Summary
Este estudio se centra en un modelo en vitro de herida curativa (rasguño ensayo) como un mecanismo para la determinación de contaminantes ambientales como como la migración celular de la influencia de arsénico. Los resultados demuestran que este ensayo in vitro proporciona indicaciones rápidas y tempranas de los cambios en la migración celular antes de la experimentación en vivo .
Abstract
Comprensión de los mecanismos fisiológicos de la cicatrización de heridas ha sido el foco de la investigación en curso por muchos años. Esta investigación se traduce directamente en cambios en estándares clínicos utilizados para el tratamiento de heridas y disminuir la morbilidad y la mortalidad para los pacientes. La cicatrización es un proceso complejo que requiere la función y la interacción estratégica de células y tejidos. Una de las muchas funciones críticamente importantes de la cicatrización es individual y colectiva de la migración celular. Sobre lesiones, varias células de la sangre, que rodea los tejidos conectivos y epiteliales rápidamente migran el sitio de la herida mediante estímulos químicos o físicos. Esta respuesta de migración puede dictar en gran medida los resultados y el éxito de una curación de la herida. Comprensión de esta función celular específica es importante para la medicina traslacional que puede conducir a mejores resultados de cicatrización. Aquí, describimos un protocolo utilizado para entender mejor la migración celular lo que respecta a la cicatrización de heridas, y cómo los cambios en el entorno celular pueden alterar significativamente este proceso. En este estudio ejemplo, fibroblastos dérmicos fueron cultivados en medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) como cultivos de monocapa en frascos de cultivo de tejidos. Las células se transfirieron en placas de cultivo de tejidos tratado 12-bien asépticamente y crecidas a 100% de confluencia. Al llegar a la confluencia, las células de la monocapa se rayada verticalmente usando una punta de pipeta p200. Arsénico diluido en medio de cultivo suplementado con SBF ha sido añadido a pocillos individuales en ambientalmente relevantes dosis entre 0.1-10 M. imágenes fueron capturadas cada 4 horas (h) durante un período de 24 horas usando un microscopio invertido de luz observar la migración celular (de la herida cierre). Imágenes individualmente fueron analizadas utilizando el software de análisis de imagen y cierre la herida por ciento fue calculado. Los resultados demuestran que el arsénico retrasa la cicatrización de heridas. Esta técnica proporciona una primera pantalla de rápido y de bajo costo para la evaluación de los efectos de los contaminantes en la cicatrización de heridas.
Introduction
La cicatrización consiste en una compleja serie de pasos que involucran diversos tipos de células, moléculas de señalización y de componentes de matriz extracelular1se superponen. Juntos, estos componentes trabajan en conjunto para lograr la resolución de la herida o la reparación, que en última instancia conduce a la formación de una cicatriz fibrótica protector dependiendo del grado de trauma1. Para capturar los distintos procesos y funciones de la herida que cura en un experimento es difícil; pasos individuales en el proceso de cicatrización necesitan ser identificadas y probadas por separado. Entre los muchos pasos de la cicatrización, el proceso de migración celular se ha considerado crítico al evaluar cicatrización tarifas2. Migración celular se puede observar en todas las fases de la cicatrización de heridas y así exige una mayor comprensión de cómo alteraciones de migración celular pueden afectar a encierro de la herida. Por ejemplo, la migración celular se observa en ambos inflamación de fase temprana y tardía, con agregación de la coagulación y plaquetas de la sangre en el sitio de la herida3. Estos eventos previenen pérdida de sangre excesiva mediante la formación de una obstrucción temporal para llenar áreas heridas desprovisto de tejido3. Las plaquetas en la circulación se sintetizan y secretan mediadores vasoactivos y factores quimiotácticos, que señal de junto para la migración de leucocitos inflamatorios (glóbulos blancos) en el tejido herido de reparación4. Reepitelización ocurre dentro de las horas de lesión del tejido y consiste en cubrir el sitio de la herida a través de la actividad y migración de los queratinocitos epiteliales para evitar más contaminación o invasión de partículas extrañas en el sitio de la herida2. Estos ejemplos de captura de sólo unos pocos de la migración de células de muchas funciones asociadas con la cicatrización de heridas.
El ensayo de rayado ha sido descrito y utilizado para entender mejor la migración de la célula y sus muchos papeles en5,6de cicatrización. Este análisis se consideran simplista, proporciona alto rendimiento y permite al investigador a recoger datos de migración de la célula representativa. Ensayos de migración con éxito han demostrado que ciertos compuestos pueden acelerar o ralentizar la velocidad de migración celular6. Además, estos resultados ofrecen información fisiológica traslacional que puede utilizarse para formular tratamientos blanco, dosificación de las concentraciones y los genes de interés antes de la experimentación en vivo . El ensayo requiere de técnicas de cultivo de célula básica y suministros, una línea celular de elección y la tecnología de imágenes para capturar el movimiento con el tiempo o movimiento en respuesta a los tratamientos.
El ensayo puede ser fácilmente manipulado o adaptado a las necesidades del investigador. Sin embargo, hay cuatro cuestiones básicas a tener en cuenta antes de la experimentación. ¿Qué preguntas generales o específicas son el investigator(s) tratando de responder? Esto es válido para las hipótesis más impulsada por la investigación; sin embargo, es fundamental para este ensayo porque determinará muchos de los parámetros necesitan para con precisión y responder totalmente a las preguntas. ¿Qué células o líneas celulares (si múltiples) deben utilizarse para representar el sistema fisiológico en estudio? Por ejemplo, en una cutánea herida curación estudio, fibroblastos dérmicos5,6,7, la célula de vástago8o9 de queratinocitos epidérmicos podría considerarse que representan poblaciones de células que se encuentran normalmente en abundancia en el tejido de la piel10. Por otra parte, neutrófilos, macrófagos y otras células inflamatorias podrían evaluarse en este sistema para representar la migración de la célula de otros componentes de la cicatrización en piel tejido10. Además, identificar la línea de celulares específicas evaluando ayudarán a identificar que los reactivos son óptimos para promover la actividad metabólica de la célula. ¿Cómo será migración celular rastreado/imagen? Hay una serie de técnicas utilizadas para observar la migración de la célula dentro de una placa o frasco. Por ejemplo, el teñido o fluorescente etiquetado células y utilizando la fluorescencia o la proyección de imagen confocal para rastrear las células proporciona un fuerte contraste, que permite al investigador a definir claramente el celular y no celular lugares y movimiento celular11 . Otra técnica común, descrita en este estudio, es el uso de microscopía de luz invertido con contraste de fase6,7. Esta alternativa a los tintes de la célula y fluorescencia permite vivir las células de la pista sin tener que arreglar terminal células antes de la proyección de imagen y también permite la captura de imágenes de los mismos pocillos individuales que contienen monocapas de heridos de las células a través de puntos de tiempo. ¿Medidas del resultado que se utilizará para el análisis? Usando las imágenes se reunieron durante todo el estudio, los datos pueden generarse en el que se pueden entender cambios en las tasas de migración celular. En nuestro laboratorio, imágenes microscópicas en el microscopio de luz invertido se suben a software de análisis de imagen y el cierre de la herida por ciento y sumado área bajo la curva (AUC) se calculan.
Destacaremos el uso específico de este ensayo para aclarar cambios en migración de fibroblastos dérmicos en presencia de un contaminante ambiental conocido, arsénico. El arsénico es un metaloide naturalmente que ocurre encontrado en la corteza terrestre. Se han encontrado varios lugares con altos niveles de arsénico, lo que representa un riesgo para las personas que viven cerca de estos lugares. Como resultado, alimentos y fuentes de agua han demostrado que han aumentado los niveles de contaminación con arsénico, que aumenta la probabilidad de individuos a ser expuestos al arsénico. Exposición ambiental de arsénico se ha demostrado que tiene consecuencias a largo plazo de la salud en poblaciones humanas por encima o incluso por debajo de la actual agencia de protección ambiental de Estados Unidos (USEPA) máximo contaminante nivel (MCL) de 10 ppb (10 μg/L)12, 13. aunque la USEPA ha establecido este MCL y considerada segura para beber los límites, las concentraciones de arsénico que exceden este límite no son infrecuentes en las fuentes de agua en todo el mundo. En el sudoeste de Estados Unidos, numerosos agua subterránea, agua de pozo y manantiales han sido documentados para contener en cuanto a niveles de arsénico14. Por ejemplo, en Valle Verde, AZ, Montezuma bien contiene 210 μg/L de arsénico15. Agua subterránea alrededor del río Verde, AZ contiene 16 μg/L de arsénico en promedio, con valores máximos llegando a 1,3 mg/L15,16. En particular, las concentraciones de arsénico en muchos pozos en la vertiente de agua de Río Verde exceden 50 μg/L15,16. Con este conocimiento, las concentraciones de arsénico ambientalmente relevantes fueron seleccionados que van por debajo del MCL en 0.1 μm (7,5 ppb), por encima del MCL en 10 μm (750 ppb) en la corriente estudiar14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
La información obtenida en estos experimentos se utilizará como un indicador temprano de posibles cambios en las tasas de migración celular en un en vivo de la herida contaminado con arsénico. Después, señalando las moléculas pueden ser seleccionadas basados en su papel en facilitar la migración celular y la cicatrización de heridas, y futuro cuantitativa de polimerasa en la reacción en cadena (qPCR) gene expresión experimentos podrán crearse sobre la terminación de la corriente estudios. Si tasas de migración en este ensayo el cambio en la presencia de arsénico, objetivos de genes específicos involucrados en la migración celular pueden ser el blanco de los efectos nocivos de arsénico y así pueden ser el mecanismo de interrupción.
Protocol
1. preparación de un gabinete de bioseguridad II (BSC)
Nota: Los métodos descritos en este protocolo deben realizarse con equipo de protección personal, durante el uso de buenas prácticas de laboratorio para lograr una técnica aséptica.
- Levantar el cristal protector del BSC a la altura del funcionamiento y encienda los ventiladores de flujo laminar.
- Utilizar solución acuosa de isopropanol 70% para realizar un barrido de saneamiento de la zona de trabajo. Limpie el BSC de la pared del fondo y las paredes laterales y trabajo a la placa base.
- Limpie todos los materiales que se utilizarán en el ensayo con alcohol al 70% (isopropanol o EtOH) y colóquelas dentro de la BSC.
2. humanos fibroblastos dérmicos siembra en un matraz T75
- Obtener frascos con la línea de células cryopreserved deseada (neonatales humanas fibroblastos dérmicos [hDFn], concentración celular de 500.000 células/vial y paso p3-p5).
- Colocar un frasco con las células en un baño María a 37 ° C para permitir la descongelación 1.0 cm de profundidad. Descongelar el vial hasta que aproximadamente el 70% de la solución celular es líquido. Limpie la parte vial con alcohol 70% y frasco en rack vial dentro de BSC.
Nota: Asegúrese de agua no viene en contacto con los hilos de rosca o tapa del frasco para evitar la posible contaminación durante la siembra de la célula. Evitar la descongelación completa de las células en el agua del baño ya que no hacerlo puede causar muerte celular accidental.
- Colocar un frasco con las células en un baño María a 37 ° C para permitir la descongelación 1.0 cm de profundidad. Descongelar el vial hasta que aproximadamente el 70% de la solución celular es líquido. Limpie la parte vial con alcohol 70% y frasco en rack vial dentro de BSC.
- Extraer 10 mL de medio suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS). Utilice una pipeta automática y la punta de la pipeta de 10 mL para aspirar al matraz de cultivo de tejidos T75. Permitir que los medios de comunicación saturar completamente la base de la mufla, meciendo suavemente el frasco hacia adelante y hacia atrás.
- Frasco abierto con solución de stock y aspirado de células del frasco, siendo consciente de la velocidad de pipeteado, como membranas de la célula será vulnerables de criopreservación.
- Transferir las células a un matraz de tejido T75 con medios de comunicación. Expulsión de células descongeladas al matraz de tejido, otra vez siendo consciente de la velocidad de pipeteado.
Nota: Siembra la densidad de células en matraz de tejido se aproxima para ser 6.600 células/cm2. Densidad de siembra puede ser modificado para adaptarse al usuario y deseado momento de experimentación. - Medir 1 mL de medio frasco de tejido T75 y transferencia de volumen en el vial. Transferencia de volumen del frasco hacia el matraz T75.
Nota: Realizar este paso ayuda a maximizar el rendimiento de la célula del frasco. - Apriete la tapa del frasco de cultivo de tejidos y muévalo suavemente para dispersar uniformemente células en suspensión a través de toda la superficie. Compruebe la distribución uniforme de las células utilizando un microscopio invertido.
- Frasco de etiqueta con tipo de celular, fecha, iniciales, linaje y el propósito (por ejemplo, hDFn, 11/07/2018, NDC, pasaje 4, ensayo de Scratch de arsénico). Coloque el frasco de cultivo de tejidos en un incubador humedecido a 37 ° C y 5.0% de CO2 durante 72 h.
Nota: Medio de cultivo debe ser cambiado 12-24 h después de la siembra inicial para eliminar trazas de dimetilsulfóxido (DMSO) crioconservante y luego cambia cada 48 h después de eso para asegurar que las células se nutren adecuadamente. El período de incubación y crecimiento dependerá el número calculado de células necesarias para el ensayo de rayado. El tiempo de duplicación de las células de hDFn es típicamente 16-24 h en condiciones normales. Sin embargo, duplicar tasa puede cambiar debido a la elevación, pH, temperatura, humedad, tipo de medio, etc.y deben ser tratadas contablemente al planear experimentos.
3. recuento de células y subcultivo en 12-bien tejido placa de la cultura
- Recuperar el frasco de cultivo de tejidos T75 de incubadora. Observar células adheridas utilizando un microscopio invertido con 10 aumentos objetivo (total 100 aumentos) y determinar la confluencia celular aproximada.
- Analizar la mayor parte del frasco de cultivo de tejidos al observar la confluencia para el porcentaje más representativo se aproxima. Evaluar la morfología de la célula individual para cualquier anormalidad, o por contaminación bacteriana o fúngica.
- Monta la pipeta automática con una pipeta de 10 mL. Utilice la pipeta para aspirar el volumen completo de los medios de comunicación de la solución T75 y transferencia a un contenedor de residuos. Evitar que la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de adhesión de la célula. Deseche la punta de la pipeta en un recipiente de riesgo biológico.
- Monta la pipeta automática con una pipeta de 5 mL. Aspirar 5 mL de la solución de sal equilibrada, dispensar en el frasco y con cuidado el matraz para enjuagar el exceso de medio, las células muertas y residuos producto.
- Sacar el volumen de la T75 y echar en el depósito de residuos. Deseche la punta de la pipeta en el recipiente de riesgo biológico.
- Monta la pipeta automática con un adaptador de pipeta de 5 mL. Aspirar 2 mL de tripsina de la acción, dispensar en el frasco y con cuidado el frasco para dispersar a la enzima en las células adheridas. Asegurar la completa saturación de la superficie adherente. Coloque el frasco de tejido en la incubadora durante 2-3 minutos (min).
Nota: La reacción enzima-sustrato máxima no debe exceder 10 minutos. - Observar el matraz de tejido bajo un microscopio invertido en una ampliación de objetivo de X 10 (aumento total de X 100). Se aplican suaves vibraciones para facilitar la separación de la célula.
- Limpie el T75 matraz con alcohol al 70% y lugar dentro de la BSC.
- Monta la pipeta automática con una pipeta de 5 mL. Aspirar 5 mL de medio de la acción y añadir al matraz de tejido T75 para detener la reacción enzima-sustrato. La relación de los medios de comunicación: tripsina debe ser 3:1. Pipeta de arriba y abajo de la base de la mufla 2 - 3 veces para enjuagar y asegurar que la reacción se detiene. Aspirar el volumen total del líquido del frasco y de transferencia en un tubo cónico de 15 mL estéril.
- Llenar un segundo tubo cónico de 15 mL con un volumen idéntico de los medios de comunicación.
- Colocar ambos tubos cónicos de 15 mL en una posición antipodal a uno con el otro. Aplicar 200 g de fuerza centrífuga durante 5 minutos a 25° C mediante el establecimiento de parámetros de funcionamiento del equipo.
- Limpie el tubo cónico de 15 mL con células pildoradas con alcohol al 70% y colocar dentro de la BSC.
- Utilizar la pipeta automática con un accesorio de 5 mL para pipeta de medios de comunicación, dejando aproximadamente 250 μl de líquido y células de la pelotilla. Preste atención a la ubicación de la punta de la pipeta, como el precipitado de células debe permanecer inalterado. Distribuir el volumen recogido en un recipiente y descarte la punta en un recipiente de riesgo biológico.
- Utilizar un bastidor de tubo de microcentrífuga para ejecutar la parte inferior del tubo cónico a través de las ranuras del frasco, creando una vibración rápida, para molestar y Resuspenda el sedimento celular (a veces llamado "estante del rastrillo").
Nota: Evite el uso de un mezclador de tipo vórtex para realizar este paso. Las fuerzas de gravedad creadas por mezcladores vortex superan umbrales de g-force de la célula y pueden causar lisis. Cuando haya completado correctamente, la nueva solución celular aparecerá como una mezcla turbia con ninguna bolita restante. Diligencia que realizar este paso a menudo creará una suspensión unicelular, llevando a mayor precisión cuando el conteo de las células. - Añadir 2 mL de medios de comunicación a la población de células o resuspensión. Pipetear las células suavemente hacia abajo del lado del tubo 20 veces para dispersar cualquier grumos. Registrar el volumen de suspensión celular total y dejar de lado brevemente.
- Pipetee 20 μl del stock de azul de tripán (0.4%) en un pozo vacío de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta estéril.
- Mezcle la solución stock de la célula para generar una suspensión uniforme antes de la transferencia. Utilice una punta de la pipeta estéril para retirar 20 μl del stock de la célula (evitando tocar las paredes del tubo). Añadir a los 20 μl de solución de azul de tripano en la placa de 96 pocillos.
- Pipetee suavemente para mezclar el contenido. Pipetee 10 μl de la mezcla entre el cubreobjetos y el conteo del compartimiento en el hemocitómetro.
- Observar las células y la red bajo un objetivo de X 10. Observar nueve cuadrados grandes en el campo de visión. Contar las células sólo en el centro y 4 cuadrados de esquina (total 5 plazas).
Nota: Busque una distribución uniforme de las células a través de la red entera para asegurar un conteo preciso. - La cuenta de todas las células (transparentes y azul) en las 5 plazas identificadas de la red. Cuenta por separado, sólo las células (azul) no viables en las misma 5 plazas.
- Calcular la cuenta de célula viable utilizando:
donde x = recuento de células viables, un = células totales, b = células no viables - Calcular la densidad de células viables usando:
donde x = densidad celular viable y y = suma total de células viables. - Calcular total células viables:
donde x = células viables totales, y = densidad de células viables, f = volumen de suspensión celular (mL). - Calcular el % de viabilidad celular:
donde x = viabilidad celular por ciento, y = células viables contadas en rejilla, f = células total contadas en la red.
- Marque una línea horizontal a través de la parte inferior de la placa de 12 pozos para servir como marcas de referencia en la proyección de imagen.
- Utilizar la densidad de células viables (calculada en 3.3.7) para calcular el volumen de los medios para diluir la acción celular en para sembrar una placa de cultivo de tejidos de 12 pozos.
Nota: La célula óptima de siembra la densidad de las células de hDFn es 5.000 células/cm2. - Diluya el material celular a 19.000 células/mL utilizando los medios de comunicación y cada pocillo con 1 mL de stock de la célula de la semilla. Mezcla acción célula periódicamente para celular incluso siembra a través de los 12 pozos.
- Etiqueta de cada placa con el tipo de célula, el linaje, las iniciales del usuario y el propósito. Coloque las placas en la incubadora a 37 ° C y 5.0% CO2. Permitir que las células crecen hasta alcanza 100% de confluencia para ensayo de rayado.
- Utilizar la densidad de células viables (calculada en 3.3.7) para calcular el volumen de los medios para diluir la acción celular en para sembrar una placa de cultivo de tejidos de 12 pozos.
4. arsénico (As) soluciones y cálculos
- Diluir Sodio arsenito (NaAsO2) directamente en medios de cultivo celular con 10% FBS a concentraciones de trabajo de 10, 1,0, 0,1 y 0,01 μm como.
- Para esto, hacer un stock inicial de 1 mM como solución diluyendo 3.9 mg de Sodio arsenito en 30 mL de medio. Diluir en serie el stock de 1 mM para el restante como soluciones.
| 1000 μm como Stock Cálculos | Arsénico, concentraciones de bolsa de trabajo | M1V1= M2V2 | Volumen de la solución anterior de arsénico | Volumen de medios de comunicación | Volumen total de trabajo valores de arsénico |
| NaAsO2 peso molecular: 129.9 g/mol | 10 μm como | (x mL) (1.000 μm) = ()(10 µM) 30 mL x = 0.3 mL | 0,3 mL = 300 μL de 1mM como solución | media de 29,7 mL | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3.9 mg de arsénico | 1,0 μm como | (x mL) (10 μm) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 10 μm como solución | 27 mL de medios de comunicación | 30 |
| Diluir 3,9 mg de arsenito de sodio en medio 30 mL | 0,1 μm como | (x mL) (1 μm) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 1 μm como | 27 mL de medios de comunicación | 30 |
| 0,01 μm como | (x mL) (0,1 μm) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 0.1 μm como | 27 mL de medios de comunicación | 30 |
Tabla 1. Acciones arsénicas y diluciones seriadas. Esta tabla explican los cálculos utilizados para crear las soluciones stock de As y soluciones para grupos de trabajo.
5. técnica de ensayo y la contaminación por arsénico del rasguño
- Obtener una placa de 12 pozos con células de la incubadora. Ver las células en una 10 X objetivo magnificación (aumento total de X 100). Determinar confluencia celular en cada pocillo.
Nota: Cada bien individual debe alcanzar 100% de confluencia antes de rayar. Este paso crítico asegura la consistencia en el análisis y ayuda a estandarizar los protocolos de análisis a través de experimentos. Si cualquier pozos no han alcanzado el 100% de confluencia, permitir que las células a incubar por un tiempo adicional hasta que todos los pozos han alcanzado 100% de confluencia. No perderá tiempo de crecimiento adicional en los pozos que ya han alcanzado el 100% de confluencia. Células confluentes típicamente se convierten en crecimiento detenido y permanece como una cultura de monocapa, permitiendo el confluentes pozos llegar a 100% de confluencia. - Montar una pipeta automática con una pipeta de 10 mL. Aspire el medio de crecimiento de todos los pozos. Desechar el volumen de residuos líquidos y la punta de la pipeta en el recipiente de materiales biológicos peligrosos.
- Montar una p200 pipeta con una punta estéril 1-200 μl. En cada pozo, producir un arañazo "falsa herida" al deslizar la punta a través de la superficie de la célula de un mediodía a las 6 ubicación.
Nota: Los tres factores que afectarán enormemente consistencia son velocidad, presión y ángulo de punta. El cero debe realizarse rápidamente, con una presión constante, mientras que teniendo en cuenta el ángulo de la punta está perpendicular a la base de la placa. Rascarse demasiado lento provocará que las líneas torcidas, exceso de presión puede permanentemente marcar superficies adherentes de la célula y un ángulo de la punta menos de 90° se estrecha la anchura cero. Cualquiera de estos errores comunes puede resultar en tasas de migración alterada y patrones. - Limpiar exceso montones de escombros y celular por lavado con 1 mL de solución salina equilibrada por pozo. La placa de lado a lado para facilitar el lavado de la roca. Retire la solución de sal equilibrada de pozos y deseche en un contenedor de residuos. Deseche la punta de la pipeta de 5 mL en el contenedor de materiales biológicos peligrosos.
- Montar una p200 pipeta con una punta estéril 1-200 μl. En cada pozo, producir un arañazo "falsa herida" al deslizar la punta a través de la superficie de la célula de un mediodía a las 6 ubicación.
Figura 1: representación esquemática de la prueba de scratch. Todo el trabajo se realiza dentro de un campo aséptico para reducir las probabilidades de contaminación. Las células son sembradas a una densidad deseada en frascos de cultivo de tejidos y cultivadas en una incubadora en condiciones fisiológicas humanas (5% CO2, 37 ° C). Al llegar a una deseada confluencia, las células el asépticamente se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos a una densidad de siembra deseada. Las células se cultivan hasta confluencia 100% en cada pocillo de la placa de 12 pozos y rayados usando una punta de pipeta estéril. Este "rasguño" crea una en vitro falsa herida (denotada por la flecha doble cabeza), en el cual las células naturalmente migran para cerrar el área abierta. Cada uno bien puede ser únicamente condicionado y tasas de migración celular pueden ser observadas y cuantificadas en respuesta a condiciones de tratamiento diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Utilice una pipeta p1000 con una punta de 1.000 μl a 1000 μl de pipeta de las existencias de arsénico en pozos que han sido asignados al azar a un grupo de tratamiento. Utilice una punta de pipeta nueva para cada bien para evitar la contaminación cruzada. Registrar el tiempo cuando se agregan tratamientos. Coloque las placas 12-bien en una incubadora a 37 ° C y 5.0% CO2.
6. proyección de imagen de
- Capturar imágenes de cada pozo de 10 X objetivo aumento cada 4 h durante 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 h). Referencia a la línea previamente dibujada en la parte inferior de la placa de la misma ubicación a lo largo de la raya dentro de cada pozo en momentos posteriores de la imagen.
Nota: Es imprescindible que las mismas localizaciones son fotografiados en cada momento para permitir el análisis de una imagen precisa y obtener datos representativos.
7. Análisis de la imagen
- Subir imágenes en el microscopio de luz invertido a un ordenador y guardar como una imagen JPEG con un nombre de archivo detallado.
- Abra el ImageJ.
- Subir una imagen de un micrómetro con distancias conocidas al software para convertir pixeles a milímetros (mm) al tomar las mediciones de imagen arrastrando y soltando el archivo en la ventana del software.
Nota: El micrómetro debe tener líneas de demarcación de una longitud conocida de 1 mm y la imagen debe tomarse en el mismo aumento utilizado para capturar imágenes de las células. Por ejemplo, en este estudio se tomaron imágenes a 100 X ampliación total, así la imagen del micrómetro etapa fue tomada en 100 X ampliación total.- Haga clic en las opciones rectas, segmentadoo Líneas a mano alzada .
- Trace una línea de distancia conocida en la imagen del micrómetro mediante el uso de las marcas de graduación largo asociado a cada garrapata marcas. Para dibujar una línea recta: Haz clic en el ratón, mantenga, arrastre el cursor a la posición deseada y soltar del ratón.
- Seleccione analizar a continuación, seleccione Establecer escala.
- Establecer Distancia conocida a la conocida longitud de la línea trazada en el paso anterior.
- Establece la unidad de la longitud en mm.
- Casilla en el mundial.
- Seleccione OK para salir del menú.
- Cerca de la imagen del micrómetro de etapa.
- Cargar una imagen de ensayo rasguño en ImageJ arrastrando y cayendo archivo de imagen en la ventana.
- Trazar una línea recta a lo ancho de la raya (desde el borde izquierdo al borde derecho).
- Pulsa la letra M en el teclado para registrar la medición de la línea recta dibujada. Una pequeña ventana de resultados aparecerá inmediatamente después de escribir la letra M. Esto es donde la medida de ancho.
- Repita el paso 7.4 un total de 10 veces para obtener 10 medidas a lo largo de la longitud de la raya.
Nota: Es importante generar los valores más representativos de ancho abajo toda la longitud de la raya. No se olvide de espaciar las mediciones de 10 ancho igualmente a lo largo del scratch de arriba a abajo. - Crear un archivo de hoja de cálculo de ensayo rasguño para copiar y pegar las mediciones.
- Copiar y pegar las mediciones de 10 ancho de la ventana de resultados en la columna correspondiente en un archivo de hoja de cálculo (tabla 2).
Nota: Cuando las mediciones son copiadas de la ventana de resultados y pegar en la hoja de cálculo, habrá extrañas columnas de valores; Estos valores se deben eliminar, conservando sólo las mediciones de 10 ancho.
- Copiar y pegar las mediciones de 10 ancho de la ventana de resultados en la columna correspondiente en un archivo de hoja de cálculo (tabla 2).
| 10 mediciones de anchura al azar | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Promedio de 10 mediciones |
Tabla 2. Medidas ancho crudo cuadro formato. Esta tabla muestra la estructura organizacional para las medidas crudas obtenidas.
- Repita el paso anterior para el resto de las imágenes del ensayo de rayado.
- Calcule el promedio de las 10 mediciones en cada punto del tiempo (0-24 h) para cada bien.
- Determinar el por ciento del encierro de cálculos usando los valores de paso 7.8.
- Crear una tabla en la parte inferior de la hoja de cálculo titulado "promedios de medición de anchura" (tabla 3).
- Copiar y pegar en que la fila Media de 10 mediciones calcula paso de 7.8 en la tabla "medición de ancho promedio".
- Crear otra tabla al lado de la tabla de Promedios de medición de ancho . Título de esta mesa de Cierre de la herida por ciento (cuadro 4).
Nota: El valor en la columna h 0 de cada bien debe ser 0 porque el cero es 0% y cerrada en la foto inicial 0 h para todos los pozos. - Desplácese a la siguiente columna (4 h).
- Calcular el cierre por ciento para 4, 8, 12, 16, 20 y puntos de tiempo de 24 h:
donde, x = cierre por ciento, i = inicial cero anchura (0 h), f = final scratch anchura (4, 8, 12, 16, 20 o 24 h).
| Anchura promedio | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2A | |||||||
| 3A | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4B | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabla 3. Medida de la anchura promedio de formato de tabla. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los promedios de medición de anchura calculada usando las medidas de ancho materia prima en la tabla 2.
| Bien | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2A | 0 | ||||||
| 3A | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1B | 0 | ||||||
| 2B | 0 | ||||||
| 3B | 0 | ||||||
| 4B | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabla 4. Formato de la tabla de cierre de la herida por ciento. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los valores de cierre de herida por ciento calculan utilizando la medida de ancho promedio en la tabla 3.
- Crear otra tabla junto a la mesa de Cierre de la herida por ciento . Título de esta mesa de AUC (tabla 5).
- Calcular el 0-4 h área bajo el valor de la curva (AUC) en el 0-4 h columna para cada bien:
donde x = 0-4 valor AUC h, a = valor cierre % h 0, b = valor cierre % 4 h, h = el tiempo entre las dos medidas (4 h en este estudio). - Calcular el área de 4-8 h en el valor de la curva (AUC) en la columna 4-8 h para cada bien:
Donde x = 4-8 h AUC valor, un = valor cierre % 4 h, b = % valor de cierre para 8 h, h = el tiempo entre las dos medidas (4 h en este estudio).
Nota: Un valor AUC debe calcularse para cada intervalo de tiempo de 4 h durante el período de 24 h para cada pozo. - Suma todos los valores AUC de 0-24 h (calculada en pasos 7.10.1-7.10.2) para obtener un valor AUC sumado para cada pozo. Asegúrese de que estos valores se guardan correctamente para el análisis estadístico.
- Calcular el 0-4 h área bajo el valor de la curva (AUC) en el 0-4 h columna para cada bien:
| Bien | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | AUC sumada |
| 1a | |||||||
| 2A | |||||||
| 3A | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4B | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabla 5. Formato de la tabla de las AUC. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los valores AUC calculan utilizando el porcentaje de valores cierre la herida en la tabla 4.
8. estadístico análisis
- Determinar el método de análisis estadístico que mejor se adapte al diseño experimental y sumados los valores AUC obtenidos durante el ensayo.
Representative Results
Tamaños de muestra (n) para todos los grupos de tratamiento fue de n = 28. Las células fueron cultivadas con éxito técnicas asépticas y protocolos de laboratorio (figura 1). Se observaron arañazos uniforme en todos los grupos de tratamiento con la anchura cero media miden 0,8 mm 0,4 mm (figura 2). Grupos de control tenían una superficie media de resumidos bajo el valor de la curva de 1,355.83; 0,01 μm como grupos de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,366.21; 0,1 μm como grupos de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,326.24, 1,0 μm como grupo de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,295.10; y finalmente el μm 10 como grupo de tratamiento tenía una superficie media de resumidos bajo el valor de la curva de 535.12, que fue estadísticamente menor en comparación con todos los demás grupos (p < 0.05) (figura 3). R-programa para el análisis estadístico se utilizó para realizar un ANOVA unidireccional con un ajuste de post hoc de Tukey para determinar diferencias estadísticas entre grupos de tratamiento (p < 0.05).
Figura 2: cero representante de ensayo imágenes durante un período de 20 h. Imágenes A-d representan migración celular de las células control; imágenes E-H representan migración celular de células llenas de 1.0 μm. Imágenes L representan migración celular de células contaminadas con 10 μm como. De estas imágenes, queda claro que la migración celular es más lento en presencia de arsénico. Las imágenes de control muestran un rasguño totalmente "curados" después de 20 h, mientras que los otros dos grupos como tratamiento no fueron "curados". 10 μm como tratamiento inhibió el encierro completo en conjunto después de 24 h. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: arsénico disminuye migración celular en el ensayo memoria. Imágenes fueron capturadas durante un período de 24 horas para observar los cambios a las tasas de migración celular en presencia de diferentes concentraciones de arsénico. Imágenes RAW se analizaron con un software automatizado (por ejemplo, en MATLAB), que herida inicialmente medido la anchura, luego calcula cierre por ciento y finalmente el área bajo la curva (AUC). Barras de error representan el error estándar de la media. 10 μm como grupo de tratamiento estadísticamente se desaceleró migración celular de humanos fibroblastos dérmicos neonatales (hDFn), por un valor AUC estadísticamente más bajo, comparado con otros grupos de tratamiento utilizando un ANOVA unidireccional con un ajuste de post hoc de Tukey (p) < 0.05). Las diferencias estadísticas son representadas por las letras "A" y "B", que se obtuvieron mediante el método de pantalla compacta de letra en R-programa. Tratamientos que no comparten una letra común son estadísticamente significativos entre sí (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aplicación de este ensayo proporciona una alto rendimiento y oportuna evaluación de la migración celular y puede traducir directamente a complejos sistemas fisiológicos5,6,7. Por esta razón, el modelo propuesto de sobremesa ha sido sintonizado y practica para evaluar los efectos de varios agentes terapéuticos y las toxinas ambientales en heridas6. Las concentraciones de arsénico, utilizado en el estudio actual fueron consideradas ambientalmente relevantes a través de la búsqueda de la literatura extensa de los niveles de exposición conocidos y de revisión retrospectiva de datos de varias bases de14,15, 16,17,18,19,20,21. Uso de este ensayo de rayado en vitro demostraron que la exposición a una concentración de arsénico en el alto, pero la gama ambientalmente relevante, retrasa el cierre de la herida (migración celular).
Este modelo de Banco también fue empleado para aislar y estudiar una línea de células individuales (fibroblastos) para entender más cómo la migración de fibroblastos contribuye a los resultados de curación de la herida. Además, es difícil estudiar las funciones de una línea de células individuales en sistemas complejos en vivo con muchas otras células y tejidos presentes que pueden interferir con el análisis. Además, el ensayo proporciona un medio para lograr datos de cierre herida por ciento semi cuantitativos que pueden utilizarse para orientar mecanismos celulares específicos a través del cual los compuestos pueden influir en la cicatrización de heridas. Por ejemplo, células utilizadas en el ensayo de rayado pueden ser recogidas y almacenadas en un reactivo deseado y utilizadas en la expresión génica (señal de mRNA) o análisis de la expresión de la proteína22. Esta información puede ser útil al investigador si buscan entender qué señales o proteínas pueden en gran medida contribuir a cambios en la migración celular en presencia de diferentes tratamientos (es decir, arsénico)22.
Fibroblastos dérmicos neonatales humanos fueron seleccionados para este trabajo basado en su destacado papel en la cicatrización de heridas. Sin embargo, este protocolo cero ha sido implementado con diversos tipos celulares y una gama de propósitos de la investigación. Por ejemplo, el ensayo de rayado se ha adoptado en el campo de la oncología para el estudio de inhibición de migración de quimioterapia drogas23; para la migración de la célula de músculo esquelético, proliferación y difusión24; para estudiar el efecto de extractos de plantas en migración celular25; y para entender cómo contribuyan con proliferación y migración de queratinocitos a la herida curativa9. Además, el anterior documento por Pinto et al. evaluó los efectos del uranio (U) y plasma rico en plaquetas (PRP) en migración de hDFn mediante el ensayo de rayado6. El propósito de este trabajo fue conocer el grado en que este ensayo podría poner a prueba el efecto de un agente para disminuir la migración celular (U), así como un agente que la velocidad de migración celular (PRP). Como puede verse en el trabajo ya mencionado y la investigación por otros investigadores, aplicación de la prueba de scratch tiene alto potencial de uso en varios modelos experimentales26. A pesar de los detalles proporcionados dentro de los métodos, la varianza es de esperarse entre los investigadores y experimentos. Por ejemplo, tasas de migración celular es probable que fluctúan en base a la línea celular en uso, además de los micronutrientes requeridos necesarios para tipos de celda única. Muchas de las observaciones importantes para facilitar la viabilidad y rendimiento de la célula aparecen como notas a lo largo de este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los investigadores siguen las recomendaciones del fabricante para las condiciones de crecimiento óptimo y para utilizar este método como instrucción complementaria para el trabajo de la cultura general de la célula.
Aunque el ensayo de rayado es extremadamente versátil para el estudio de la actividad celular; sesgos inesperados pueden surgir en las técnicas de medición. Por ejemplo, al utilizar ImageJ manualmente trazar frentes de migración de la célula, puede existir variación entre los usuarios, que pueden limitar la exactitud y la colección de datos representativos. Debe señalarse también que frentes de migración deben leerse ciego al tratamiento para minimizar el sesgo del usuario. Además, identificar manualmente los frentes migración puede resultar en un error de cálculo de la distancia promedio recorrida debido a la formación de pseudópodos por las células y su capacidad para llegar a adherencias focales de la forma, que pueden ser visualmente engañosas. De igual manera, el uso de fluorescentes "rastreador de celulares" colorantes sobre la superficie de la célula o proteínas nucleares para detectar la migración involuntaria pueden fijar las células resultando en imprecisiones al medir la migración celular en el tiempo. Se recomienda que los controles adecuados de positivos o negativos estar inscrito dentro del experimento para evaluar completamente el efecto del tratamiento sobre las líneas celulares. Práctica de este análisis debe ser completado en reconocimiento de sus limitaciones. Esta prueba no garantiza que resultados de migración celular de experimentación in vitro se traducen directamente a los resultados de en vivo . Migración celular y cicatrización herida en un sistema de vida complejo implica una multitud de tipos celulares y señales moleculares; cada uno de ellos tiene el potencial para influir en las respuestas curativas.
En Resumen, el ensayo de rayado se ha encontrado para proporcionar proyección de alto rendimiento de la migración celular en respuesta a los cambiantes entornos6,25. Específicamente utilizamos este protocolo para detectar con éxito cambios en la migración celular como resultado de la exposición al arsénico en diversas dosis ambientales relevantes. Estos datos han proporcionado justificación para utilizar el ensayo de rayado para estudio y evaluar las vías mecanicistas de la migración celular en este análisis y cómo estas vías son alteradas por la exposición de arsénico.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número U54MD012388. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
