Summary
Diese Studie konzentriert sich auf eine in-vitro- Modell der Wunde heilende (Scratch Assay) als Mechanismus zur Bestimmung wie Umweltschadstoffe wie Arsen Einfluss zelluläre Migration. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser in Vitro Assay schnelle und frühzeitige Hinweise auf Änderungen an zelluläre Migration vor dem in-Vivo -Experimente bietet.
Abstract
Das Verständnis der physiologischen Mechanismen der Wundheilung hat seit vielen Jahren im Mittelpunkt der Forschung. Diese Forschung führt direkt zu Veränderungen im klinischen Standards für die Behandlung von Wunden und abnehmende Morbidität und Mortalität bei Patienten. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der strategischen Zell- und Interaktion und Funktion benötigt. Eine der vielen kritisch wichtigen Funktionen der Wundheilung ist individueller und kollektiver zelluläre Migration. Nach Verletzungen Wandern verschiedene Zellen aus dem Blut, umgebende Binde- und epithelialen Gewebe rapide in der Wunde durch chemische und/oder physikalische Reize. Diese Migration Antwort kann weitgehend diktieren, die Ergebnisse und den Erfolg einer heilenden Wunde. Diese spezifische zelluläre Funktion zu verstehen ist wichtig für Translationale Medizin, die verbesserte Wundheilung Ergebnissen führen kann. Hier beschreiben wir ein Protokoll verwendet, um zellulare Migration besser zu verstehen, wie es bezieht sich auf die Wundheilung, und wie Änderungen an der zellulären Umgebung diesen Prozess erheblich verändern können. In diesem Beispiel-Studie wurden dermale Fibroblasten in Medien mit fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt als Monolayer-Kulturen im Gewebe Kulturflaschen angebaut. Zellen wurden aseptisch in Gewebekultur behandelt 12-Well-Platten übertragen und zu 100 % Zusammenfluss gewachsen. Nach dem Zusammenfluss erreichen, wurden die Zellen in der Monolage vertikal zerkratzt mit einer p200 Pipettieren Spitze. Arsen verdünnt in Kulturmedien mit FBS ergänzt wurde einzelnen Wells in ökologisch hinzugefügt, dass relevante Dosen im Bereich von 0,1-10 M. Bilder aufgenommen wurden, alle 4 Stunden (h) über einen Zeitraum von 24 Stunden mit einer invertierten Lichtmikroskop, zelluläre Migration zu beobachten (Wunde (Schließung). Bilder wurden einzeln mit Bildanalyse-Software analysiert und Prozent Wunde Schließung wurde berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass Arsen die Wundheilung verlangsamt. Diese Technik bietet einen schnellen und kostengünstigen ersten Bildschirm für die Bewertung der Auswirkungen von Schadstoffen auf die Wundheilung.
Introduction
Wundheilung besteht aus einer komplexen Abfolge von überlappenden Schritte, bei denen verschiedene Zelltypen, Signalmoleküle und extrazelluläre Matrix Komponenten1. Diese Komponenten zusammenarbeiten, gemeinsam, um zu erreichen, Wunde Auflösung oder Reparatur, was letztendlich zur Bildung einer schützenden fibrotische Narbe je nach Trauma1führt. Um die einzelnen Prozesse und Funktionen der Wunde zu erfassen ist es schwierig, die Heilung in einem Experiment. einzelnen Schritte innerhalb der Wundheilung müssen identifiziert und separat getestet werden. Unter den vielen Schritten der Wundheilung ist der Prozess der zelluläre Migration kritisch betrachtet worden, heilende Sätze2Bewertung. Zelluläre Migration in allen Phasen der Wundheilung beobachtet werden und somit erfordert weitere Verständnis wie Änderungen an Zellwanderung Wundverschluss auswirken können. Zum Beispiel wird zelluläre Migration in beiden frühen und späten Phase Entzündung mit Blut Koagulation und Thrombozyten-Aggregation auf die Wunde Seite3gesehen. Diese Ereignisse verhindern übermäßigen Blutverlust durch die Bildung einer vorübergehende Blockade um verwundete Flächen frei von Gewebe3zu füllen. Thrombozyten im Umlauf werden synthetisieren und sezernieren vasoaktive Mediatoren zusammen mit chemotaktische Faktoren, welche zusammen Signal für entzündliche Leukozyte Migration (weiße Blutkörperchen) des verletzten Gewebes für Reparatur4. Re Epithelisierung erfolgt innerhalb von Stunden von Gewebeverletzungen und beinhaltet Abdeckung der Wunde durch Aktivität und Migration von epithelialen Keratinozyten um weitere Verschmutzung zu verhindern oder Invasion von Fremdkörpern in die Wunde Seite2. Diese Beispiele erfassen nur wenige der vielen Zellwanderung, die Funktionen im Zusammenhang mit Wundheilung.
Der Scratch-Test worden beschrieben und zum besseren Verständnis Zellwanderung und seine vielen Rollen in5,6der Wundheilung verwendet. Dieser Assay gilt als simpel, bietet hohen Durchsatz und ermöglicht die Ermittler, repräsentative Zelle Migrationsdaten zu sammeln. Migration-Assays haben erfolgreich gezeigt, dass bestimmte Verbindungen können beschleunigen oder die Rate der zelluläre Migration6 verlangsamen. Darüber hinaus bieten diese Untersuchungsergebnisse translationale physiologische Informationen, die verwendet werden, um die Ziel-Behandlungen, Dosierung Konzentrationen und Gene von Interesse vor in Vivo Experimente zu formulieren. Der Test erfordert Grundzelle Kulturtechniken und Lieferungen, eine Zelllinie Wahl und imaging-Technologie, Bewegung oder Bewegung als Reaktion auf die Behandlungen zu erfassen.
Der Test kann leicht manipuliert oder zugeschnitten auf die Bedürfnisse des Prüfers. Allerdings gibt es vier grundlegende Fragen zu prüfen, vor dem experimentieren. Welche allgemeine oder spezifische Frage (n) ist/sind der Prüfleiter zu beantworten versuchen? Dies gilt auch für die meisten Hypothesen Forschung; Allerdings ist es wichtig zu diesem Test, weil es viele Parameter benötigt, um präzise und vollständig beantwortet die Frage (n) bestimmt wird. Was Zelllinie oder Zellinien (falls mehrere) sollten zur Darstellung der physiologischen Systems untersucht? Zum Beispiel in einer kutanen gewickelt, heilende Studie, dermalen Fibroblasten5,6,7, Stammzell-8oder epidermalen Keratinozyten9 könnte als Zellpopulationen gewertet, die normalerweise zu finden sind in Hülle und Fülle in Haut Gewebe10. Alternativ konnte die neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und anderen Entzündungszellen in diesem System darzustellen Zellwanderung anderer Komponenten der Wundheilung innerhalb der Haut Gewebe10ausgewertet werden. Darüber hinaus hilft identifizieren die spezifischen Zellinie evaluiert um zu identifizieren, welche Reagenzien optimal zu nutzen, um metabolische Aktivität der Zellen zu fördern sind. Wie wird die Zellwanderung verfolgt/abgebildet sein? Es gibt eine Reihe von Techniken zur Zellwanderung innerhalb einer Platte oder einer Flasche zu beobachten. Zum Beispiel bietet färben oder Gewebekulturen tagging Zellen und Fluoreszenz oder confocal imaging verwenden, um Zellen zu verfolgen einen starken Kontrast, wodurch die Ermittler zu zellulären vs. nicht-Mobilfunk-Standorte und zelluläre Bewegung11 klar definieren . Eine weitere gängige Technik, beschrieben in dieser Studie ist die Verwendung der invertierten Lichtmikroskopie mit Phase Kontrast6,7. Diese Alternative zu Zelle Farbstoffe und Fluoreszenz ermöglicht dem Benutzer, Track Zellen Leben, ohne Zellen vor Bildgebung unheilbar zu beheben und ermöglicht auch für die Aufnahmen der gleichen einzelnen Wells mit verwundeten Monolagen Zellen über Zeitpunkte. Welches Ergebnis misst, wird für die Analyse verwendet werden? Die Verwendung der Bilder gesammelt während der Studie Daten erzeugt werden können, in denen Änderungen an zelluläre Migration verstanden werden können. In unserem Labor mikroskopische Bilder auf dem invertierten Lichtmikroskop, Bildanalyse-Software hochgeladen werden und die prozentuale Wundverschluss und summierte Fläche unter der Kurve (AUC) werden berechnet.
Wir beleuchten den gezielten Einsatz von diesem Assay, Änderungen zur Migration der dermalen Fibroblasten in Anwesenheit von bekannten Umwelt Verunreinigung, Arsen aufzuklären. Arsen ist ein natürlich vorkommendes Halbmetall gefunden innerhalb der Erdkruste. Verschiedenen Orten fanden mit erhöhten Konzentrationen von Arsen, die eine Gefahr für Personen darstellt, die in der Nähe von diesen Orten leben. Infolgedessen wurden Nahrung und Wasser Quellen gezeigt, Arsen Kontaminationsgrad gestiegen, das erhöht die Wahrscheinlichkeit für den einzelnen Arsen ausgesetzt werden. Ökologische Arsen Exposition hat nachweislich langfristigen gesundheitlichen Folgen in menschlichen Populationen oberhalb oder auch unterhalb der aktuellen United States Environmental Protection Agency (USEPA) Max Verunreinigung Ebene (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. Obwohl das USEPA hat diese MCL und hielt es trinkbar Grenzen, Arsenkonzentrationen, die dieses Limit überschreiten sind keine Seltenheit in Wasserquellen weltweit. Im Südwesten der Vereinigten Staaten, wurden zahlreiche Grundwasser Brunnenwasser und Quellen dokumentiert, um Bezug auf Niveaus von Arsen14enthalten. So enthält z. B. im Verde Valley, AZ, Montezuma gut 210 µg/L Arsen15. Grundwasser rund um den Fluss Verde, AZ enthält 16 µg/L Arsen durchschnittlich, mit Spitzenwerten bis 1,3 mg/L15,16. Vor allem überschreiten Arsenkonzentrationen in vielen Brunnen in der Verde River Wasser Schuppen 50 µg/L15,16. Mit diesem wissen, umweltrelevante Arsen-Konzentrationen wurden ausgewählt, dieses Bereichs von unten die MCL bei 0,1 µM (7,5 ppb), um über die MCL bei 10 µM (750 ppb) in der aktuellen Studie14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Aus diesen Experimenten gesammelten Informationen dienen als ein Frühindikator für mögliche Änderungen an zelluläre Migration in einem in Vivo Wunde mit Arsen verseucht. Danach, Signalisierung, dass Moleküle ausgewählt werden können abhängig von ihrer Rolle in der Wundheilung und zelluläre Migration zu erleichtern, und künftige quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) basierte gen Ausdruck Experimente können nach Abschluss des aktuellen eingerichtet werden Studien. Wenn Migration Rate in diesem Assay in Anwesenheit von Arsen zu ändern, spezifisches gen Ziele zelluläre Migration beteiligt möglicherweise das Ziel für die schädlichen Auswirkungen von Arsen, und so können der Mechanismus der Störung sein.
Protocol
1. Vorbereitung eines Biosafety II-Kabinetts (BSC)
Hinweis: Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sollten mit persönlichen Schutzausrüstungen, während mit der guten Laborpraxis zu aseptischen erreichen durchgeführt werden.
- Heben Sie das BSC-Schutzglas, Arbeitshöhe und Laminar-Flow-Ventilatoren einschalten.
- Verwenden Sie 70 % Isopropanol wässriger Lösung um ein Hygiene-Abwischen des Arbeitsbereichs durchzuführen. Wischen Sie BSC von der Rückwand und Seitenwände und arbeiten auf der Grundplatte.
- Wischen Sie alle Materialien, die in der Probe mit 70 % Alkohol (Isopropanol oder EtOH) verwendet werden und legen Sie sie in den BSC.
(2) menschlichen dermalen Fibroblasten Aussaat in ein Auffanggefäß T75
- Fläschchen mit der gewünschten kryokonservierten Zelllinie (neonatale menschlichen dermalen Fibroblasten [hDFn] Zellkonzentration von 500.000 Zellen/Vial und Durchgang p3-p5) erhalten.
- Platzieren Sie ein Fläschchen mit Zellen in einem 1,0 cm tiefen Wasserbad bei 37 ° C, auftauen lassen. Tauen Sie Fläschchen, bis ca. 70 % der Zelle Lösung flüssig ist. Fläschchen mit 70 % Alkohol wischen Sie ab und Fläschchen in Vial Rack im BSC.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Wasser nicht in Kontakt mit Fäden oder Kappe der Durchstechflasche zu potentiellen Kontamination während der Zelle Aussaat zu verhindern kommen. Zu verhindern, komplett Auftauen der Zellen im Wasser Baden, da andernfalls unbeabsichtigte Zelltod führen kann.
- Platzieren Sie ein Fläschchen mit Zellen in einem 1,0 cm tiefen Wasserbad bei 37 ° C, auftauen lassen. Tauen Sie Fläschchen, bis ca. 70 % der Zelle Lösung flüssig ist. Fläschchen mit 70 % Alkohol wischen Sie ab und Fläschchen in Vial Rack im BSC.
- Ziehen Sie 10 mL Medien ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS). Verwenden Sie eine automatische Pipette und 10 mL Pipette Tipp um in T75 Gewebekultur Flasche abzusaugen. Können Sie Medien voll sättigen die Basis des Kolbens durch sanft schaukelnden den Kolben hin und her.
- Geöffnet Fläschchen mit Zelle Lager und Aspirat Lösung aus der Durchstechflasche, achtsam Pipettieren Geschwindigkeit wie Zellmembranen von Kryokonservierung gefährdet wird.
- Übertragen Sie Zellen auf einem T75 Gewebe Kolben mit Medien. Werfen Sie aufgetauten Zellen in Gewebe Kolben wieder achtsam Pipettieren Geschwindigkeit aus.
Hinweis: Seeding Dichte der Zellen im Gewebe Kolben zu 6.600 Zellen/cm2angenähert ist. Dichte Aussaat kann geändert werden, um die Benutzer und die gewünschte Zeitpunkt des Experimentierens unterzubringen. - Medien aus T75 Gewebe Flasche 1 mL abmessen und Volumen zurück in die Flasche zu übertragen. Übertragen Sie Volumen aus dem Fläschchen zurück in den Kolben T75.
Hinweis: Dieser Schritt hilft Zellausbeute aus der Durchstechflasche zu maximieren. - Ziehen Sie die Gewebekultur Kolben Mütze und schütteln um Zellen in Suspension gleichmäßig über die gesamte Fläche zu verteilen. Überprüfen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen mit einem inversen Mikroskop.
- Etikett Flasche mit Zelltyp, Datum, Initialen, Herkunft und Zweck (z.B. hDFn, 11.07.2018, NDC, Abschnitt 4, Arsen-Scratch-Assay). Gewebekultur Kolben in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5,0 % CO2 72 h zu platzieren.
Hinweis: Wachstumsmedium sollte geänderte 12-24 h nach der ersten Aussaat um Spuren von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) cryopreservative zu entfernen, und dann verändert alle 48 h danach um sicherzustellen, dass die Zellen richtig ernährt werden. Die Inkubation und Wachstum Zeitraum hängt die berechnete Anzahl von Zellen für den Scratch-Test benötigt. Die Verdopplungszeit für hDFn Zellen ist in der Regel 16-24 h unter normalen Bedingungen. Jedoch verdoppeln kann aufgrund der Höhe, pH-Wert, Temperatur, feuchte, Medientyp, etc.ändern, und muss bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden.
3. Zelle zählen und Subkultur in 12-Well Tissue Culture Platte
- T75 Gewebekultur Kolben aus Inkubator abrufen. Beobachten Sie eingehalten mit einem inversen Mikroskop bei 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung) Zellen zu und bestimmen Sie die ungefähre Zelle Zusammenfluss.
- Scannen Sie den Großteil der Gewebekultur-Kolben, wenn beobachten Zusammenfluss Sicherstellung den repräsentativsten Prozentsatz angenähert wird. Einzelne Zelle Morphologie für Auffälligkeiten oder bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu bewerten.
- Montieren Sie die automatische Pipette mit einer 10 mL-Pipette-Spitze. Verwenden Sie Pipette, um das volle Volumen der Medien von der T75 und Transfer-Lösung zu einem Abfallbehälter Aspirieren. Kontaktaufnahme mit der anhaftenden Zelloberfläche Pipettieren Tipp zu verhindern. Entsorgen Sie Pipettenspitze in einen Biohazard Behälter.
- Montieren Sie die automatische Pipette mit einer Pipettenspitze 5 mL. Aspirieren Sie 5 mL der ausgeglichenen Salzlösung, verzichten in der Flasche und schütteln Sie die Flasche um überschüssige Medien, abgestorbene Zellen und Abfallprodukte zu spülen.
- Das Volumen aus dem T75 ziehen und in den Abfallbehälter zu verzichten. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in die Biohazard bin.
- Montieren Sie die automatische Pipette mit 5 mL Pipette Adapter. Aspirieren 2 mL Trypsin ab Lager, verzichten in der Flasche und schütteln Sie die Flasche um das Enzym über die eingehalten Zellen zu verteilen. Vollständige Sättigung der anhaftende Oberfläche zu gewährleisten. Ort der Gewebe-Küvette in den Inkubator für 2-3 Minuten (min).
Hinweis: Die maximale Enzym-Substrat-Reaktion sollte 10 min nicht überschreiten. - Die Gewebe-Flasche unter einem inversen Mikroskop bei 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung) zu beobachten. Wenden Sie sanfte Schwingungen um die Zelle Loslösung zu erleichtern.
- Wischen Sie die T75-Flasche mit 70 % Alkohol und im Inneren der BSC.
- Montieren Sie die automatische Pipette mit einer Pipettenspitze 5 mL. Aspirieren Sie 5 mL von Medien aus dem Bestand und verleihen der T75 Gewebe Küvette, die Enzym-Substrat-Reaktion zu stoppen. Medien: Trypsin-Verhältnis sollte 3:1. Pipettieren auf und ab der Basis des Kolbens 2-3 Mal ausspülen und sicherstellen, dass die Reaktion gestoppt hat. Das komplette Volumen der Flüssigkeit aus der Flasche und Überführung in eine sterile 15 mL konische Rohr abzusaugen.
- Füllen Sie eine zweite 15 mL konische Rohr mit einem identischen Volumen von Medien.
- Legen Sie beide 15 mL konische Röhrchen in eine antipodische Position zueinander. Gelten Sie 200 g der Zentrifugalkraft für 5 min bei 25° C durch die Einstellung des Gerätes laufen Parameter.
- Wischen Sie die 15 mL konische Rohr mit gebeizte Zellen mit 70 % Alkohol und legen in der BSC.
- Verwenden Sie die automatische Pipette mit einer 5 mL-Bindung an Pipettieren von Medien, hinterließ rund 250 µL Flüssigkeit und Zelle Pellet. Achten Sie auf die Position der Spitze pipettieren, wie die Zelle Pellet ungestört bleiben sollte. Verzichten Sie die Lautstärke in einem Abfallbehälter gesammelt und entsorgen Sie die Spitze in einem Biohazard bin.
- Verwenden Sie eine Microcentrifuge Schlauch Rack, unten das konische Rohr auf die Fläschchen Schlitze, erstellen eine schnelle Schwingung, um zu stören und erneut aussetzen der Zelle Pellet (manchmal genannt "rack-Rechen") laufen.
Hinweis: Vermeiden Sie, mit einem Vortex-Mixer um diesen Schritt auszuführen. Erstellt von Vortex Mixer Gravitationskräfte Zelle g-Force Schwellenwerte überschreiten und Lyse verursachen. Wenn korrekt abgeschlossen, erscheint die neue Zelle-Lösung als eine trübe Mischung mit keine verbleibenden Pellets. Fleiß, die Durchführung dieses Schrittes wird oft eine einzelne Zelle Aufhängung, führt zu erhöhte Genauigkeit beim zählen von Zellen schaffen. - Die Zelle Lager oder Wiederfreisetzung 2 mL Medien hinzufügen. Pipettieren der Zellen sanft auf der Seite des Rohres 20 Mal, um bis alle Klumpen zu brechen. Erfassen die gesamte Zellvolumen Aussetzung und beiseite kurz.
- Pipettieren 20 µL Trypan blau Lager (0,4 %) in einen leeren Brunnen einer 96-Well-Platte mit einer sterilen pipettieren.
- Mischen Sie die Lager Zelle Lösung um eine einheitliche Zellsuspension vor der Übertragung zu generieren. Verwenden Sie einen sterilen Pipettieren Tipp um 20 µL der Zelle Lager (Vermeidung berühren die Rohrwände) entfernen. Hinzu kommt die 20 µL Trypan blau-Lösung in der 96-Well-Platte.
- Pipettieren sanft, Inhalt zu mischen. Pipettieren 10 µL der Mischung zwischen dem Deckglas und die Zählung auf der Hemocytometer Kammer.
- Beobachten Sie die Zellen und das Raster unter einem 10 X-Objektiv. Beobachten Sie neun große Quadrate in das Blickfeld. Zählen von Zellen nur in der Mitte und 4 Eckquadrate (insgesamt 5 Kästchen).
Hinweis: Suchen Sie eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über das gesamte Netz um eine genaue Zählung zu gewährleisten. - Decken Sie alle Zellen (transparent und blau) in die 5 identifizierten Quadrate des Gitters. Decken Sie separat, nur die zellfreie (blauen) Zellen in der gleichen 5 Quadrate.
- Lebensfähige Zelle zählen mit zu berechnen:
wo X = Anzahl der lebensfähigen Zellen, ein = total Zellen, b = nicht lebensfähige Zellen - Berechnen Sie die lebensfähigen Zelle Dichte mit:
wo X = tragfähige Zelldichte und y = Summe der lebensfähigen Zellen. - Berechnen Sie insgesamt vitaler Zellen:
wo X = insgesamt vitaler Zellen, y tragfähige Zelldichte, f = = Aussetzung Zellvolumen (mL). - Berechnen Sie % Zellviabilität:
wo X = prozentuale Zellviabilität, y = lebensfähige Zellen gezählt auf Raster, f = total Zellen gezählt auf Raster.
- Markieren Sie eine horizontale Linie am unteren Rand der 12-Well-Platte als Referenzzeichen während der Bildgebung dienen.
- Verwenden Sie die tragfähige Zelldichte (gerechnet in 3.3.7) zu berechnen Sie das Volumen der Medien, Zelle vorrätig für die Aussaat einer Gewebekultur 12-Well-Platte zu verdünnen.
Hinweis: Die optimale Zelle Dichte für hDFn Zellen Aussaat ist 5.000 Zellen/cm2. - Zelle bestand bis 19.000 Zellen/mL zu verdünnen mit Medien und Saatgut jedes gut mit 1 mL der Zelle bestand. Mischen Sie Zelle bestand in regelmäßigen Abständen auch Zelle über alle 12 Brunnen Aussaat zu gewährleisten.
- Beschriften Sie jede Platte mit der Zelltyp, der Abstammung, die Benutzerinitialen und den Zweck. Platzieren Sie Platten im Inkubator auf 37 ° C und 5,0 % CO2festgelegt. Können Sie Zellen wachsen, bis 100 % Zusammenfluss für Scratch-Test erreicht wird.
- Verwenden Sie die tragfähige Zelldichte (gerechnet in 3.3.7) zu berechnen Sie das Volumen der Medien, Zelle vorrätig für die Aussaat einer Gewebekultur 12-Well-Platte zu verdünnen.
4. Arsen (As) auf lagerlösungen und Berechnungen
- Natrium-Arsenat (Osteoporosis2) direkt in Zellkulturmedien mit 10 % verdünnen FBS bei Working-Konzentrationen von 10, 1,0 und 0,1 0,01 µM als.
- Hierzu stellen Sie eine anfängliche 1 mM Lager als Lösung durch Verdünnung 3,9 mg Natrium Arsenat in 30 mL der Medien. Seriell verdünnen Sie 1 mM Lager für die verbleibenden als Lösungen.
| 1000 µM als Lager Berechnungen | Arsen arbeiten Lager Konzentrationen | M1V1= M2V2 | Volumen der vorherigen Arsen Lösung | Volumen von Medien | Gesamtvolumen von Arsen arbeiten Lager |
| Osteoporosis2 Molekulargewicht: 129.9 g/Mol | 10 µM als | (x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) X = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µL 1mM als Lösung | 29,7 mL Medien | 30 |
| .03 L x.001 Mol/L X 130 g/Mol = 3,9 mg Arsen | 1,0 µM als | (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) X = 3 mL | 3 mL 10 µM als Lösung | 27 mL Medien | 30 |
| Verdünnen Sie 3,9 mg Natrium Arsenat in 30 mL Medien | Als 0,1 µM | (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) X = 3 mL | 3 mL 1 µM als | 27 mL Medien | 30 |
| 0,01 µM als | (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) X = 3 mL | 3 mL 0,1 µM als | 27 mL Medien | 30 |
Tabelle 1. Arsen Aktien und serielle Verdünnungen. Diese Tabelle erklärt die Berechnungen zur Erstellung der As-Stammlösungen und arbeiten auf Lagerlösungen für Behandlungsgruppen.
(5) kratzen Sie Assay Technik und Arsen Verschmutzung
- Erhalten Sie eine 12-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Sehen Sie Zellen auf einem 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung). Zelle Zusammenfluss innerhalb jedes gut zu bestimmen.
Hinweis: Jedes einzelne gut muss 100 % Zusammenfluss vor verkratzen erreicht. Dieser entscheidende Schritt sorgt für Konsistenz innerhalb der Assay und hilft Assay Protokolle über Experimente zu standardisieren. Wenn Brunnen nicht 100 % Zusammenfluss erreicht haben, können Sie Zellen zu inkubieren zusätzliche Zeit bis alle Brunnen 100 % Zusammenfluss erreicht haben. Zusätzliches Wachstumszeit in Brunnen, die bereits 100 % Zusammenfluss erreicht haben bleiben unberührt. Konfluierende Zellen werden in der Regel Wachstum verhaftet werden und bleiben als Monolayer Kultur, wobei Sub konfluierende Brunnen, Zusammenfluss von 100 % zu erreichen. - Montieren Sie eine automatische Pipette mit einer 10 mL-Pipette-Spitze. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium aus allen Brunnen. Entsorgen Sie die Lautstärke in flüssiger Abfälle und die Pipettenspitze in die Biogefährdung bin.
- Montieren Sie eine p200-Pipette mit einer 1-200 µL steriler Spitze. Produzieren Sie in jede Vertiefung einen Kratzer "mock Wunde" gleiten die Spitze über Zelloberfläche von einer 12-Uhr auf 6-Uhr Position.
Hinweis: Sind drei Faktoren, die Konsistenz stark beeinflussen, Geschwindigkeit, Druck und Spitzenwinkel. Der Kratzer sollte rasch, mit einem konstanten Druck durchgeführt werden, dabei denken Sie an die Spitzenwinkel senkrecht zur Basis der Platte zu bleiben. Zu langsam kratzen verursachen krumme Linien, Überdruck kann dauerhaft Punkten anhaftenden Zelloberflächen und eine Spitzenwinkel weniger als 90° Scratch breite schmal wird. Alle diese häufigen Fehler führt zu veränderten Migration Preise und Muster. - Entfernen Sie überschüssige Schmutz und Zelle Klumpen durch Spülen mit 1 mL einer ausgeglichenen Salzlösung pro Bohrloch. Rock die Platte-seitliche Reinigung zu erleichtern. Entfernen Sie die ausgeglichene Salzlösung aus Brunnen und in einem Abfallbehälter zu entsorgen. Die Pipettenspitze 5 mL in den biologischen Behälter entsorgen.
- Montieren Sie eine p200-Pipette mit einer 1-200 µL steriler Spitze. Produzieren Sie in jede Vertiefung einen Kratzer "mock Wunde" gleiten die Spitze über Zelloberfläche von einer 12-Uhr auf 6-Uhr Position.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scratch Assays. Alle Arbeit erfolgt im Rahmen einer aseptischen Bereich um die Möglichkeit einer Kontamination zu verringern. Zellen sind bei einer gewünschten Dichte im Gewebe Kulturflaschen ausgesät und gewachsen in einem Inkubator auf menschlichen physiologischen Bedingungen (5 % CO2, 37 ° C) festgelegt. Nach dem Erreichen eines gewünschten Zusammenfluss, sind Zellen Sub aseptisch in 12-Well-Zellkultur-Platten bei einer gewünschten Aussaatdichte kultiviert. Zellen werden zu 100 % Zusammenfluss in jede Vertiefung des 12-Well-Platte und zerkratzte mit einer sterilen Pipettieren Spitze angebaut. Diese "Scratch" schafft eine in-vitro- mock Wunde (gekennzeichnet durch Leitung Doppelpfeil), in der Zellen natürlich wandern um den offenen Bereich zu schließen. Jedes gut kann eindeutig konditioniert werden und zelluläre Migration Preise können beobachtet und in Reaktion auf verschiedene Behandlungsbedingungen quantifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Verwenden Sie eine Pipette p1000 mit 1.000 µL Spitze zu pipettieren 1.000 µL aus Arsen Bestände in Vertiefungen, die mit einer Behandlungsgruppe zugelost. Verwenden Sie einen neues Pipettieren Tipp für jedes gut, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Notieren Sie die Zeit, wenn Behandlungen hinzugefügt werden. Platz 12-Well Platten im Brutschrank bei 37 ° C und 5,0 % CO2eingestellt.
6. Bildgebung
- Aufnahmen von jeder gut, 10 X Objektiv Vergrößerung alle 4 Std. über einen Zeitraum von 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 und 24 h). Die Bezugslinie zuvor auf der Unterseite der Platte an der gleichen Stelle entlang der Kratzer innerhalb jedes gut zu späteren Zeitpunkten Bild gezeichnet.
Hinweis: Es ist zwingend notwendig, dass die gleichen Standorte werden fotografiert, zu jedem Zeitpunkt ermöglicht präzise Bildanalyse und repräsentative Daten zu erhalten.
7. die Bildanalyse
- Laden Sie Bilder auf dem invertierten Lichtmikroskop an einen Computer erfasst und als ein JPEG-Bild mit einem ausführlichen Dateinamen speichern.
- ImageJ zu öffnen.
- Hochladen Sie ein Bild von einem Mikrometer Bühne mit bekannten Entfernungen zur Software Pixel in Millimetern (mm) zu konvertieren, wenn Bild Messungen per Drag & Drop die Datei in das Softwarefenster.
Hinweis: Das Mikrometer sollten Linien Abgrenzung einer bekannten 1 mm Länge und der Aufnahme muss mit der gleichen Vergrößerung verwendet, um Bilder von Zellen zu erfassen. Zum Beispiel wurde in dieser Studie wurden die Bilder bei 100 X Gesamtvergrößerung, damit das Bild von der Bühne Mikrometer auf 100 X Gesamtvergrößerung getroffen.- Klicken Sie auf den geraden, segmentierteoder Freihandlinien Optionen.
- Zeichnen Sie eine Linie von bekannten Abstand auf den Mikrometer-Bild mithilfe der Teilstriche mit einer Länge, die Verbindung mit jedem Tick Mark. Eine gerade Linie zu zeichnen: Klicken Sie mit Maus, halten, ziehen Sie den Cursor an die gewünschte Stelle, dann loslassen der Maus.
- Wählen Sie analysieren dann Maßstab gesetzt.
- Legen Sie Bekannt Abstand auf die bekannten Länge der Linie im vorherigen Schritt.
- Stellen Sie Einheit der Länge nach mm.
- Kontrollkästchen Sie das globale.
- Wählen Sie "OK" um das Menü verlassen.
- Schließen Sie das Stadium-Mikrometer-Bild.
- Bildgalerie ein Rubbellos Assay in ImageJ per Drag & Drop-Image-Datei in das Fenster.
- Zeichnen einer geraden Linie über die gesamte Breite des Kratzers (von der linken Vorderkante an rechten Vorderkante).
- Drücken Sie den Buchstaben M auf Tastatur, um die Messung der geraden Linie zu zeichnen. Ein kleines Fenster erscheint sofort nach der Eingabe der Buchstaben M. Dies ist, wo die Breitenmessung sein wird.
- Wiederholen Sie Schritt 7,4 insgesamt 10 mal 10 Messungen entlang der Länge des Kratzers.
Hinweis: Es ist wichtig, die meisten gegenständliche Breitenwerte über die gesamte Länge des Kratzers zu generieren. Achten Sie darauf, die 10 Breite Messungen gleichmäßig entlang der Länge des Kratzers von oben nach unten Platz. - Erstellen Sie eine Tabellenkalkulationsdatei Scratch-Test zum Kopieren und Einfügen der Messungen.
- Kopieren Sie und fügen Sie die 10 Breite Messungen im Ergebnisfenster in der entsprechenden Spalte in einer Tabellenkalkulationsdatei (Tabelle 2).
Hinweis: Wenn die Messungen aus dem Ergebnisfenster kopiert und in das Tabellenblatt eingefügt, werden überflüssige Spalten mit Werten; Diese Werte sollten gelöscht werden, erhalten nur die 10 Breite Messungen.
- Kopieren Sie und fügen Sie die 10 Breite Messungen im Ergebnisfenster in der entsprechenden Spalte in einer Tabellenkalkulationsdatei (Tabelle 2).
| 10 zufällige breite Messungen | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Mittelwert aus 10 Messungen |
Tabelle 2: Rohe breite Messungen Tabelle Format. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die rohen Messungen.
- Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für den Rest der Scratch-Test-Bilder.
- Berechnen Sie den Mittelwert von 10 Messungen zu jedem Zeitpunkt (0-24 h) für jeden gut.
- Bestimmen Sie Berechnungen mit Werten aus Schritt 7,8 Prozent-Verschluss.
- Erstellen Sie eine Tabelle am Ende der Tabelle mit dem Titel "breite Messung Averages" (Tabelle 3).
- Kopieren und einfügen, die die Durchschnittlichen 10 Messungen Zeile berechnet betreten "Breitenmessung im Durchschnitt" Tabelle 7.8.
- Einer anderen Tabelle neben der Breite Messung Durchschnitte -Tabelle zu erstellen. Titel dieser Tabelle Prozent Wunde Schließung (Tabelle 4).
Hinweis: Der Wert in der Spalte 0 h für jedes gut sollte 0 sein, da die Kratzer 0 % an dem ersten 0 h Photo für alle Brunnen geschlossen ist. - Navigieren Sie zu der nächsten Spalte über (4 h).
- Berechnen Sie die prozentuale Schließung für 4, 8, 12, 16, 20 und 24 h Zeitpunkte:
wo X = prozentuale Schließung, ich = kratzen Ausgangsbreite (0 h Breite), f = final Scratch Breite (4, 8, 12, 16, 20 oder 24 h Breite).
| Gut breite durchschnitten | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1 b | |||||||
| 2 b | |||||||
| 3 b | |||||||
| 4 b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabelle 3. Im Durchschnitt Breitenmessung Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die breite Messung Durchschnittswerte errechnet die rohen breite Messungen in Tabelle 2.
| Gut | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1 b | 0 | ||||||
| 2 b | 0 | ||||||
| 3 b | 0 | ||||||
| 4 b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabelle 4. Prozent Wunde Schließung Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die prozentuale Wunde Schließung Werte berechnet die breite Messen im Durchschnitt in Tabelle 3.
- Einer anderen Tabelle neben der Prozent Wound Closure -Tabelle zu erstellen. Titel dieser Tabelle AUC (Tabelle 5).
- Berechnen Sie die 0-4 h Fläche unter der Kurve (AUC) Wert in der 0-4 h Spalte für jede Vertiefung:
wo X = 0-4 h AUC-Wert, a = % Schließung Wert für 0 h, b = % Schließung Wert für 4 h, h = die Zeit zwischen den beiden Maßnahmen (4 h in dieser Studie). - Berechnen Sie die 4-8 h-Fläche unter der Kurve (AUC) Wert in der Spalte 4-8 h für jedes gut:
Wo X = 4-8 h AUC-Wert, ein = % Schließung Wert für 4 h, b = % Schließung Wert für 8 h, h = die Zeit zwischen den beiden Maßnahmen (4 h in dieser Studie).
Hinweis: Ein AUC-Wert sollte für jedes Zeitintervall 4 h 24 h Zeitraum für jedes gut berechnet werden. - Summe aller die AUC-Werte von 0-24 Uhr (gerechnet in 7.10.1-7.10.2 Schritten) um einen summierten AUC-Wert für jedes gut erhalten. Stellen Sie sicher, dass diese Werte korrekt zur statistischen Auswertung gespeichert werden.
- Berechnen Sie die 0-4 h Fläche unter der Kurve (AUC) Wert in der 0-4 h Spalte für jede Vertiefung:
| Gut | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 Uhr | 16-20 Uhr | 20-24 Uhr | Summierte AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1 b | |||||||
| 2 b | |||||||
| 3 b | |||||||
| 4 b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabelle 5. AUC Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die AUC-Werte berechnet unter Verwendung der Prozent Wunde Schließung Werte in Tabelle 4.
8. statistische Analyse
- Bestimmen Sie die statistische Analyse-Methode, die am besten die Versuchsplanung und summierte AUC-Werte während des Tests erhalten.
Representative Results
Stichprobengröße (n) für alle Behandlungsgruppen war n = 28. Zellen wurden erfolgreich kultiviert folgende aseptische Techniken und Labor Protokolle (Abbildung 1). Einheitliche Kratzer beobachtet in allen Behandlungsgruppen mit der mittlere Kratzer Breite von 0,8 mm 0,4 mm (Abbildung 2). Kontrollgruppen hatten eine durchschnittliche summierte Fläche unter der Kurvenwert des 1,355.83; 0,01 µM als Behandlungsgruppen gab es durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,366.21; 0,1 µM als Behandlungsgruppen hatte durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,326.24, 1,0 µM als Behandlungsgruppe hatten durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,295.10; und schließlich die 10 µM Behandlungsgruppe hatte eine durchschnittliche summierte Fläche unter der Kurvenwert des 535.12, die statistisch geringer war im Vergleich zu allen anderen Gruppen (p < 0,05) (Abbildung 3). R-Programm für die statistische Analyse wurde verwendet, um führen Sie eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Anpassung an statistischen Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (p < 0,05) zu bestimmen.
Abbildung 2: repräsentative Kratzer assay Bilder über einen Zeitraum von 20 h. Bilder A-D sind zelluläre Migration der Kontrollzellen; Bilder E-H repräsentieren zelluläre Migration von Zellen mit 1,0 µM als kontaminiert; Bilder-L stehen für zelluläre Migration von Zellen mit 10 µM als kontaminiert. Aus diesen Bildern ist es klar, dass zelluläre Migration in Anwesenheit von Arsen gebremst wird. Die Steuerung-Bilder zeigen einen komplett "geheilt" Kratzer nach 20 h, während die anderen beiden Gruppen als Behandlung nicht "geheilt" wurden. Die 10 µM als Behandlung gehemmt vollständige Schließung insgesamt nach 24 h. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Arsen verlangsamt zelluläre Migration in der Scratch-Test. Die Aufnahmen wurden über einen Zeitraum von 24 h, Änderungen an zelluläre Migration in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Arsen zu beobachten. RAW-Bilder wurden mit einer automatisierten Software (z. B.in MATLAB), welche ursprünglich gemessenen Wunde Breite berechnet dann Prozent Schließung und schließlich die Fläche unter der Kurve (AUC) analysiert. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts. Die 10 µM als Behandlungsgruppe verlangsamt statistisch zelluläre Migration der menschlichen dermalen Fibroblasten Neugeborenen (hDFn), dargestellt durch einen statistisch niedrigere AUC-Wert, im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen, verwenden eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Anpassung (p < 0,05). Statistische Unterschiede sind durch den Buchstaben "A" und "B", die gewonnen wurden, durch den Einsatz von kompakten Brief Anzeigemethode in R-Programm vertreten. Behandlungen, die keinen gemeinsamen Brief Teilen sind statistisch signifikant voneinander (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Anwendung des Assays bietet eine Hochdurchsatz- und zeitnahe Bewertung der zelluläre Migration und kann direkt auf komplexen physiologischen Systeme5,6,7übersetzen. Aus diesem Grund wurde das vorgeschlagene Benchtop-Modell abgestimmt und geübt, um die Auswirkungen von verschiedenen Therapeutika und Umweltgiften auf Wundheilung6zu bewerten. Die Konzentrationen von Arsen in der aktuellen Studie verwendeten galten umweltrelevanten durch umfangreiche Literaturrecherche der bekannten Exposition und vom Rückblick auf verschiedene Daten Stützpunkte14,15, 16,17,18,19,20,21. Verwendung von in-vitro- Scratch Assays gezeigt, dass die Exposition zu einer Arsenkonzentration innerhalb der hohen, aber ökologisch relevanten Bereich, verzögert Wundverschluss (zelluläre Migration).
Diese Bench-Top-Modell war auch beschäftigt, zu isolieren und zu eine einzelnen Zelllinie (Fibroblasten) um besser zu verstehen wie Fibroblasten Migration trägt zur Heilung Ergebnisse Wunde zu studieren. Darüber hinaus ist es schwierig, die Funktionen von einer einzelnen Zelllinie in komplexe in-Vivo -Systemen mit vielen anderen Zellen und Geweben vorhanden zu studieren, die die Analyse beeinträchtigen können. Darüber hinaus bietet der Assay ein Mittel zur Erreichung semi-quantitativen Prozent Wunde Schließung Daten, die verwendet werden können spezifische zelluläre Mechanismen durch die Wundheilung Verbindungen beeinflussen können. Zum Beispiel in der Scratch-Test verwendete Zellen gesammelt und in eine gewünschte Reagenz gespeichert und in der Genexpression verwendet werden können (signal-mRNA) oder Protein-Expression assays22. Diese Informationen kann auf die Ermittler nützlich sein, wenn sie versuchen, zu verstehen was Signale oder Proteine weitgehend auf Veränderungen in der zellulären Migration in Anwesenheit von unterschiedlichen Behandlungen (z.B. Arsen)22beitragen können.
Menschliche Neugeborene dermale Fibroblasten wurden für diese Arbeit, basierend auf ihre herausragende Rolle bei der Wundheilung ausgewählt. Allerdings hat dieses Rubbellos Assay-Protokoll umgesetzt worden, mit verschiedenen Zelltypen und für verschiedenste Zwecke. Zum Beispiel wurde der Scratch-Test in dem Gebiet der Onkologie für Migration Inhibition der Chemotherapie Drogen23Studium angenommen; für skelettartigen Muskel Zellwanderung, Vermehrung und Verbreitung24; die Wirkung von Pflanzenextrakten auf zelluläre Migration25zu studieren; und um zu verstehen, wie Keratinozyten Migration und Proliferation zur Heilung9gewickelt. Darüber hinaus bewertet eine frühere Arbeit von Pinto Et Al. die Auswirkungen von Uran (U) und Platelet-Rich Plasma (PRP) auf hDFn Migration mithilfe der Scratch-Test6. Das Ziel dieser Arbeit war das Ausmaß zu verstehen, zu dem dieser Assay die Auswirkungen der Vermittler gedacht, um zelluläre Migration (U) langsam sowie Vermittler gedacht, um zelluläre Migration (PRP) beschleunigen testen konnte. Wie kann man in der oben genannten Arbeiten und Forschung durch andere Forscher, Anwendung der Scratch-Test hat hohes Potenzial für den Einsatz in verschiedenen experimentellen Modellen26. Trotz der Detailliertheit innerhalb der Methoden sollte Varianz zwischen Ermittlern und Experimente erwartet werden. Beispielsweise werden zelluläre Migration Preise wahrscheinlich basierend auf der Zell-Linie im Einsatz, neben der erforderlichen Mikronährstoffe benötigt für einzigartige Zelltypen schwanken. Viele wichtigeren Bemerkungen für Zellausbeute und Rentabilität sind als Notizen in diesem Protokoll aufgeführt. Es ist jedoch dringend empfohlen, dass Ermittler des Herstellers für optimale Wachstumsbedingungen und zur Verwendung dieser Methode als ergänzende Anweisungen für allgemeine Zelle Kultur Arbeit folgen.
Obwohl der Scratch-Test vielseitig einsetzbar für Studie der Zellaktivität ist; unvorhergesehene Verzerrungen entstehen in der Messtechnik. Zum Beispiel wenn ImageJ manuell Zelle Migration Fronten verfolgen, existieren Variation unter den Nutzern, die Genauigkeit und repräsentative Datenerhebung einschränken können. Anzumerken ist, dass Migration Fronten blind auf die Behandlung Benutzer Verzerrungen zu minimieren gelesen werden soll. Darüber hinaus kann manuell identifizieren Migration Fronten führen Fehleinschätzung der durchschnittliche zurückgelegte Strecke durch Pseudopod Bildung von Zellen und ihre Fähigkeit zu erreichen, um Form fokalen Adhäsionen, die optisch irreführend sein kann. In ähnlicher Weise die Verwendung von fluoreszierenden "Zelle Tracker" färbt auf Zelloberfläche oder nuklearen Proteine, Migration zu erkennen können unbeabsichtigt Zellen, was zu Ungenauigkeiten bei der Messung von zellulären Migration im Laufe der Zeit beheben. Es wird empfohlen, entsprechende positive und/oder negative Kontrollen im Rahmen des Experiments völlig Esel eingeschrieben werden die Wirkung der Behandlung auf die Zell-Linien. Praxis des Assays ist als Anerkennung für seine Grenzen auszufüllen. Dieser Assay garantiert nicht, dass zelluläre Migrationsergebnisse aus in-vitro- Experimente direkt zu in Vivo Ergebnisse. übersetzen Wunde heilend und zelluläre Migration in ein komplexes lebendes System umfasst eine Vielzahl von Zelltypen und molekulare Signale; jede davon hat das Potenzial, heilende Reaktionen beeinflussen.
Zusammenfassend lässt sich sagen fand der Scratch-Test, High Throughput Screening der zelluläre Migration in Reaktion auf sich ändernde Umgebungen6,25bieten. Wir nutzten speziell dieses Protokoll um Veränderungen erfolgreich in zelluläre Migration durch Arsen Exposition bei verschiedenen umweltrelevanten Dosen zu erkennen. Diese Angaben haben Rechtfertigung den Scratchen-Test verwenden, um weitere Studie und bewerten die mechanistische Wege der zellulären Arbeitsmigration in diesem Assay und wie diese Wege durch Arsen Exposition verändert werden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das National Institute on Minderheit Gesundheit und gesundheitliche Ungleichheiten der National Institutes of Health unter Preis Anzahl U54MD012388 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
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