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体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

Published: February 23, 2019 doi: 10.3791/58838
Automatic Translation
1,4, 1, 1, 1,3, 1,2,4
1Department of Biological Sciences, Northern Arizona University, 2Department of Mechanical Engineering, Northern Arizona University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Northern Arizona University, 4Center for Bioengineering Innovation, Northern Arizona University

Summary

本研究は、創傷治癒 (スクラッチ試金) メカニズムとしてヒ素の影響細胞移行などどのように環境汚染物質を決定するための生体外モデルに焦点を当てください。結果は、このin vitroアッセイが生体内で実験する前に携帯電話の移行への変更の迅速かつ早期の徴候を提供することを示します。

Abstract

創傷治癒過程の生理学的メカニズムを理解すること多くの年の進行中の研究の焦点となっています。この研究は、傷の治療と患者の罹患率と死亡率を減少に使用される臨床基準の変更に直接変換されます。創傷治癒、細胞・組織の戦略的な相互作用と機能を必要とする複雑なプロセスです。創傷治癒の多くの非常に重要な機能の 1 つは、個人や集団の細胞移行です。傷害、時に周囲の結合、および上皮組織を急速に血液からさまざまな細胞化学的および/または物理的な刺激による創傷サイト移行します。この移行応答は、成果と癒しの傷の成功に大きく左右します。この特定の細胞機能を理解することは、改善された傷口治癒成果につながることができますトランスレーショナル医学にとって重要です。ここでは、創傷治癒とどのように携帯電話の環境への変更がこのプロセスを大きく変わることに関連した細胞の移行を理解するためのプロトコルについて述べる。この例における真皮線維芽細胞は、培養フラスコで単層培養として培地牛胎児血清 (FBS) で栽培されました。細胞は無菌培養治療 12 ウェル プレートに移され、100% 合流に成長しています。合流点に達したら、単層の細胞では p200 ピペット チップを使用して傷が垂直方向に。FBS を添加した培地で希釈したヒ素に追加された個々 の井戸で環境に関連する線量 0.1-10 m. 画像は細胞運動を観察する (傷倒立顕微鏡を使用して 24 時間期間 (h) 毎 4 時間をキャプチャされました。閉鎖)。画像を個別に画像解析ソフトウェアを使用して分析し、% 創傷閉鎖を求めた。結果は、ヒ素が創傷治癒を遅らせることを示しています。この手法は、創傷治癒過程における汚染物質の影響評価のための迅速かつ安価な最初の画面を提供します。

Introduction

創傷治癒は、複雑な一連のさまざまなセルタイプ、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス成分1を含む手順を重複するで構成されています。一緒に、これらのコンポーネントは、傷の解像度や修理は、最終的に外傷1の程度に応じて保護線維性瘢痕の形成につながるを達成するためにコンサートで動作します。個々 のプロセスと傷の機能をキャプチャするには、1 つの実験の治癒は困難です。創傷治癒過程の個々 のステップは、識別され、個別にテストする必要があります。創傷治癒の多くの手順の間で携帯電話の移行のプロセス考えられている重要な治癒率2を評価するとき。細胞移行で創傷治癒のすべての段階で観察することができます、このように分業の細胞移動に変更することができます創傷閉鎖にどのような影響を与えるかを理解。たとえば、細胞の移行は傷サイト3における血液凝固・血小板凝集との両方の初期と後期相炎症で見られます。これらのイベントは、組織3を欠いている負傷者の領域の塗りつぶしに一時的な閉塞を形成することにより過度の出血を防ぐ。循環中の血小板は合成され、遊走因子、炎症性白血球の遊走 (白血球) の負傷者の組織への一緒に信号修理4と共に血管作動性メディエーターの分泌されます。再上皮化は組織傷害の時間内で発生し、活動とさらに汚染を防ぐために上皮ケラチノ サイトの移行または傷サイト2に異物の侵入によって傷口をカバーが含まれます。これらの例は、関数に関連付けられている多くの細胞移動のいくつかは創傷治癒だけをキャプチャします。

スクラッチのアッセイは、説明し、細胞の遊走や創傷治癒の5,6に於いての多くの役割を理解するために使用されています。この試金簡単に割り切っていると見なされます、高スループット、代表的な細胞移行データを収集する治験責任医師をできます。移行の試金は特定の化合物が加速または細胞の移行6の速度が遅く、正常に実証しています。さらに、これらの分析結果はターゲット治療、注入濃度や生体内で実験する前に興味のある遺伝子を定式化する使用することができますトランスレーショナルリサーチの生理学的情報を提供します。アッセイでは、基本的な細胞培養の技術と供給、時間の経過や治療への応答の運動の動きをキャプチャする選択、およびイメージング技術のセルラインを必要があります。

アッセイは、容易に操作またはを調査員のニーズに合わせて選択できます。ただし、実験前に考慮する 4 つの基本的な質問があります。どのような一般的または特定の質問は、答えようとしている代表者ですか。これほとんど仮説研究を駆動に当てはまりますただし、パラメーターの多くは正確にするために必要な完全に質問にお答えを決定するためにこの試金する重要です。何は細胞または細胞の (複数の) の場合は、検討されている生理学的システムを表すに使用ください。たとえば、皮膚の創傷治癒研究、真皮線維芽細胞5,6、7、幹細胞8、または表皮ケラチノ サイト9は、通常見られる細胞集団を表すものと考えられる皮膚組織10で豊富。また、好中球、マクロファージやその他の炎症性細胞は、細胞遊走の創傷皮膚組織10内の他のコンポーネントを表すためこのシステムで評価でした。さらに、評価されている特定のセルの行を識別する、細胞の代謝活性を促進するために使用する最適などの試薬を識別するために役立ちます。細胞の移動であろう追跡イメージか。プレートやフラスコ内の細胞の移動を観察するためのテクニックの数があります。たとえば、染色や蛍光細胞をタグ付け、蛍光や共焦点イメージングを使用して、セルを追跡する非携帯場所対細胞と細胞運動11 を明確に定義する捜査官を可能にする強力な対照を提供します.この研究で説明したもう一つの一般的な手法は、位相コントラスト6,7倒立顕微鏡の使用です。細胞の色素と蛍光に代わるこの末期イメージングの前にセルを修正することがなくトラック セルを生きることができ、時間ポイント間細胞の負傷した単分子膜を含む個々 の井戸の同じイメージをキャプチャすることができます。どのような結果を測定は、分析に使用するでしょうか。調査中に収集画像を用いた細胞移行レートの変更を理解できるデータを生成することができます。私たちの研究室で倒立顕微鏡で撮影した顕微鏡画像の画像解析ソフトにアップロードされ、パーセントの傷口の閉鎖と曲線 (AUC) の面積の合計が計算されます。

我々 は、既知の環境汚染物質、ヒ素の存在下での皮膚線維芽細胞の移行への変更を明らかにするこのアッセイの特定の使用を強調表示されます。ヒ素は、地球の地殻内で見つかった天然メタロイドです。様々 な場所は、これらの場所の近くに住んでいる個人にリスクのヒ素の濃度の上昇と発見されています。その結果、食料と水のソースは、砒素にさらされる個人のための可能性を増加するヒ素汚染のレベルを増加するいると示されています。環境ヒ素暴露は上またはも下、現在アメリカ合衆国環境保護庁 (USEPA) 最大汚染レベル (MCL) 10 ppb (10 μ g/L)12,のひと集団における長期健康の結果に示されています。13.、米国の環境保護庁がこの MCL を設定、制限を飲んでも安全と判断したが、この制限を超えるヒ素濃度は珍しい世界の水源。南西部アメリカ合衆国の地下水、井戸水、温泉やヒ素14のレベルに関するを含む記載されています。たとえば、モンテズマの井戸は Verde の谷、アリゾナ、ヒ素15210 μ g/L 含まれています。ヴェルデ川、アリゾナ州周辺の地下水はピーク値 1.3 mg/L15,16に達するとヒ素の 16 μ g/L を平均すると、含まれています。特に、ヴェルデ川水小屋で多くの幸福のヒ素濃度は 50 μ g/L15,16を超えます。この知識は、環境に関連するヒ素濃度が 10 μ M (750 ppb) 現在で MCL 上記研究14,15,16に 0.1 μ M (7.5 ppb) で MCL の下からその範囲を選択,17,18,19,20.

これらの実験から収集した情報は、ヒ素に汚染された体内の傷細胞移行料金に潜在的な変更の早期指標として使用されます。その後、創傷治癒と細胞の移行を促進することで、役割に基づいたシグナリング分子を選択することができ、今後の量的なポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) をベース遺伝子発現実験を完了する現在のセットアップ可能性があります。研究。この試金の移行レートがヒ素の存在下で変化した場合特定の遺伝子標的細胞移行に伴うヒ素の有害な影響の標的になる可能性があり、従って混乱のメカニズムであるかもしれない。

Protocol

1. バイオ II キャビネット (BSC) の準備

注: このプロトコルで説明する方法は、無菌技術を達成するために良い研究所プラクティスを使用している間、個人用保護具と行われなければなりません。

  1. 営業の高さに BSC の保護ガラスを持ち上げ、層流ファンをオンに。
    1. 70% イソプロパノール水溶液を使用すると、作業領域の衛生ワイプを実行できます。後ろの壁と側壁から BSC をワイプし、ベース プレートまで作業します。
    2. 70% アルコール (イソプロパノールまたはエタノール) 試金で使用されるし、BSC 内に配置されるすべての材料を拭いてください。

2 T75 フラスコに播種ひと真皮線維芽細胞

  1. バイアル凍結目的のセル行 (新生児皮膚線維芽細胞 [hDFn] 500,000 セル/バイアル、細胞濃度、通路 p3 ~ p5) を取得します。
    1. 解凍できるように 37 ° C で 1.0 cm 深さの水のお風呂に細胞のバイアルを配置します。携帯ソリューションの約 70% が液体になるまでは、バイアルを解凍します。70% アルコールでバイアルを拭く、BSC 内バイアル ラックにバイアルを配置します。
      注: は、水に接触しないスレッドまたは細胞播種の中に潜在的な汚染を防ぐためにバイアルのキャップを確認します。水の細胞の完全な融解を防ぐお風呂そう失敗が意図しない細胞死を引き起こす可能性があります。
  2. 10 mL の培地 10% のうち、ウシ胎児血清 (FBS) を描画します。コート t75 フラスコ培養フラスコに吸引する自動 pipettor と 10 mL のピペット チップを使用します。完全に前後のフラスコを軽くロッキング フラスコのベースを飽和状態にするメディアを許可します。
    1. 細胞膜としてピペッティング速度に留意されて、バイアルからセル在庫、吸引ソリューションとオープン ・ バイアル法は凍結から無防備になります。
    2. メディア コート t75 フラスコ培養フラスコにセルを転送します。ピペッティング速度に留意されて再び培養フラスコに解凍セルを取り出します。
      注: 播種細胞培養フラスコの密度近似 6,600 セル/cm2であること。播種密度は、ユーザーと実験の必要なタイミングに合わせて変更できます。
    3. コート t75 フラスコ培養フラスコからのメディアの 1 つの mL を測定し、バイアルにボリュームを転送します。バイアルから T75 フラスコにボリュームを転送します。
      注: この手順を実行、バイアルからの細胞収率を最大化するために役立ちます。
    4. 組織培養のフラスコのキャップを締め、軽く表面全体に細胞懸濁液中で均一分散する揺り動かし。倒立顕微鏡を用いた細胞の均一な配分をチェックします。
  3. ラベル フラスコ細胞型、日付、イニシャル、系統、および目的 (例えばhDFn、2018/07/11、NDC、通路 4 ヒ素スクラッチ試金)。72 h の 37 ° C および 5.0% の CO2で加湿のインキュベーターで培養フラスコを配置します。
    注: 培ジメチルスルホキシド (DMSO)、cryopreservative の微量を削除する初期播種後 12-24 時間の変更をする必要があります、セルが正しく栄養を確保するためその後すべての 48 時間を変更します。孵化と成長の期間は、計算されたスクラッチのアッセイに必要な細胞数に依存します。HDFn 細胞の倍加時間は、通常の条件の下で 16-24 時間です。ただし、2 倍率上昇、pH、温度、湿度、メディアの種類等のため変更可能性があり、実験を計画するときに考慮する必要があります。

3. セルを数えると 12 も組織にサブカルチャー文化板

  1. インキュベーターからコート t75 フラスコ培養フラスコを取得します。客観的倍率 10 倍 (100 倍の合計倍率) で倒立顕微鏡を用いた付着細胞を観察し、おおよそセル合流点を決定します。
    1. 近似が最も代表的な割合を確保するため合流を観察するときは、組織培養のフラスコの大半をスキャンします。個々 の細胞の形態の異常、細菌や真菌の汚染を評価します。
  2. 10 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。廃棄物コンテナーに T75 転送ソリューションからメディアのフルボリュームを吸引するのに pipettor を使用します。ピペット先端部を防ぐ細胞付着表面へのお問い合わせ。バイオハザードのビンにピペット チップを破棄します。
    1. 5 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。バランスの取れた塩溶液の 5 mL を吸引、フラスコ、調剤、優しく余分なメディア、死んだ細胞や老廃物を洗浄するフラスコをロックします。
    2. コート t75 フラスコからボリュームを描画し、廃棄容器に分配します。バイオハザード箱にピペット チップを破棄します。
    3. 5 mL ピペット アダプターの自動 pipettor を組み立てます。在庫からトリプシンの 2 mL を吸引、フラスコ、調剤および付着細胞に酵素を分散させるためにフラスコを軽くロックします。付着性の表面の完全な飽和を確認します。2-3 分 (分) のためのインキュベーターで培養フラスコの場所。
      注: 最大酵素-基質反応は 10 分を超えない。
    4. 10 倍の対物レンズ倍率 (100 X 合計倍率) で倒立顕微鏡下で培養フラスコを観察します。細胞の剥離を容易にする穏やかな振動を適用します。
    5. 70% アルコールと BSC 内 T75 フラスコを拭いてください。
    6. 5 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。在庫からメディアの 5 mL を吸引し、酵素反応を停止するコート t75 フラスコ培養フラスコに追加します。メディア: トリプシンの比率は 3:1 にする必要があります。フラスコのベース上下ピペット 2-3 回洗浄し、反応が停止していることを確認します。フラスコと滅菌 15 mL の円錐管に転送からの流体の全集を吸い出しなさい。
    7. メディアの同一のボリュームで 2 番目 15 mL の円錐管を埋めます。
    8. お互いに正反対の位置に両方の 15 mL の円錐管を配置します。25 ° C で 5 分間遠心力の 200 g を機器の実行パラメーターを設定することによって適用されます。
    9. 70% アルコールで小球形にされたセルと 15 mL の円錐管をワイプし、BSC 内に配置します。
    10. ピペットで移しなさいメディア、約 250 μ L の液と細胞のペレットを残してオフに 5 mL 添付ファイル付き自動 pipettor を使用します。細胞ペレットを邪魔されずに残るべきである、ピペット先端の位置に注意を払います。廃棄物容器に回収量を調剤し、バイオハザード ビンでヒントを破棄します。
    11. 遠心管ラックを使用すると、邪魔し (「速いラック」とも呼ばれる) 細胞ペレットを再停止の迅速な振動を作成するバイアル スロットで円錐管の下部を実行しますします。
      注意: この手順を実行する渦のミキサーを使用しません。重力渦のミキサーによって作成されたセル g フォースのしきい値を超えるし、溶解を引き起こすことができます。正しく完了すると、新しいセル ソリューションがない残りのペレットと曇りの混合物として表示されます。この手順を実行する勤勉さはしばしば単一細胞懸濁液は、細胞をカウントする場合、精度が向上につながるを作成します。
    12. 細胞の在庫または再懸濁に 2 mL の培地を追加します。ピペット 20 チューブの横に優しく細胞回任意の塊を破る。総細胞懸濁液量を記録し、脇に簡潔に。
  3. ピペット 20 μ L のトリパン ブルー在庫 (0.4%)96 ウェル プレートの空井戸に滅菌ピペットを使用します。
    1. 転送する前に均一な細胞の懸濁液を生成する在庫の携帯ソリューションをミックスします。滅菌ピペット先端部を使用すると、(管の管壁に触れることを避ける) 細胞の在庫の 20 μ L を削除できます。96 ウェル プレートでトリパン ブルー溶液 20 μ L を加えます。
    2. 軽く内容をミックスにピペットで移しなさい。ピペット 10 μ L、coverslip とカウント間の混合物の検定の商工会議所します。
    3. 対物レンズ 10 倍下のグリッド セルを観察します。ビューのフィールド内で 9 つの大きな正方形を確認します。中心および 4 角正方形 (5 の正方形の合計) でのみのセルをカウントします。
      注: は、正確な数を確保するため全体のグリッド上で細胞の均一な分布を探します。
    4. 5 識別された正方形グリッドのすべてのセル (透明と青) を集計します。別に、同じ 5 正方形の淘汰 (青) セルだけを集計します。
    5. 生菌数を使用して計算します。Equation 1
      場所x 生菌数を = = セルの総数が、 b = 非実行可能なセル
    6. 生細胞密度を使用して計算します。Equation 2
      場所x = 実行可能な細胞密度と y = 実行可能なセルの合計。
    7. 生菌数を計算します。Equation 3
      場所x生菌数、 yを = = 実行可能な細胞密度、 f = 細胞懸濁液の体積 (mL)。
    8. % 細胞生存率を計算します。Equation 4
      場所xパーセント セル実行可能性、 yを = = 実行可能なセル グリッド、 fのカウント = セルの総数がグリッドにカウントします。
  4. イメージ投射の間の参照記号として 12 ウェル プレートの下部に水平方向の行をマークします。
    1. 細胞播種 12 ウェル培養プレートの入荷を希釈するメディアの量を計算する (3.3.7 で計算された) 実行可能なセル密度を使用します。
      注: 播種密度 hDFn セルの最適なセルは 5,000 のセル/cm2です。
    2. 19,000 セル/ml に細胞の在庫を希釈メディアを使用し、1 ml の細胞の在庫のすべての井戸をシードします。すべて 12 ウェルの間でシードも携帯できるように定期的にセル在庫をミックスします。
    3. セルの種類、系統、ユーザーの頭文字と目的と各板にラベルを付けます。37 ° C および 5.0% の CO2に設定のインキュベーターでプレートを配置します。スクラッチの試金のため 100% の合流点を達成するまでに成長します。

4. ヒ素 (As) 原液と計算

  1. 10% の細胞培養媒体に直接亜ヒ酸ナトリウム (NaAsO2) を希釈 10、1.0、0.1、0.01 μ M としての働く集中で政府短期証券。
  2. このため、メディアの 30 mL に亜ヒ酸ナトリウム 3.9 mg を希釈してソリューションとして初期 1 mM 在庫を確認します。順次残りのソリューションとして 1 mM の在庫を希釈します。
在庫として 1000 μ m計算 作業ストック濃度ヒ素 M1V1= M2V2 以前のヒ素ソリューションのボリューム メディアのボリューム ヒ素通常在庫量
NaAsO2分子の重量: 129.9 g/mol として 10 μ M (mL) x(1,000 μ M) = (30 mL)(10 µM) x = 0.3 mL 解決策として 1 mM の 0.3 mL = 300 μ L 29.7 mL メディア 30
.03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = ヒ素の 3.9 mg として 1.0 μ M (mL) x(10 μ M) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL 解決策として 10 μ M の 3 mL メディアの 27 mL 30
30 mL メディアに亜ヒ酸ナトリウム 3.9 mg を希釈します。 として 0.1 μ M (mL) x(1 μ M) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL 1 μ m として 3 mL メディアの 27 mL 30
として 0.01 μ M (mL) x(0.1 μ M) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL 0.1 μ m として 3 mL メディアの 27 mL 30

テーブル 1。ヒ素株式およびシリアルの希薄。As 溶液と治療群の原液の作業を作成する使用される計算を表します。

5. スクラッチ検定法とヒ素汚染の現状

  1. インキュベーターから細胞 12 ウェル プレートを取得します。対物レンズの倍率 (100 X 合計倍率) × 10 でセルを表示します。各ウェル内のセルの合流を決定します。
    注: スクラッチ前に 100% の合流点に達する各個々 よくする必要があります。この重要なステップはアッセイ内で整合性が確保され、実験の試金のプロトコルの標準化に役立ちます。どんな井戸 100% 合流点に達していない、すべての井戸が 100% 合流点に到達するまでさらに時間インキュベートする細胞を許可します。既に 100% の合流点に達している井戸でさらなる成長時間を受けません。合流するセル通常逮捕された成長になる、一方で、100% の合流点に到達するサブ合流井戸単層培養として残る。
  2. 10 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。すべての井戸のうち成長媒体を吸い出しなさい。液体廃棄物のボリュームと石綿箱にピペット チップを破棄します。
    1. 1-200 μ L 滅菌チップ p200 pipettor を組み立てます。各ウェルに、12 時から 6 時の場所に細胞表面の間で先端をグライダーでスクラッチ「モック傷」を生成します。
      注: が大幅に整合性に影響を与える 3 つの要素は、速度、圧力、および先端角。スクラッチは、プレートのベースに垂直に先端角度を意識しながら一定の圧力で迅速、実行必要があります。遅すぎる傷が原因の曲がった線、過剰な圧力スコアことができます完全に細胞付着面と先端角度 90 ° は傷の幅を狭くよりも少ない。変更された移動率とパターンこれらの共通の間違いの可能性があります。
    2. /ウェル バランスの取れた塩溶液の 1 mL と洗浄によって余分な残骸および細胞塊を取り除きなさい。ロック、プレート サイドにサイド洗浄を容易にします。井戸からバランスの取れた塩溶液を外し、廃棄物容器に廃棄します。石綿箱に 5 mL のピペット チップの処分します。

Figure 1
図 1: スクラッチ アッセイの略図。すべての作業は、汚染の可能性を減らすため、無菌のフィールド内で行われます。細胞培養フラスコで目的の密度でシードされ、人間の生理学的条件 (5% CO2、37 ° C) に設定インキュベーターで栽培します。目的の合流点に達したら、セルは必要な播種密度 12 ウェル培養プレートにサブ培養無菌。セル、12 ウェル プレートと滅菌ピペット先端部を使用して傷の各ウェルに 100% コンフルエントまでに育ちます。この「スクラッチ」は、体外模擬傷 (二重方向の矢印で表されます) 細胞が自然オープン エリア閉じる移行を作成します。それぞれまたすることができますが一意にエアコンと細胞移動率を観察してさまざまな治療条件に応じて定量化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 使用 p1000 pipettor 1,000 μ L チップ ピペット 1,000 μ L にヒ素を取り揃えておりますから治療群にランダムに割り当てられている井戸に。交差汚染を防ぐために、各ウェルの新しいピペット先端部を使用します。トリートメントを追加するとき時間を記録します。37 ° C および 5.0% の CO2で設定インキュベーターに 12 ウェルのプレートを配置します。

6. 画像

  1. 対物レンズの倍率 (0、4、8、12、16、20、および 24 h) 24 時間の期間にわたってすべての 4 h × 10、各ウェルの画像をキャプチャします。以前以降の時点で各ウェル内傷に沿って同じ場所の画像にプレートの底に描かれた線を参照します。
    注: 正確な画像解析を可能にし、代表的なデータを取得する各時点で同じ場所が撮影されていることが不可欠です。

7. 画像解析

  1. コンピューターを倒立顕微鏡で撮影した画像をアップロードし、詳細なファイル名を持つ JPEG 画像として保存します。
  2. ImageJ を開きます。
  3. ドラッグ アンド ソフトウェアのウィンドウにファイルをドロップして画像測定する際、ミリメートル (mm) にピクセルを変換するソフトウェアに既知の距離とステージ マイクロメータの画像をアップロードします。
    注: マイクロメータは読み手知られている 1 mm 長さ境界を定めるラインを持つ必要があります、画像はセルの画像をキャプチャするために使用同じ倍率で撮影する必要があります。たとえば、総合倍率 X 100 で撮影を行った本研究でこうしてステージ マイクロメータのイメージで撮影された合計倍率 × 100。
    1. ストレート、分割、またはフリーハンドの線のオプションをクリックします。
    2. 各目盛りに関連付けられた長さのティック マークを使用してマイクロメータ イメージ上の既知の距離の線を引くマーク。直線を描画する: マウスをクリックして、押したまま、カーソルを目的の場所にドラッグ、マウスを手放します。
    3. 分析スケールを設定を選択します。
    4. 前の手順で引かれた線の知られている長さに既知の距離を設定します。
    5. ミリメートルを長さの単位を設定します。
    6. グローバルのボックスを確認します。
    7. メニューを終了する[ok]を選択します。
    8. ステージ マイクロメータ イメージから閉じる。
  4. ImageJ にドラッグ アンド ドロップ イメージ ファイル] ウィンドウに 1 つのスクラッチ アッセイ イメージをアップロードします。
    1. (右のリーディング エッジに左のリーディング エッジ) からスクラッチの幅で直線を描画します。
    2. 描画される直線の測定値を記録するキーボードの文字Mを押します。小さな結果ウィンドウは、文字Mを入力した後すぐに表示されます。これは、幅測定がされます。
  5. 傷の長さに沿って 10 の測定を取得する 10 回の合計 7.4 の手順を繰り返します。
    注: 最初の全体の長さを最も具象的な幅の値を生成することが重要です。10 幅測定下に上から傷の長さに沿って等間隔で配置することを確認します。
  6. 測定値をコピペ スクラッチ アッセイ スプレッドシート ファイルを作成します。
    1. コピーしてスプレッドシート ファイル (表 2) の適切な列に結果ウィンドウから 10 幅の測定値を貼り付けます。
      注: 測定結果ウィンドウからコピーし、スプレッドシートに貼り付けるときがあります余分な列の値。これらの値は、10 の幅の測定値のみを保存する、削除されます。
10 のランダム幅の測定値 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10 の測定値の平均

表 2。生の幅の測定値は表形式です。生の測定値が得られるための組織構造を示します。

  1. スクラッチ アッセイ イメージの残りの部分について上記の手順を繰り返します。
  2. 各時間のポイント (0-24 h) すべての井戸のために 10 の測定値の平均を計算します。
  3. % 閉鎖手順 7.8 から値を使用して計算を決定します。
    1. スプレッドシート」幅測定平均値」のタイトルの下にテーブルを作成する (表 3)。
    2. コピーと貼り付けで計算された平均の 10 測定行「幅の測定値の平均を」テーブルに 7.8 をステップします。
    3. 幅測定平均値テーブルの横にある別のテーブルを作成します。これのタイトル表% 創傷閉鎖(表 4)。
      注: ゼロはすべての井戸の初期 0 h 写真でクローズ 0% 各ウェルの 0 h 列の値は 0 にする必要があります。
    4. (4 h) で次の列に移動します。
    5. 4、8、12、16、20、および 24 h タイム ポイントのパーセントの閉鎖を計算します。
      Equation 1
      どこで、x = パーセント閉鎖私初期傷幅 (0 h 幅) = f = 最終的なスクラッチ幅 (4、8、12、16、20、または 24 h)。
井戸幅の平均値します。 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1a
2a
3a
4 a
1b
2b
3b
4b
1 c
2 c
3 c
4 c

表 3。幅の測定値は平均表形式です。この表表 2に元の幅の測定値を使用して計算幅測定平均値の組織構造を示します。

まぁ 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1a 0
2a 0
3a 0
4 a 0
1b 0
2b 0
3b 0
4b 0
1 c 0
2 c 0
3 c 0
4 c 0

表 4。% は創傷閉鎖表形式です。パーセントの創傷閉鎖値計算表 3の平均幅の測定値を使用して組織の構造を示します。

  1. % 創傷閉鎖テーブルの横にある別のテーブルを作成します。これのタイトル表AUC (表 5)。
    1. 計算 0-4 0 - 4 曲線 (AUC) 値の下 h エリア各ウェルの h 列。
      Equation 1
      場所x = 0-4 h AUC 値、 0 h、 bの閉鎖率を = = 4 h、 hの閉鎖率 = (この研究で 4 h) の 2 つのメジャーの間の時間。
    2. 各ウェルの 4 ~ 8 h 列の曲線 (AUC) 値の下 4-8 h の領域を計算します。
      Equation 1
      場所x = 4-8 h AUC 値、 4 h、 bの閉鎖率を = = 8 h、 hの閉鎖率 = (この研究で 4 h) の 2 つのメジャーの間の時間。
      注: 1 つの AUC 値は、各ウェルの 24 時間の期間にわたって 4 h の時間間隔ごとに計算する必要があります。
    3. 各ウェルの AUC の合計値を取得する (手順 7.10.1-7.10.2 で計算された) 0 24 h から AUC 値のすべてを合計します。これらの値は統計分析のため保存正しくを確認します。
まぁ 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 時間 20-24 時間 合計 AUC
1a
2a
3a
4 a
1b
2b
3b
4b
1 c
2 c
3 c
4 c

表 5。AUC の表形式です。AUC 値計算表 4に閉鎖の値を巻き、% を使用して、このテーブルが組織構造を示しています。

8. 統計解析

  1. 実験的なデザインと、試験中に得られた合計の AUC 値の両方に最適な統計解析方法を決定します。

Representative Results

すべての治療群のサンプル サイズ (n) はn = 28。細胞が正常に培養次無菌テクニックと実験室のプロトコル (図 1)。制服の傷は、0.8 mm 0.4 mm (図 2) 平均の傷幅ですべての治療群間で観察されました。コントロール グループがあった [1,355.83; のカーブ値平均合計面積治療グループとして 0.01 μ M 平均であった 1,366.21; のカーブ値の下の領域の合計治療グループとして 0.1 μ M 治療群として 1.0 μ M 平均合計、1,326.24 のカーブ値の下の領域を持っていた、平均であった 1,295.10; のカーブ値の下の領域の合計最後に 10 μ M 治療群は統計的に低いである 535.12 の曲線の価値の下の平均合計面積と比較して他のすべてのグループ (p < 0.05) と (図 3)。R - 統計解析プログラム (p < 0.05) の治療群間に有意差を決定するためのテューキーホックをポスト調整で一方向の分散分析を実行する使用されました。

Figure 2
図 2: 代表的なスクラッチが 20 時間の期間にわたって画像をアッセイします。画像 A ~ D を表すコントロール セルの細胞の移行画像 E H 表す; 1.0 μ M で汚染された細胞の細胞移動画像 L として 10 μ M で汚染された細胞の細胞移動を表しています。これらの画像からヒ素の存在下で細胞の移行が遅くなることが明らかです。コントロール画像は、一方、他の 2 つの治療としてグループ「癒されていない"20 時間後完全に「治癒」ゼロを示しています。治療として 10 μ M は完全な閉鎖を抑制した 24 時間後に全くこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: ヒ素スクラッチ試験で携帯電話の移行が遅くなります。さまざまな濃度のヒ素の存在下での細胞移動率変化を観察する 24 時間の期間にわたって撮影。Raw 画像は、当初測定傷幅、パーセントの閉鎖、最終的に (AUC) 曲線下面積で計算されます (例えばMATLAB で)、自動化されたソフトウェアを使用して分析しました。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。治療グループとして 10 μ M は統計的にひと皮膚繊維芽細胞の新生児 (hDFn) テューキーのホックをポスト調整 (p と一方通行 ANOVA を使用して他のすべての治療群と比較して統計的に低い AUC 値で示す細胞移行を鈍化< 0.05)。統計的な差異は、R プログラムで使用できるコンパクトな文字表示法を使って得られた"A"と"B"の文字で表されます。共通の文字を共有しない治療が互いから統計的に有意 (p < 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

この試金のアプリケーションは、細胞運動の高スループットで的確な評価を提供し、直接に複雑な生理学的システム5,6,7に変換可能性があります。このため、提案のベンチ上モデル調整され創傷治癒6様々 な治療薬や環境毒素の効果を評価する練習します。現在の研究で使われるヒ素の濃度既知の暴露レベルの広範な文献検索環境に関連すると判断された、様々 なデータのレトロスペクティブ レビューから拠点14,15, 16,17,18,19,20,21。この体外スクラッチ法高は、しかし、環境に関連する範囲内でのヒ素濃度への暴露を示した、創傷閉鎖 (細胞移行) を遅延します。

このベンチ上モデルを分離し、さらに線維芽細胞の移行が創傷治癒成果に貢献する方法を理解する個々 のセル行 (繊維芽細胞) の研究も併せて行った。さらに、分析に干渉できる他の多くの細胞や組織の存在が複雑な体内システムの個々 のセル行の関数を研究することは困難です。さらに、アッセイは、創傷治癒に影響場合があります化合物、細胞の特定のメカニズムをターゲットに使用することができます半定量的パーセント創傷閉鎖データを達成するための手段を提供します。スクラッチの試金で使用されるセルに対して収集し必要な試薬に格納されているし、遺伝子発現で使用されることができますたとえば、(mRNA 信号) または蛋白質の表現を試金する22。この情報は、信号または蛋白質主原因さまざまな処置 (すなわちヒ素)22の存在下での細胞の移行の変化に理解を求める場合に、調査担当者にできます。

ヒト新生児皮膚線維芽細胞の創傷治癒における顕著な役割に基づいてこの仕事に選ばれました。ただし、このスクラッチの試金のプロトコルは種々 の細胞を使用して実装されては、研究目的の範囲。たとえば、スクラッチのアッセイは、腫瘍化学療法薬23; の遊走阻止を勉強するためのフィールドに採用されています骨格筋細胞の遊走・増殖・拡散24;細胞移行25; に植物エキスの影響を検討するにはケラチノ サイトの移行および拡散を創傷治癒9に貢献する方法を理解します。さらに、ピントらが以前報告は、スクラッチ試験6を使用して hDFn 移行に及ぼすウラン (U) と多血小板血漿 (PRP) を評価した.この作業の目的は、この試金が細胞移行 (U) を遅くと思ったエージェントとして細胞移行 (PRP) を高速化すると思ったエージェントの効果をテストできる範囲を把握するだった。上記の作品に見られるように、他の研究者は、スクラッチのアッセイの応用研究は、さまざまな実験モデル26使用の可能性が高い。詳細はメソッド内で提供される、にもかかわらず捜査官と実験の分散を期待すべき。たとえば、細胞移動率、可能性があります、一意のセルのタイプに必要な必須微量栄養素に加えて、使用中のセル行に基づいて変動します。セル収量および生存率で支援するために重要な観測の多くはこのプロトコルの全体でメモとして表示されます。捜査官一般的な細胞培養作業の補習授業としてこのメソッドを使用する最適な成長条件の製造元の推奨事項に従うことを強くお勧めします。

スクラッチの試金は非常に多彩な細胞活動の研究のため計測技術で予期せぬバイアスが生じることがあります。たとえば、セル移行の面を手動でトレースする ImageJ を使用して、バリエーションは精度と代表的なデータの収集を制限することができます、ユーザー間でにあります。また、ユーザーのバイアスを最小限に抑える治療に移行前線をブラインド読むことを注意する必要があります。さらに、細胞と視覚的に誤解を招くことができるフォームの焦点接着斑に到達する能力によって仮足を形成するための平均距離の誤算で手動で移行の面を識別する可能性があります。同じように、細胞表面に蛍光「携帯トラッカー」の使用染料または移行を検出する核蛋白質は細胞細胞移行時間の経過を測定する際の誤りの結果を定めることができる意図せず。正または負の値に適切なコントロールが完全にロバに実験内で登録することをお勧めしますが、細胞に対する治療の効果。その限界が認められこの試金の練習を行う必要があります。この試金はin vitroの実験から得られた細胞移行結果は、生体内で成果.に翻訳直接を保証しません複雑な生活における創傷治癒と細胞移行を含む多数の細胞の種類と分子信号;それぞれは治癒反応に影響を与える可能性があります。

要約すると、スクラッチのアッセイは、環境6,25の変更への応答における細胞移動の高速スクリーニングを提供するために発見されています。具体的には様々 な環境に関連する用量でヒ素曝露の結果として細胞の移行の変更を正常に検出するこのプロトコルを利用しました。これらのデータは、スクラッチの試金を使用して研究をさらにおよび細胞移行この試金およびヒ素暴露によってこれらの経路を変更する方法での生成経路を評価する正当な理由を提供しています。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この出版物で報告された研究は、少数の健康と受賞番号 U54MD012388 の下で健康の国民の協会の健康格差に関する国立研究所によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet Forma Scientific 15201-816
Nitrile Gloves Kimberly-Clark 55082
Water Bath Precision Model 182
Inverted Microscope Leica Q080318
CPR Centrifuge Beckman 349702
Analytical Scale Ohaus I093 1125062111P
Weighting paper VWR H351125781212A
Biohazard bags Fisherbran 01-830A
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 309739-31053
Hanks Balanced Salt Solution Gibco 14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 10566-016
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Automatic Pipettor Drummond 140685
p200 Pipette Gilson
p20 Pipette Gilson
Denominator Fisher Scientific D59707
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061
T75 tissue flask Corning 430725U
15 mL Conical Tube Fisherbrand 05-539-5
50 mL Conical Tube VWR 21008-178
5 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11D
10 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11E
Tissue Marker Securline 92167
Wipes Kintech 34155
70% Ethanol Fisher 63-67-0
Non-Filter Pipet Tips Fisherbrand 16160210
Bleach Great Value 220-04
96-well Falcon 353915
Cryovial Rack Nalgene 5030-0505
Hemacytometer Gizmo Supply B00SCOGY56
TrypLE Express Gibco 12605-028
Conical Tube Rack n/a n/a
12-well plate Corning 3598
Waste Beaker n/a n/a
1 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11B
Straight Edge Ruler n/a n/a
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) lot: 1734, 2902 106-05n
Rstudio Statistical Software ver: 3.5.1
Image J NIH ver: 1.8.0_112

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References

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環境科学、問題 144、スクラッチ アッセイ、細胞運動、創傷治癒、砒素、環境汚染物質、ひと皮膚線維芽細胞
<em>体外</em>皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。
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Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. … More

Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration. J. Vis. Exp. (144), e58838, doi:10.3791/58838 (2019).

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