Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler
Summary
Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel “boru” ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.
Abstract
Serebral arterler ve onların anılan sıraya göre mikro beyin yoluyla kan akışını düzenleme için oksijen ve besin teslim. Endotel hücreleri kan damarları ve komut değişiklikleri damar çapı lümen nöronların metabolik talebi karşılamak için gerektiği kadar satır. Hyperpolarization membran potansiyeli (Vm) ve nitrik oksit birincil endotel bağımlı sinyal yollar genellikle vazodilatasyon aracılık ve böylece kan akışını artırmak için paralel olarak çalışır. Vazodilatasyon damar uzunluğu birkaç milimetre koordine için ayrılmaz rağmen endotel kaynaklı hyperpolarization (EDH) bileşenlerinin ölçmek tarihsel olarak zor olmuş. EDH aşağıdaki bileşenlerden intrasellüler Ca2 + [Ca2 +]ben artırır ve sonraki harekete geçirmek-in küçük – gerektirecektir ve gürültülerinden Ca2 +orta-K+ aktif (SKCatelefonuCa) kanalları.
Burada, fare serebral arterler gelen taze endotel yalıtım basitleştirilmiş bir örnek mevcut; endotel [Ca2 +]ben ve Vm Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler; ve tuz çözümleri ve farmakolojik ajanlar (pH 7.4, 37 ° C) fizyolojik koşullarda sürekli bir superfusion. Posterior serebral arter Willis daire dan kaldırılır posterior iletişim ve baziler arter. Enzimatik sindirim temizlenmiş posterior serebral arter kesimleri ve sonraki toz adventitia, perivasküler sinirler ve düz kas hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırır. Elde edilen posterior serebral arter endotel “tüpler” sonra mikroskop altında güvenli ve kullanma a fotoğraf makinesi, photomultiplier Tüp, ve bir iki electrometers sürekli superfusion iken altında inceledi. Toplu olarak, bu yöntem aynı anda endotel [Ca2 +]ben değişiklikler ve Vm EDH gap kavşak milimetre mesafeler boyunca bozulmadan kadar aracılığıyla yayılan ek olarak ayrı hücresel yerlerde ölçebilirsiniz endotel. Bu yöntem bir yüksek üretilen iş analiz serebral endotel fonksiyonları normal ve hastalıklı beyin kan akışı Yönetmelikte mekanizmaları temel verim bekleniyor.
Introduction
Beyin çevresinde kan akış vazodilatasyon serebral arterler ve arteriyoller damar ağları1arasında koordinasyonu tarafından düzenlenmiştir. Serebral direnç arterler komut değişiklikleri nöronlar1,2,3metabolik talebi karşılamak için gerektiği gibi damar çapı astar endotel hücreleri. Özellikle, endotel kaynaklı hyperpolarization (genellikle EDH bilinir), sırasında intrasellüler Ca2 + ([Ca2 +]ben) ve endotel hücreleri koordinat vazodilatasyon endotel hücreleri arasında içinde elektrik sinyal ve onların arteryel gevşeme4için boşluk kavşak ile düz kas hücreleri çevreleyen. EDH fizyolojik inisiyasyon sırayla Gquyarılması gerektirir-reseptörleri (GPCRs), [Ca2 +]benve harekete geçirmek-in endotel küçük ve orta Ca2 +artış birleştiğinde-Kaktif + (SKCatelefonuCa) kanalları serebral endotel membran potansiyeli (Vm)5,6,7hyperpolarize. Böylece, endotel [Ca2 +]ben ve Vm samimi ilişki kan akışı düzenleme için ayrılmaz ve vazgeçilmez kardiyo – ve serebrovasküler işlevi6,8. Daha geniş edebiyat çok sayıda çalışma vasküler endotelyal disfonksiyon Derneği kronik hastalıklar (örn, hipertansiyon, diyabet, kalp yetmezliği, koroner arter hastalığı, kronik böbrek yetmezliği gelişimi ile bildirdin endotel işlevin yanı sıra patolojik fizyolojik koşullarda eğitim önemini belirten periferik arter hastalığı)9,10.
Vasküler endotel hyperpolarization, vazodilatasyon ve doku perfüzyon üretimi için ayrılmaz bir parçasıdır ve bu nedenle yerel hücresel özellikleri incelenmesi önemlidir. Genel çalışma modeli olarak fare arteriyel endotelyal tüp modelinin hazırlanması daha önce iskelet kas11,12, gut13, akciğer14ve son zamanlarda beyin6yayımlandı. Aynı anda [Ca2 +]ben ve Vm ölçümler özellikle lenf damarı endotel17yanı sıra kas iskelet damar endotel15,16 yayınlanmıştır. Endotelyal tüp yaklaşım kullanarak birincil çalışmalar yanı sıra, kendi avantajları ve dezavantajları8 kapsamlı bir incelemesini bu deneysel araç belirli bir çalışma için uygun olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Kısacası, endotel hücre işlevi temel fizyolojik bileşenleri korunur bir avantaj olduğunu (örneğin, Ca2 + akını ve hücre içi serbest bırakmak, Vm Nernst potansiyel ilâ hyperpolarization K+ için yolu ile SKCatelefonuCa harekete geçirmek ve endotelyal hücreler arası bağlantı yolu ile gap kavşak) perivasküler sinir giriş, düz kas voltaj kanal işlevi ve contractility, gibi faktörler semptomlarıdır olmadan kan ve hormonal etkiler8dolaşımını. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan hücre kültür yaklaşımlar morfoloji18 ve iyon kanal ifade19 büyük ölçüde karşılaştırmalar için fizyolojik gözlemler ex vivo belirlenen karartmak bir şekilde önemli değişiklikler tanıtmak veya Vivo. Bu model en iyi şekilde sağlam vasküler segment tecrit içinde 4 h test gibi düz kas ve deneysel bir zamanlamada sınırlı esneklik gibi kan akışını düzenleyen diğer temel bileşenleriyle bütünleşme eksikliği sınırlamaları içerir –dan belgili tanımlık hayvan.
Socha ve Segal12 ve geçici6,15,16, son deneysel gelişmeler tarafından hazırlanan bir önceki video protokolden bina bu vesile ile taze endotel yalıtım göstermek posterior serebral arter ve endotel [Ca2 +]ben ve Vm Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler. Ayrıca, bu deneyi tuz çözümleri ve farmakolojik sürekli superfusion fizyolojik şartlarda (pH 7.4, 37 ° C) sırasında üzerine kuruludur. Yapısal bütünlük (gap kavşak ile birleştiğinde hücreleri) ve yeterli Boyutlar (Genişlik ≥50 µm, uzunluğu ≥300 µm) içi – ve hücreler arası boyunca ve arasında sinyal için mükellef ile izole endotel verimleri kadar posterior serebral arter seçti endotel hücreleri. Buna ek olarak, kemirgen posterior serebral arter çalışmaları önemli ölçüde literatürde gösterilir ve muayene, temel endotel sinyal mekanizmaları, vasküler geliştirme/yaşlanma ve patoloji20, kapsayacak 21 , 22. bu deneysel uygulama serebral endotel fonksiyonları (ve fonksiyon bozukluğu) yüksek üretilen iş analizini verim bekleniyor ve böylece kan akışı düzenleme anlamada önemli gelişmeler sağlayacak yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık gelişimi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son gelişmeler6,15,16,17ışığında, biz şimdi fare serebral damar endotel [Ca2 +] eşzamanlı ölçümü için hazırlık yalıtmak için yöntem göstermek ben ve sürekli olarak 37 ° C’de ~ 2 h için EDH temel Vm Her ne kadar teknik olarak zor, hücre hücre de (bkz: başvuru6, Şekil 1) kaplin ölçebilirsiniz. Bu şekilde, ayrı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Charles Hewitt malzeme ve ek malzemeler için geçerli iletişim kurallarına gerek kuran mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Drs. Sean M. Wilson ve Christopher G. Wilson, Perinatal biyoloji, LLU Merkezi’nden bize bir ek ters mikroskop ve electrometer, sırasıyla verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri grant R00-AG047198 (EJB) ve Loma Linda Üniversitesi Tıp Fakültesi yeni öğretim başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
References
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
- Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
- Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
- Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
- Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
- Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
- Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
- Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
- Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
- Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).
