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在体外显示砷对皮肤细胞迁移影响的划痕测定

Published: February 23, 2019 doi: 10.3791/58838
Automatic Translation
1,4, 1, 1, 1,3, 1,2,4
1Department of Biological Sciences, Northern Arizona University, 2Department of Mechanical Engineering, Northern Arizona University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Northern Arizona University, 4Center for Bioengineering Innovation, Northern Arizona University

Summary

本研究的重点是伤口愈合的体外模型 (划痕检测), 作为一种机制, 以确定环境污染物, 如砷如何影响细胞迁移。结果表明, 这种体外检测在体内实验之前为细胞迁移的变化提供了快速和早期的迹象。

Abstract

了解伤口愈合的生理机制一直是多年来正在进行的研究的重点。这项研究直接转化为临床标准的变化, 用于治疗伤口和降低发病率和死亡率的患者。伤口愈合是一个复杂的过程, 需要战略性的细胞和组织的相互作用和功能。伤口愈合的许多至关重要的功能之一是个体和集体细胞迁移。受伤后, 血液、周围结缔组织和上皮组织中的各种细胞通过化学和物理刺激迅速迁移到伤口部位。这种迁移反应在很大程度上决定了愈合伤口的结果和成功。了解这种特定的细胞功能对于转化医学很重要, 因为这种转化医学可以改善伤口愈合的结果。在这里, 我们描述了一个协议, 用于更好地理解细胞迁移, 因为它涉及到伤口愈合, 以及如何改变细胞环境可以显著改变这一过程。在本例中, 真皮成纤维细胞生长在培养基中, 并以胎儿牛血清 (fbs) 为补充, 作为组织培养瓶中的单层培养物。细胞无菌转移到组织培养中, 经过12孔钢板处理, 并生长到100% 融合。到达汇合处后, 单层中的细胞被垂直划伤, 使用 p200 管尖。在培养介质中稀释的砷被添加到与环境相关的剂量为 0.1-10m, 每 4小时 (h) 拍摄图像一次, 使用倒置光显微镜观察细胞迁移 (伤口)结束)。利用图像分析软件对图像进行了单独分析, 计算了创面闭合百分比。结果表明, 砷减缓伤口愈合。这项技术提供了一个快速和廉价的第一屏幕, 以评估污染物对伤口愈合的影响。

Introduction

伤口愈合由一系列复杂的重叠步骤组成, 涉及各种细胞类型、信号分子和细胞外基质成分 1。这些成分共同协同工作, 以实现伤口的分辨率或修复, 最终导致形成一个纤维化的保护性疤痕,这取决于创伤的程度1。在一个实验中捕捉伤口愈合的个别过程和功能是困难的;伤口愈合过程中的个别步骤需要单独识别和测试。在伤口愈合的许多步骤中, 细胞迁移的过程在评估愈合率时被认为是至关重要的2。细胞迁移可以在伤口愈合的所有阶段观察到, 因此需要进一步了解细胞迁移的改变如何影响伤口闭合。例如, 细胞迁移出现在早期和晚期炎症中, 在伤口部位3处凝血和血小板聚集。这些事件通过形成暂时堵塞来填补没有组织3的受伤区域, 从而防止过度失血。循环中的血小板将合成和分泌血管活性介质以及趋化因子, 这些因子共同向受伤组织传递炎症白细胞迁移 (白细胞) 信号, 用于修复4。再上皮化发生在组织损伤后的几个小时内, 包括通过上皮角质细胞的活动和迁移覆盖伤口部位, 以防止外来颗粒进一步污染或侵入伤口部位2。这些例子只捕获了与伤口愈合相关的许多细胞迁移功能中的几个。

对划痕法进行了描述, 并用于更好地了解细胞迁移及其在伤口愈合中的许多作用 5,6。这种检测被认为是简单的, 提供高吞吐量, 并使调查员能够收集具有代表性的细胞迁移数据。迁移检测已成功地证明某些化合物可能会加速或减缓细胞迁移的速度6。此外, 这些检测结果提供了可用于在体内实验之前制定目标处理、剂量浓度和感兴趣的基因的转化生理信息。该检测需要基本的细胞培养技术和用品、首选的细胞系以及成像技术, 以捕捉随着时间的推移而移动或响应治疗的运动。

该检测可以很容易地操纵或定制, 以满足调查人员的需要。然而, 在实验之前有四个基本问题需要考虑。调查人员试图回答哪些一般性或具体问题？这适用于大多数假设驱动的研究;然而, 它是至关重要的, 这种检测, 因为它将确定准确和完全回答问题所需的许多参数。应该用什么细胞系或细胞系 (如果是多个) 来代表正在研究的生理系统？例如, 在皮肤伤口愈合研究中,真皮成纤维细胞5、6、7、干细胞8或表皮角质形成细胞9可能被认为代表通常发现的细胞群皮肤组织中的丰富量10。或者, 中性粒细胞, 巨噬细胞或其他炎症细胞可以在这个系统中进行评估, 以代表细胞迁移的伤口愈合在皮肤组织10。此外, 确定正在评估的特定细胞系将有助于确定哪些试剂是最佳的使用, 以促进细胞代谢活动。细胞迁移将如何被跟踪？有许多技术用于观察盘子或烧瓶内的细胞迁移。例如, 染色或荧光标记细胞, 并使用荧光或共聚焦成像来跟踪细胞提供了强烈的对比, 这使得调查员能够清楚地定义细胞与非细胞的位置和细胞运动11.另一种常见的技术, 在这项研究中描述, 是使用倒置光显微镜与相对比6,7。这种替代细胞染料和荧光的方法使用户无需在成像前最终固定细胞即可活跟踪细胞, 还可以捕获包含不同时间点的细胞受伤单层的同一口井的图像。将使用哪些结果措施进行分析？利用整个研究过程中收集的图像, 可以生成数据, 在这些数据中可以了解细胞迁移率的变化。在我们的实验室中, 将倒置光学显微镜上拍摄的显微图像上传到图像分析软件, 计算曲线下的伤口闭合率和求和面积。

我们将强调这种检测方法的具体用途, 以阐明在已知的环境污染物砷存在的情况下皮肤成纤维细胞迁移的变化。砷是一种天然存在的金属, 存在于地壳中。在不同地点发现了砷含量较高的地方, 这对居住在这些地点附近的个人构成了风险。因此, 事实证明, 食物和水源增加了砷污染的程度, 增加了个人接触砷的可能性。环境砷接触已被证明对高于甚至低于美国环境保护署 (美国环保局) 目前 10 ppb (10μgl) 12 的最大污染物水平 (mcl)12的人群的健康产生长期影响,13. 虽然美国环保局制定了这一 mcl, 并认为它对饮酒限制是安全的, 但超过这一限度的砷浓度在全世界的水源中并不少见。在美国西南部, 有大量的地下水、井水和泉水含有有关的砷含量 14。例如, 在佛得角谷、az、蒙特祖马井中含有210微克/砷 15.沿佛得角河周围的地下水, az 平均含有16μgl 砷, 峰值达到 1.3 mgl15,16。值得注意的是, 佛得角河流域许多水井中的砷浓度超过 50μgs·15,16。根据这一知识, 在目前的研究14、15、 16 中, 选择了与环境相关的砷浓度, 从低于 mcl 的 0.1μm (7.5 ppb) 到在 mcl 以上的 10μm (750 ppb) 不等.,17,18,19,20.

从这些实验中收集到的信息将被用作受砷污染的体内伤口细胞迁移率可能发生变化的早期指标。然后, 可以根据信号分子在促进伤口愈合和细胞迁移方面的作用来选择信号分子, 并在电流完成后建立未来的基于定量聚合酶链反应 (qpcr) 的基因表达实验研究。如果在这种检测中, 在砷存在的情况下, 迁移率发生变化, 细胞迁移中涉及的特定基因靶标可能是砷有害影响的目标, 因此可能是破坏的机制。

Protocol

1. 筹备二级生物安全内阁

注: 本协议中描述的方法应与个人防护设备一起进行, 同时使用良好的实验室实践来实现无菌技术。

  1. 提起 bsc 保护玻璃至工作高度, 然后打开层流风扇。
    1. 使用70% 异丙醇水溶液对工作区域进行卫生擦拭。擦拭 bsc 从后墙和侧壁, 并工作到底板。
    2. 用70% 的酒精 (异丙醇或 etoh) 擦拭将用于检测的所有材料, 并将其放置在平衡计分卡内。

2. 在 t75 瓶中播种的人皮肤成纤维细胞

  1. 获得具有所需冷冻保存细胞系 (新生儿真皮成纤维细胞 [hdfn]、500细胞浓度和 p3–p5 通道) 的小瓶。
    1. 在37°c 的水浴中放置一个装有细胞的小瓶, 以便解冻。解冻瓶, 直到大约70% 的细胞溶液是液体。用70% 的酒精擦拭小瓶, 并将小瓶放入 bsc 内的小瓶机架中。
      注: 确保水不会与小瓶的螺纹或盖接触, 以防止细胞播种过程中可能出现的污染。防止水浴中细胞完全解冻, 因为不这样做可能会导致意外的细胞死亡。
  2. 抽出10毫升的培养基, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs)。使用自动移液器和10毫升移液器尖端吸气到 t75 组织培养瓶。允许介质通过轻轻来回摇晃烧瓶, 使烧瓶底部完全饱和。
    1. 打开小瓶, 从小瓶中提取细胞, 并从小瓶中吸气液, 注意移液速度, 因为细胞膜不会受到冷冻保存的影响。
    2. 用培养基将细胞转移到 t75 组织瓶中。将解冻的细胞放入组织烧瓶中, 再次注意移液速度。
      注: 组织瓶中细胞的种子密度约为 6, 600 细胞/厘米2。可以改变种子密度, 以适应用户和所需的实验时间。
    3. 测量 t75 组织瓶中的1毫升培养基, 并将体积转移回小瓶。将体积从小瓶转移回 t75 瓶。
      注: 执行此步骤有助于最大限度地提高小瓶中的细胞产量。
    4. 拧紧组织培养瓶盖, 轻轻摇晃, 使细胞均匀地分散在悬浮整个表面。使用倒置显微镜检查细胞的均匀分布。
  3. 标签瓶与细胞类型, 日期, 首字母, 血统, 和目的 (例如, hdfn, 07/11/2018, ndc, 第4通道, 砷划痕评估)。在37°c 和 5.0% co2 的情况下, 将组织培养瓶放置在37°c 和 5.0%co2的加湿孵化器中, 时间为72小时。
    注: 生长介质应在初始播种后12-24 改变, 以去除微量的二甲基亚硫醚 (dmso) 冷冻保存, 然后每48小时改变一次, 以确保细胞得到适当的营养。孵育和生长周期将取决于划痕检测所需的细胞数量的计算。在正常情况下, hdfn 细胞的加倍时间通常为16-24小时。但是, 由于海拔、ph 值、温度、湿度、介质类型等原因, 翻倍率可能会发生变化, 在规划实验时必须加以考虑。

3. 细胞计数和亚培养入12井组织培养板

  1. 从孵化器中提取 t75 组织培养瓶。使用10倍客观放大倍率 (100X 总放大倍率) 的倒置显微镜观察粘附细胞, 并确定近似的细胞融合。
    1. 在观察汇合处时, 扫描大部分组织培养瓶, 以确保最具代表性的百分比接近。评估单个细胞形态是否有任何异常, 或细菌和/或真菌污染。
  2. 用10毫升移液器尖端组装自动移液器。使用移液器从 t75 吸入全部介质, 并将溶液转移到废物容器中。防止移液尖端接触粘附的细胞表面。将移液器吸头丢弃在生物危害箱中。
    1. 用5毫升移液器尖端组装自动移液器。吸出5毫升的平衡盐溶液, 在烧瓶中分发, 轻轻摇晃烧瓶冲洗多余的培养基、死细胞和废品。
    2. 从 t75 中提取体积, 并放入废物容器中。将移液器尖端丢弃到生物危害箱中。
    3. 将自动移液器与5毫升移液器适配器组装。从油瓶中吸收2毫升胰蛋白酶, 在烧瓶中分发, 轻轻摇晃烧瓶, 将酶分散在粘附的细胞上。确保粘附表面的完全饱和度。将组织瓶放入孵化器 2-3分钟 (分钟)。
      注: 最大酶-底物反应不应超过10分钟。
    4. 观察倒置显微镜下的组织瓶, 以10倍的物镜放大倍率 (100X 总放大倍率)。应用温和的振动, 以促进细胞脱离。
    5. 用70% 的酒精擦拭 t75 烧瓶, 并将其放置在 bsc 内。
    6. 用5毫升移液器尖端组装自动移液器。从库存中吸收5毫升的培养基, 加入 t75 组织瓶, 以阻止酶-底物反应。介质: 胰蛋白酶比应为3:1。向上和向下的脚底的烧瓶2-3 次冲洗, 并确保反应已经停止。从烧瓶中吸收完整体积的液体, 并转移到无菌的15毫升锥形管中。
    7. 用相同体积的介质填充第二个15毫升锥形管。
    8. 将两个 15 ml 锥形管放置在一个对足的位置。通过设置设备的运行参数, 在25°c 下施加200克离心力5分钟。
    9. 用70% 的酒精擦拭15毫升锥形管, 并将其放置在 bsc 内。
    10. 使用带有5毫升连接到介质上的自动移液器, 留下约250μl 的液体和电池颗粒。注意移液尖端的位置, 因为细胞颗粒应保持不受干扰。将收集到的体积放入废物容器中, 并将尖端丢弃在生物危害箱中。
    11. 使用微型离心管架在小瓶槽中运行锥形管的底部, 产生快速振动, 干扰并重新悬挂电池颗粒 (有时称为 "机架倾斜")。
      注: 避免使用涡流混频器执行此步骤。涡流混合器产生的重力超过细胞的阈值, 并可能导致裂解。正确完成后, 新的细胞溶液将显示为混浊的混合物, 没有剩余的颗粒。勤奋执行这一步骤往往会产生一个单一的细胞悬浮液, 从而提高计数细胞时的准确性。
    12. 在电池库中添加2毫升介质或重新悬浮。将细胞轻轻地从管的一侧向下倾斜 20次, 以分解任何团块。记录细胞的总悬浮量, 并短暂地放在一边。
  3. trypan blue 库存的 pipet 20μl (0.4%)用无菌的管道进入96孔板的空井。
    1. 混合库存细胞溶液, 在转移前生成均匀的细胞悬浮液。使用无菌的移液尖端去除20μl 的细胞库存 (避免接触管壁)。在96孔板中加入20μl 的 trypan blue 溶液。
    2. 轻轻地将内容物混合在一起。在覆盖液和血细胞计上的计数室之间的混合物的移液10μl。
    3. 观察10x 目标下的单元格和网格。观察视野内的九个大广场。仅在中心和4个角方块 (共5个正方形) 中计数单元格。
      注: 寻找整个网格中单元格的均匀分布, 以确保准确计数。
    4. 在网格的5个识别方块中的所有单元格 (透明和蓝色)。另外, 只统计相同5个方块中的不可行 (蓝色) 细胞。
    5. 使用以下方法计算可行的细胞计数:Equation 1
      其中x = 活细胞计数, a = 总细胞数, b = 不活细胞
    6. 使用以下方法计算可行的细胞密度:Equation 2
      其中x = 活细胞密度和 y = 活细胞的总和。
    7. 计算总的活细胞:Equation 3
      其中x = 总活细胞, y = 活细胞密度, f = 细胞悬浮体积 (ml)。
    8. 计算% 细胞活力:Equation 4
      其中x = 百分比细胞活力, y = 在网格上计数的活细胞, f = 在网格上计数的总细胞。
  4. 标记12井板底部的水平线, 作为成像过程中的参考标记。
    1. 使用活细胞密度 (3.3.7 计算) 来计算培养基的体积, 以稀释细胞库存, 用于播种12孔组织培养板。
      注: hdfn 细胞的最佳细胞播种密度为 5, 000 细胞/厘米2。
    2. 使用培养基将细胞库存稀释至 19, 000 细胞, 用1毫升细胞的细胞库存播种每口井。定期混合细胞库存, 以确保所有12口井的细胞播种均匀。
    3. 为每个板标记单元格类型、沿袭、用户首字母和用途。将板材放入孵化器中, 设置为37°c 和 5.0% co2。允许细胞生长, 直到达到100% 的融合进行划痕检测。

4. 砷 (as) 库存解决方案和计算

  1. 稀释砷酸钠 (naaso2) 直接进入 10% fbs 的细胞培养介质中, 工作浓度为10、1.0、0.1 和 0.01μm as。
  2. 为此, 通过将3.9 毫克砷化钠稀释为30毫升介质, 使初始 1 mm 库存为 as 溶液。连续稀释 1 mm 库存的剩余 as 溶液。
1000μm 为库存计算 砷-工作库存浓度 m1v1= m2v2 以前的砷溶液量 媒体量 砷工作库存总量
naaso2分子量: 129.9 g/mol 10μm a (x 毫升)(1, 000μm) = (30 mL)(10 微米) x = 0.3 ml 0.3 ml = 300μl 的 1mm as 溶液 29.7 ml 介质 30
. 03 l x. 001 momsl x 130 g/mol = 3.9 毫克砷 1.0 微米 (x 毫升)(10μm) = (30 mL)(1) x = 3 毫升 3毫升 10μm as 溶液 27毫升介质 30
稀释3.9 毫克砷酸钠到30毫升培养基 0.1μm as (x 毫升)(1μm) = (30 mL)(0.1) x = 3 毫升 3毫升的 1μm a 27毫升介质 30
0.01μm a (x 毫升)(0.1μm) = (30 mL)(0.01 微米) x = 3 毫升 3毫升 0.1μm a 27毫升介质 30

表1。砷和连续稀释。下表解释了用于为治疗组创建 as 库存解决方案和工作库存解决方案的计算。

5. 划痕检测技术与砷污染

  1. 从孵化器中获取一个带有细胞的12孔板。以10倍的客观放大倍率 (100X 的总放大倍率) 查看单元格。确定每口井内的细胞融合。
    注: 每个井必须达到100% 汇流,然后再划伤。这一关键步骤确保了检测的一致性, 并有助于跨实验标准化检测协议。如果任何井没有达到100% 汇合处, 允许细胞孵育更多的时间, 直到所有井都达到100% 汇合处。已经达到100% 汇流的油井的额外生长时间不会受到影响。共流细胞通常会成为生长被捕, 并保持作为单层培养, 同时允许次汇流井达到100% 汇合。
  2. 组装带有10毫升移液器尖端的自动移液器。将生长介质从所有水井中吸收出来。在生物危害箱中处理液体废物和移液器尖端中的体积。
    1. 装配一个 p200 移液器与1-200μl 无菌尖端。在每口井中, 通过从12点到6点的位置在细胞表面滑行, 产生划痕的 "模拟伤口"。
      注: 将极大地影响一致性的三个因素是速度、压力和尖端角度。划伤应迅速进行, 有一个恒定的压力, 同时注意尖端角度保持垂直于底部的板。划痕太慢会导致弯曲的线条, 过量的压力可以永久得分细胞粘附表面, 和一个尖端角度小于90°将缩小划痕宽度。这些常见的错误中的任何一个都可能导致迁移率和模式的改变。
    2. 用每口1毫升的平衡盐溶液冲洗, 清除多余的碎片和细胞团块。将盘子侧向侧摇晃, 以便于清洗。从井中取出平衡的盐溶液, 并将其处置在废物容器中。将5毫升移液器尖端放入生物危害箱。

Figure 1
图 1: 划痕分析的原理图表示.所有工作都是在无菌领域内完成的, 以减少污染的机会。细胞在组织培养瓶中按所需密度播种, 并在适合人体生理条件 (5% co2, 37°c) 的孵化器中生长。当细胞达到所需的融合时, 细胞以所需的种子密度无菌地亚化地培养成12孔组织培养板。细胞在12孔板的每口井中生长到100% 的汇合处, 并使用无菌的管道尖端划伤。这种 "划痕" 创造了一个体外模拟伤口 (用双向箭头表示), 在这种伤口中, 细胞自然迁移以关闭开放区域。每口井都可以有独特的条件, 并且可以根据不同的治疗条件观察和量化细胞迁移率。请点击这里查看此图的较大版本.

  1. 使用 1, 000μl 尖的 p1000 移液器将砷库存中的 1, 000μl 移入与处理组随机分配的水井。为每口井使用一个新的管道尖端, 以防止交叉污染。记录添加治疗的时间。将12孔板放入37°c 和 5.0% co2 的孵化器中.

6. 成像

  1. 在 24小时 (0、4、8、12、16、20和 24小时) 内, 每4小时以10倍的客观放大倍率捕获每口井的图像。参考以前在板底部绘制的线, 以便在随后的时间点沿每口井内的划痕绘制相同的位置。
    注: 必须在每个时间点对相同的位置进行拍照, 以便进行准确的图像分析, 并获得具有代表性的数据。

7. 图像分析

  1. 将倒置光显微镜上捕获的图像上传到计算机, 并将其另存为具有详细文件名的 jpeg 图像。
  2. 打开 imagej。
  3. 通过将文件拖放到软件窗口中进行图像测量时, 将已知距离的舞台千分尺图像上传到软件, 将像素转换为毫米 (mm)。
    注: 千分尺的线应该划定已知的1毫米长度, 图像必须以用于捕捉细胞图像的相同放大倍率拍摄。例如, 在本研究中, 图像是以100x 的总放大倍率拍摄的, 因此, 级千分尺的图像是以100x 的总放大倍率拍摄的。
    1. 单击 "直线"、 "分段" 或"手绘线条"选项。
    2. 通过使用与每个刻度线相关的长度的刻度线, 在千分尺图像上绘制一条已知距离线。要绘制一条直线: 单击鼠标, 按住, 将光标拖动到所需位置, 然后放开鼠标。
    3. 选择"分析",然后选择 "设置比例"。
    4. 将"已知距离" 设置为上一步中绘制的线的已知长度。
    5. 将长度单位设置为毫米。
    6. 选中全局框。
    7. 选择"确定"退出菜单。
    8. 关闭舞台千分尺图像。
  4. 通过将图像文件拖放到窗口中, 将一个划痕分析图像上载到 imagej 中。
    1. 绘制一条直线跨越划痕的宽度 (从左前缘到右前缘)。
    2. 按键盘上的字母m记录所绘制的直线的测量值。键入字母m 后, 将立即出现一个小的 "结果"窗口。这就是宽度测量的位置。
  5. 重复步骤7.4 共重复 10次, 以获得沿划痕长度的10次测量。
    注: 在整个划痕长度下生成最具代表性的宽度值非常重要。确保沿从上到下的划痕长度均匀地间隔10个宽度的测量值。
  6. 创建一个划痕分析电子表格文件来复制和粘贴测量结果。
    1. 将 "结果"窗口中的10个宽度测量值复制并粘贴到电子表格文件中的相应列中 (表 2)。
      注: 当测量值从 "结果"窗口复制并粘贴到电子表格中时, 将有无关的值列;应删除这些值, 只保留10个宽度的测量值。
10个随机宽度测量 0小时 2。 8小时 12小时 16小时 20小时 24小时
1
2
3个
4个
5
6
7。
8
9
10
10个测量的平均值

表2。原始宽度测量表格式。下表显示了所获得的原始度量值的组织结构。

  1. 对剩余的划痕检测图像重复上述步骤。
  2. 计算每口井在每个时间点 (0-24小时) 的10个测量值的平均值。
  3. 使用步骤7.8 中的值确定闭包计算的百分比。
    1. 在电子表格底部创建一个标题为 "宽度测量平均值" 的表格 (表 3)。
    2. 将步骤7.8 中计算的"10个测量平均值" 行复制并粘贴到 "宽度测量平均值" 表中。
    3. 在 "宽度测量平均线" 表旁边创建另一个表。标题此表百分比伤口闭合(表 4)。
      注: 每个油井的 0 h 列中的值应该为 0, 因为所有油井的初始0小时照片时, 划痕为0% 关闭。
    4. 导航到下一列以上 (4小时)。
    5. 计算4、8、12、16、20和24小时时间点的闭包百分比:
      Equation 1
      其中, x =% 闭合, i = 初始划伤宽度 (0小时宽度), f = 最终划伤宽度 (4、8、12、16、20或24小时宽度)。
井宽平均值 0小时 4小时 8小时 12小时 16小时 20小时 24小时
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

表3。宽度测量平均表格格式。此表显示了使用表 2中的原始宽度测量计算的宽度测量平均值的组织结构。

好吧, 好吧 0小时 4小时 8小时 12小时 16小时 20小时 24小时
1a 0
2a 0
3a 0
4a 0
1b 0
2b 0
3b 0
4b 0
1c 0
2c 0
3c 0
4c 0

表4。百分比伤口闭合表格式。此表显示了使用表 3中的宽度测量平均值计算的伤口闭合值百分比的组织结构。

  1. 在 "百分比伤口闭合"表旁边创建另一个表。标题为此表auc (表 5)。
    1. 计算每口井0-4h 列中曲线 (auc) 值下的0-4h 面积:
      Equation 1
      其中x = 0-4 h auc 值, 0 h 的 =% 闭包值, b = 4小时的闭包值, h = 两个度量之间的时间 (本研究中的 4小时)。
    2. 计算每口井4-8 列中曲线 (auc) 值下的4-8 面积:
      Equation 1
      其中x = 4-8 h auc 值, a =% 闭包值为 4小时, b =% 闭包值为 8小时, h = 两个度量之间的时间 (本研究中的 4 h)。
      注: 应为每口井24小时期间的每4小时时间间隔计算一个 auc 值。
    3. 将所有 auc 值的总和为 0-24h (按步骤计算 7.10.1-7.10.2), 以获得每口井的-uc 值的总和。确保正确保存这些值, 以便进行统计分析。
好吧, 好吧 0-4 4-8 8-12 12-16小时 16-20 20-24 总结的哥伦比亚联合自卫队
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

表5。auc 表格式。此表显示了使用表 4中的伤口闭包值计算的 auc 值的组织结构。

8. 统计分析

  1. 确定最适合实验设计和测试过程中获得的准舒度值的统计分析方法。

Representative Results

所有治疗组的样本大小 (n) 为n = 28。细胞是按照无菌技术和实验室协议成功培养的 (图 1)。在所有治疗组中观察到均匀的划痕, 平均划伤宽度为 0.8 mm 0.4 毫米 (图 2)。对照组的平均求和面积低于曲线值 1 355.83;0.01μm as 治疗组的平均求和面积低于曲线值 1 366.21;0.1μm as 处理组的平均求和面积在曲线值 1, 326.24 下, 1.0 μm as 处理组的平均求和面积在曲线值 1, 295.10 下;最后, 10μm as 治疗组的平均求和面积低于曲线值 535.12, 与所有其他组相比有统计学意义 (p < 0.05) (图 3)。统计分析的 r 程序被用来运行单向方差分析, 并进行 tukey的临时后调整, 以确定治疗组之间的统计差异 (p < 0.05)。

Figure 2
图 2: 在20小时内具有代表性的划痕检测图像.图像 a-d 表示控制细胞的细胞迁移;图像 e-h 表示受1.0 μm as 污染的细胞的细胞迁移;图像 i-l 表示受 10μm as 污染的细胞的细胞迁移。从这些图像中可以清楚地看出, 在砷存在的情况下, 细胞迁移速度变慢。控制图像显示, 2 0 小时后完全 "治愈" 的划痕, 而另外两个治疗组则没有 "治愈"。10μm as 治疗完全禁止在24小时后完全关闭. 请点击这里查看此数字的较大版本.

Figure 3
图 3: 砷减缓划痕检测中的细胞迁移.在24小时内拍摄到的图像是为了观察在砷浓度不同的情况下细胞迁移率的变化。使用自动化软件 (例如, 在 matlab 中) 对原始图像进行了分析, 该软件最初测量伤口宽度, 然后计算出百分比闭合, 最后计算曲线下的面积 (auc)。错误条表示平均值的标准误差。10μm as 治疗组在统计上减缓了新生儿皮肤成纤维细胞的细胞迁移, 与使用单向方差分析并进行临时调整的所有其他治疗组相比, 这一值的 auc 值在统计学上较低 (p& lt;0.05)。统计差异由字母 "a" 和 "b" 表示, 它们是通过使用 r 程序中提供的紧凑型字母显示方法获得的。不共享共同字母的治疗在统计上具有重要意义 (p<0.05)。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

该检测方法的应用可提供高通量和及时的细胞迁移评估, 并可直接转化为复杂的生理系统5,6,7。为此, 提出的台式模型进行了调整和实践, 以评估各种治疗剂和环境毒素对伤口愈合的影响6。通过对已知接触水平的广泛文献搜索, 以及对各种数据库14、15 的 回顾性审查, 本研究中使用的砷浓度被认为与环境有关。16,17,18,19,20,21。使用这种体外划痕试验表明, 暴露在高, 但与环境相关的范围内的砷浓度, 延迟伤口闭合 (细胞迁移)。

这种台面模型也被用来分离和研究单个细胞系 (成纤维细胞), 以进一步了解成纤维细胞迁移如何有助于伤口愈合的结果。此外, 很难研究单个细胞系在复杂的体内系统中的功能, 许多其他细胞和组织可能会干扰分析。此外, 该检测提供了一种实现半定量百分比伤口闭合数据的方法, 这些数据可用于针对特定的细胞机制, 通过这些机制, 化合物可能会影响伤口愈合。例如, 划痕检测中使用的细胞可以收集并储存在所需的试剂中, 并用于基因表达 (信号 mrna) 或蛋白质表达检测22。如果调查员试图了解哪些信号或蛋白质可能在很大程度上促成了在存在不同治疗方法 (即砷) 的情况下细胞迁移的变化, 则这些信息对他们很有用。

根据人类新生儿真皮成纤维细胞在创面愈合中的突出作用, 选择了他们进行这项工作。然而, 这种划痕检测协议已经使用各种细胞类型实施, 并用于一系列研究目的。例如, 在肿瘤学领域采用划痕法研究化疗药物的迁移抑制 23;用于骨骼肌细胞迁移、增殖和扩散24;研究植物提取物对细胞迁移的影响25;并了解角质形成细胞的迁移和增殖是如何促进伤口愈合的 9。此外, pinto等人先前的一篇论文利用划痕分析6评估了铀 (u) 和富含血小板的血浆 (prp) 对 hdfn 迁移的影响。这项工作的目的是了解这种检测在多大程度上可以测试被认为是减缓细胞迁移 (u) 的剂的效果, 以及被认为是加速细胞迁移 (prp) 的代理的效果。从上述工作和其他研究人员的研究中可以看出, 划痕法的应用在各种实验模型26 中具有很高的应用潜力。尽管方法中提供了细节, 但调查人员和实验人员之间应出现差异。例如, 除了独特细胞类型所需的微量营养素外, 细胞迁移率可能会根据所使用的细胞系而波动。许多有助于细胞产量和活力的重要观察被列为整个本协议中的笔记。然而, 强烈建议调查人员遵循制造商关于最佳生长条件的建议, 并将这种方法作为一般细胞培养工作的补充说明。

虽然划痕检测是非常多才多艺的细胞活性的研究;测量技术中可能会出现不可预见的偏差。例如, 当使用 imagej 手动跟踪单元格迁移方面时, 用户之间可能存在差异, 这可能会限制准确性和具有代表性的数据收集。还应指出的是, 迁移方面应被理解为对处理视而不见, 以最大限度地减少用户偏见。此外, 手动识别迁移面可能会导致错误地计算平均行驶距离, 因为细胞形成了假脚群, 并有能力伸出来形成焦点粘连, 这在视觉上可能会产生误导。同样, 在细胞表面使用荧光 "细胞跟踪器" 染料或核蛋白检测迁移可能会无意中修复细胞, 从而在测量细胞随时间的迁移时出现不准确。建议在实验中加入适当的阳性和阴性对照, 以完全评估治疗对细胞系的影响。这种检测的实践必须在认识到其局限性的情况下完成。该检测并不能保证从体外实验中获得的细胞迁移结果将直接转化为体内结局.在一个复杂的生命系统中, 伤口愈合和细胞迁移涉及多种细胞类型和分子信号;每一个都有可能影响治疗反应。

总之, 划痕检测已被发现提供了高通量筛选的细胞迁移响应不断变化的环境6,25。我们专门利用该协议成功地检测了由于在各种环境相关的剂量下接触砷而引起的细胞迁移的变化。这些数据为使用划痕分析进一步研究和评估本检测中细胞迁移的机械途径以及砷接触如何改变这些途径提供了理由。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院少数群体健康和健康差距研究所的支持, 该奖项编号为 U54MD012388。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet Forma Scientific 15201-816
Nitrile Gloves Kimberly-Clark 55082
Water Bath Precision Model 182
Inverted Microscope Leica Q080318
CPR Centrifuge Beckman 349702
Analytical Scale Ohaus I093 1125062111P
Weighting paper VWR H351125781212A
Biohazard bags Fisherbran 01-830A
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 309739-31053
Hanks Balanced Salt Solution Gibco 14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 10566-016
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Automatic Pipettor Drummond 140685
p200 Pipette Gilson
p20 Pipette Gilson
Denominator Fisher Scientific D59707
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061
T75 tissue flask Corning 430725U
15 mL Conical Tube Fisherbrand 05-539-5
50 mL Conical Tube VWR 21008-178
5 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11D
10 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11E
Tissue Marker Securline 92167
Wipes Kintech 34155
70% Ethanol Fisher 63-67-0
Non-Filter Pipet Tips Fisherbrand 16160210
Bleach Great Value 220-04
96-well Falcon 353915
Cryovial Rack Nalgene 5030-0505
Hemacytometer Gizmo Supply B00SCOGY56
TrypLE Express Gibco 12605-028
Conical Tube Rack n/a n/a
12-well plate Corning 3598
Waste Beaker n/a n/a
1 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11B
Straight Edge Ruler n/a n/a
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) lot: 1734, 2902 106-05n
Rstudio Statistical Software ver: 3.5.1
Image J NIH ver: 1.8.0_112

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References

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环境科学 第144期 划痕法 细胞迁移 伤口愈合 砷 环境污染物 人真皮成纤维细胞
<em>在体外</em>显示砷对皮肤细胞迁移影响的划痕测定
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Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. … More

Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration. J. Vis. Exp. (144), e58838, doi:10.3791/58838 (2019).

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