, och aktivering av endotel små – och intermediate-Ca^{2 +}-aktiverade K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanaler till hyperpolarize cerebral endotelceller membranet potential (V_m)^5,6,7. Således, det intima förhållandet mellan endotelceller [Ca^{2 +}]_jag och V_m är integrerad till blod flödesreglering och oumbärlig för hjärt- och cerebrovaskulär funktion^6,8. Hela den breda litteraturen, har många studier rapporterat en sammanslutning av vaskulär endotelial dysfunktion med utvecklingen av kroniska sjukdomar (t.ex. hypertoni, diabetes, hjärtsvikt, kranskärlssjukdom, kronisk njursvikt, perifer artärsjukdom)^9,10, som visar betydelsen av att studera endotelfunktion i såväl fysiologiska som patologiska förhållanden.

Vaskulära endotel är integrerad produktion av hyperpolarisering, vasodilatation och vävnadsperfusion och således undersökning av dess infödda cellulära egenskaper är avgörande. Som en allmän studie modell, har beredning av arteriell endothelial tube musmodell publicerats före för skelettmuskulaturen^11,12, gut¹³, lung¹⁴, och nyligen det hjärna⁶. Studier av samtidiga [Ca^{2 +}]_jag och V_m mätningar har i synnerhet publicerats för skelettmuskulaturen arteriell endotel^15,16 liksom lymfatiska kärl endotel¹⁷. Utöver primära studier utnyttjar metoden endothelial tube, kan en omfattande översyn av dess fördelar och nackdelar⁸ konsulteras för att avgöra om detta experimentella verktyg är lämpligt för en särskild studie. En fördel är i korthet att de viktiga fysiologiska komponenterna av endotelceller funktion lagras (t.ex., Ca^{2 +} tillströmning och intracellulära release, hyperpolarisering av V_m upp till Nernst potential för K⁺ via SK_Ca/IK_Ca aktivering och endotel intercellulära koppling via gap föreningspunkter) utan störande faktorer såsom perivaskulär nerv input, glatt muskulatur spänningskänsliga kanal funktion och kontraktilitet, cirkulation av blod och hormonella influenser⁸. Däremot används ofta cell kultur metoder införa betydande förändringar i morfologi¹⁸ och ion kanal uttryck¹⁹ på ett sätt som avsevärt kan fördunkla jämförelser till fysiologiska observationer bestäms ex vivo eller in-vivo. Begränsningar inkluderar en bristande integration med andra väsentliga komponenter för att reglera blodflödet, till exempel muskulatur och begränsad flexibilitet i en experimentell schema, som denna modell testas optimalt inom 4 h intakt vaskulär segmentet isolering från djur.

Byggnad från en tidigare video protokollet författad av Socha och Segal¹² och senaste experimentella utvecklingen i interimistiska^6,15,16, Visa vi härmed isolering av färska endotel från bakre cerebrala artärer och samtidiga mätningar av endothelial [Ca^{2 +}]_jag och V_m med Fura-2 fotometri och intracellulära skarpa elektroder, respektive. Dessutom medför detta experiment kontinuerlig superfusion av saltlösningar och farmakologiska agenter under fysiologiska betingelser (pH 7,4, 37 ° C). Vi valde den bakre cerebral artären, som ger den isolerade endotel med strukturella integritet (celler tillsammans genom gap föreningspunkter) och tillräckliga dimensioner (bredd ≥ 50 µm, längd ≥300 µm) som är mottaglig för intra- och intercellulära signalering längs och bland endotelceller. Studier av den gnagare bakre cerebral artären är väsentligen representerade i litteraturen och dessutom omfatta undersökning av grundläggande endothelial signalering mekanismer, vaskulär utveckling/åldrande och patologi^{20, 21 , 22}. denna experimentella ansökan förväntas ge en hög genomströmning analys av cerebral endotelfunktion (och dysfunktion) och därmed möjliggör betydande framsteg i förståelsen av blod flödesreglering i hela åldrande och utveckling av neurodegenerativa sjukdomar.

Protocol

Innan du utför följande experimenten, kontrollera att alla djurvård använder och protokoll är godkända av institutionella djur vård och använda kommittén (IACUC) och utförs i enlighet med National Research Council’s ”Guide för skötsel och användning av Försöksdjur” (8: e upplagan, 2011) och riktlinjerna som anländer. Den IACUC vid Loma Linda University har godkänt alla protokoll som används för detta manuskript för manliga och kvinnliga C57BL/6 möss (ålder: 3-30 mo).<…

Representative Results

Den schematiska demonstrationen av det protokoll som beskrivs ovan är visas i bifogade figurer. En hjärna som isolerats från en ung vuxen manlig C57BL/6N mus (5 månader) visas i figur 1A. Bakre cerebrala artärer är omsorgsfullt isolerade från den Circle of Willis, tas bort utan bindväv och skuren i segment (figur 1B-D). Från delvis smält arteriell segment, intakt endotel röret produceras och säkrade p…

Discussion

Mot bakgrund av senaste utvecklingen^6,15,16,17visar vi nu metoden för att isolera mus cerebral arteriell endotel i förberedelse för samtidig mätning av [Ca^{2 +}] _jag och V_m underliggande EDH konsekvent för ~ 2 timmar vid 37 ° C. Även om det är tekniskt svårt, kan vi mäta cell till cell koppling samt (se referens⁶, figur 1). På s?…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55