本研究的重点是伤口愈合的体外模型 (划痕检测), 作为一种机制, 以确定环境污染物, 如砷如何影响细胞迁移。结果表明, 这种体外检测在体内实验之前为细胞迁移的变化提供了快速和早期的迹象。
了解伤口愈合的生理机制一直是多年来正在进行的研究的重点。这项研究直接转化为临床标准的变化, 用于治疗伤口和降低发病率和死亡率的患者。伤口愈合是一个复杂的过程, 需要战略性的细胞和组织的相互作用和功能。伤口愈合的许多至关重要的功能之一是个体和集体细胞迁移。受伤后, 血液、周围结缔组织和上皮组织中的各种细胞通过化学和物理刺激迅速迁移到伤口部位。这种迁移反应在很大程度上决定了愈合伤口的结果和成功。了解这种特定的细胞功能对于转化医学很重要, 因为这种转化医学可以改善伤口愈合的结果。在这里, 我们描述了一个协议, 用于更好地理解细胞迁移, 因为它涉及到伤口愈合, 以及如何改变细胞环境可以显著改变这一过程。在本例中, 真皮成纤维细胞生长在培养基中, 并以胎儿牛血清 (fbs) 为补充, 作为组织培养瓶中的单层培养物。细胞无菌转移到组织培养中, 经过12孔钢板处理, 并生长到100% 融合。到达汇合处后, 单层中的细胞被垂直划伤, 使用 p200 管尖。在培养介质中稀释的砷被添加到与环境相关的剂量为 0.1-10m, 每 4小时 (h) 拍摄图像一次, 使用倒置光显微镜观察细胞迁移 (伤口)结束)。利用图像分析软件对图像进行了单独分析, 计算了创面闭合百分比。结果表明, 砷减缓伤口愈合。这项技术提供了一个快速和廉价的第一屏幕, 以评估污染物对伤口愈合的影响。
伤口愈合由一系列复杂的重叠步骤组成, 涉及各种细胞类型、信号分子和细胞外基质成分 1。这些成分共同协同工作, 以实现伤口的分辨率或修复, 最终导致形成一个纤维化的保护性疤痕,这取决于创伤的程度1。在一个实验中捕捉伤口愈合的个别过程和功能是困难的;伤口愈合过程中的个别步骤需要单独识别和测试。在伤口愈合的许多步骤中, 细胞迁移的过程在评估愈合率时被认为是至关重要的2。细胞迁移可以在伤口愈合的所有阶段观察到, 因此需要进一步了解细胞迁移的改变如何影响伤口闭合。例如, 细胞迁移出现在早期和晚期炎症中, 在伤口部位3处凝血和血小板聚集。这些事件通过形成暂时堵塞来填补没有组织3的受伤区域, 从而防止过度失血。循环中的血小板将合成和分泌血管活性介质以及趋化因子, 这些因子共同向受伤组织传递炎症白细胞迁移 (白细胞) 信号, 用于修复4。再上皮化发生在组织损伤后的几个小时内, 包括通过上皮角质细胞的活动和迁移覆盖伤口部位, 以防止外来颗粒进一步污染或侵入伤口部位2。这些例子只捕获了与伤口愈合相关的许多细胞迁移功能中的几个。
对划痕法进行了描述, 并用于更好地了解细胞迁移及其在伤口愈合中的许多作用 5,6。这种检测被认为是简单的, 提供高吞吐量, 并使调查员能够收集具有代表性的细胞迁移数据。迁移检测已成功地证明某些化合物可能会加速或减缓细胞迁移的速度6。此外, 这些检测结果提供了可用于在体内实验之前制定目标处理、剂量浓度和感兴趣的基因的转化生理信息。该检测需要基本的细胞培养技术和用品、首选的细胞系以及成像技术, 以捕捉随着时间的推移而移动或响应治疗的运动。
该检测可以很容易地操纵或定制, 以满足调查人员的需要。然而, 在实验之前有四个基本问题需要考虑。调查人员试图回答哪些一般性或具体问题?这适用于大多数假设驱动的研究;然而, 它是至关重要的, 这种检测, 因为它将确定准确和完全回答问题所需的许多参数。应该用什么细胞系或细胞系 (如果是多个) 来代表正在研究的生理系统?例如, 在皮肤伤口愈合研究中,真皮成纤维细胞5、6、7、干细胞8或表皮角质形成细胞9可能被认为代表通常发现的细胞群皮肤组织中的丰富量10。或者, 中性粒细胞, 巨噬细胞或其他炎症细胞可以在这个系统中进行评估, 以代表细胞迁移的伤口愈合在皮肤组织10。此外, 确定正在评估的特定细胞系将有助于确定哪些试剂是最佳的使用, 以促进细胞代谢活动。细胞迁移将如何被跟踪?有许多技术用于观察盘子或烧瓶内的细胞迁移。例如, 染色或荧光标记细胞, 并使用荧光或共聚焦成像来跟踪细胞提供了强烈的对比, 这使得调查员能够清楚地定义细胞与非细胞的位置和细胞运动11.另一种常见的技术, 在这项研究中描述, 是使用倒置光显微镜与相对比6,7。这种替代细胞染料和荧光的方法使用户无需在成像前最终固定细胞即可活跟踪细胞, 还可以捕获包含不同时间点的细胞受伤单层的同一口井的图像。将使用哪些结果措施进行分析?利用整个研究过程中收集的图像, 可以生成数据, 在这些数据中可以了解细胞迁移率的变化。在我们的实验室中, 将倒置光学显微镜上拍摄的显微图像上传到图像分析软件, 计算曲线下的伤口闭合率和求和面积。
我们将强调这种检测方法的具体用途, 以阐明在已知的环境污染物砷存在的情况下皮肤成纤维细胞迁移的变化。砷是一种天然存在的金属, 存在于地壳中。在不同地点发现了砷含量较高的地方, 这对居住在这些地点附近的个人构成了风险。因此, 事实证明, 食物和水源增加了砷污染的程度, 增加了个人接触砷的可能性。环境砷接触已被证明对高于甚至低于美国环境保护署 (美国环保局) 目前 10 ppb (10μgl) 12 的最大污染物水平 (mcl)12的人群的健康产生长期影响,13. 虽然美国环保局制定了这一 mcl, 并认为它对饮酒限制是安全的, 但超过这一限度的砷浓度在全世界的水源中并不少见。在美国西南部, 有大量的地下水、井水和泉水含有有关的砷含量 14。例如, 在佛得角谷、az、蒙特祖马井中含有210微克/砷 15.沿佛得角河周围的地下水, az 平均含有16μgl 砷, 峰值达到 1.3 mgl15,16。值得注意的是, 佛得角河流域许多水井中的砷浓度超过 50μgs·15,16。根据这一知识, 在目前的研究14、15、 16 中, 选择了与环境相关的砷浓度, 从低于 mcl 的 0.1μm (7.5 ppb) 到在 mcl 以上的 10μm (750 ppb) 不等.,17,18,19,20.
从这些实验中收集到的信息将被用作受砷污染的体内伤口细胞迁移率可能发生变化的早期指标。然后, 可以根据信号分子在促进伤口愈合和细胞迁移方面的作用来选择信号分子, 并在电流完成后建立未来的基于定量聚合酶链反应 (qpcr) 的基因表达实验研究。如果在这种检测中, 在砷存在的情况下, 迁移率发生变化, 细胞迁移中涉及的特定基因靶标可能是砷有害影响的目标, 因此可能是破坏的机制。
该检测方法的应用可提供高通量和及时的细胞迁移评估, 并可直接转化为复杂的生理系统5,6,7。为此, 提出的台式模型进行了调整和实践, 以评估各种治疗剂和环境毒素对伤口愈合的影响6。通过对已知接触水平的广泛文献搜索, 以及对各种数据库14、15 的 回顾性审查, 本研究中使用的砷浓度被认为与环境有关。16,17,18,19,20,21。使用这种体外划痕试验表明, 暴露在高, 但与环境相关的范围内的砷浓度, 延迟伤口闭合 (细胞迁移)。
这种台面模型也被用来分离和研究单个细胞系 (成纤维细胞), 以进一步了解成纤维细胞迁移如何有助于伤口愈合的结果。此外, 很难研究单个细胞系在复杂的体内系统中的功能, 许多其他细胞和组织可能会干扰分析。此外, 该检测提供了一种实现半定量百分比伤口闭合数据的方法, 这些数据可用于针对特定的细胞机制, 通过这些机制, 化合物可能会影响伤口愈合。例如, 划痕检测中使用的细胞可以收集并储存在所需的试剂中, 并用于基因表达 (信号 mrna) 或蛋白质表达检测22。如果调查员试图了解哪些信号或蛋白质可能在很大程度上促成了在存在不同治疗方法 (即砷) 的情况下细胞迁移的变化, 则这些信息对他们很有用。
根据人类新生儿真皮成纤维细胞在创面愈合中的突出作用, 选择了他们进行这项工作。然而, 这种划痕检测协议已经使用各种细胞类型实施, 并用于一系列研究目的。例如, 在肿瘤学领域采用划痕法研究化疗药物的迁移抑制 23;用于骨骼肌细胞迁移、增殖和扩散24;研究植物提取物对细胞迁移的影响25;并了解角质形成细胞的迁移和增殖是如何促进伤口愈合的 9。此外, pinto等人先前的一篇论文利用划痕分析6评估了铀 (u) 和富含血小板的血浆 (prp) 对 hdfn 迁移的影响。这项工作的目的是了解这种检测在多大程度上可以测试被认为是减缓细胞迁移 (u) 的剂的效果, 以及被认为是加速细胞迁移 (prp) 的代理的效果。从上述工作和其他研究人员的研究中可以看出, 划痕法的应用在各种实验模型26 中具有很高的应用潜力。尽管方法中提供了细节, 但调查人员和实验人员之间应出现差异。例如, 除了独特细胞类型所需的微量营养素外, 细胞迁移率可能会根据所使用的细胞系而波动。许多有助于细胞产量和活力的重要观察被列为整个本协议中的笔记。然而, 强烈建议调查人员遵循制造商关于最佳生长条件的建议, 并将这种方法作为一般细胞培养工作的补充说明。
虽然划痕检测是非常多才多艺的细胞活性的研究;测量技术中可能会出现不可预见的偏差。例如, 当使用 imagej 手动跟踪单元格迁移方面时, 用户之间可能存在差异, 这可能会限制准确性和具有代表性的数据收集。还应指出的是, 迁移方面应被理解为对处理视而不见, 以最大限度地减少用户偏见。此外, 手动识别迁移面可能会导致错误地计算平均行驶距离, 因为细胞形成了假脚群, 并有能力伸出来形成焦点粘连, 这在视觉上可能会产生误导。同样, 在细胞表面使用荧光 “细胞跟踪器” 染料或核蛋白检测迁移可能会无意中修复细胞, 从而在测量细胞随时间的迁移时出现不准确。建议在实验中加入适当的阳性和阴性对照, 以完全评估治疗对细胞系的影响。这种检测的实践必须在认识到其局限性的情况下完成。该检测并不能保证从体外实验中获得的细胞迁移结果将直接转化为体内结局.在一个复杂的生命系统中, 伤口愈合和细胞迁移涉及多种细胞类型和分子信号;每一个都有可能影响治疗反应。
总之, 划痕检测已被发现提供了高通量筛选的细胞迁移响应不断变化的环境6,25。我们专门利用该协议成功地检测了由于在各种环境相关的剂量下接触砷而引起的细胞迁移的变化。这些数据为使用划痕分析进一步研究和评估本检测中细胞迁移的机械途径以及砷接触如何改变这些途径提供了理由。
The authors have nothing to disclose.
该出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院少数群体健康和健康差距研究所的支持, 该奖项编号为 U54MD012388。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
Water Bath | Precision | Model 182 | |
Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
p200 Pipette | Gilson | ||
p20 Pipette | Gilson | ||
Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Tissue Marker | Securline | 92167 | |
Wipes | Kintech | 34155 | |
70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
Bleach | Great Value | 220-04 | |
96-well | Falcon | 353915 | |
Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
12-well plate | Corning | 3598 | |
Waste Beaker | n/a | n/a | |
1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |