Summary
Это исследование фокусируется на модель в vitro рану исцеления (царапинам assay) как механизм для определения как экологических загрязнителей, таких как мышьяк влияние клеточной миграции. Результаты показывают, что этот assay в пробирке обеспечивает быстрое и ранние признаки изменения клеточной миграции до экспериментов в естественных условиях .
Abstract
Понимание физиологические механизмы заживления ран был в центре внимания проводимых исследований на протяжении многих лет. Это исследование напрямую переводит в изменения в клинических стандартов, используемых для лечения ран и уменьшения заболеваемости и смертности для пациентов. Заживление ран — сложный процесс, который требует стратегического взаимодействия клеток и тканей и функции. Одна из многих критически важных функций заживления ран — индивидуального и коллективного клеточной миграции. После травмы Различные клетки из крови, окружающих связующих и эпителиальных тканей быстро мигрируют к месту раны путем химического и/или физические раздражители. Этот ответ миграции во многом может диктовать результаты и успех заживления раны. Понимание этой конкретной сотовой функция имеет важное значение для трансляционной медицины, которая может привести к улучшение заживления результатов. Здесь мы описываем протокол, используемый для лучше понять клеточной миграции, как он относится к заживление ран, и как изменения клеточной среды может значительно изменить этот процесс. В этом примере исследовании фибробласты дермы были выращены в СМИ, дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) как монослоя культур в колбах культуры ткани. Асептически клетки были переведены в тканевой культуры лечение 12-ну пластины и выросла до 100% слияния. Дойдя до слияния, клетки в монослое были вертикально почесал с помощью кончика пипетки p200. Мышьяк, разбавленных в культуре средств массовой информации с FBS был добавлен в отдельных скважин на экологически соответствующие дозы диапазоне 0.1-10 м. изображения были захвачены каждые 4 часа (h) в течение 24 ч с помощью Перевернутый световой микроскоп, соблюдать клеточной миграции (ранение закрытие). Изображения индивидуально анализировались с помощью программного обеспечения для анализа изображений, и процент ушивание была рассчитана. Результаты показывают, что мышьяк замедляет заживление ран. Этот метод обеспечивает быстрый и недорогой первый экран для оценки воздействия загрязнителей на заживление ран.
Introduction
Заживление ран состоит из сложных серии перекрывающихся шаги, которые включают различные типы клеток, сигнальных молекул и внеклеточного матрикса компонентов1. Вместе эти компоненты работают вместе для достижения резолюции рану или ремонта, который в конечном итоге приводит к образованию защитного фиброзный рубец зависит от степени травмы1. Чтобы захватить отдельных процессов и функций раны исцеление в одном эксперименте трудно; отдельные шаги в рамках процесса заживления раны должны быть определены и испытаны отдельно. Среди многих шагов, заживления ран процесс клеточной миграции считается критическим при оценке лечебные курсы2. Клеточной миграции можно наблюдать на всех стадиях заживления ран и таким образом требует дальнейшего понимания влияния изменения ячейки миграции закрытия раны. К примеру клеточной миграции рассматривается в обоих ранней и поздней фазы воспаления, с крови коагуляции и тромбоцитов агрегирование на рану сайт3. Эти события для предотвращения чрезмерной кровопотери формирования временного блокирования для заполнения раненых областей лишенный ткани3. Тромбоцитов в обращении будет синтезировать и выделяют вазоактивных посредников наряду с эозинофилов факторы, которые вместе сигнал для воспалительных лейкоцитарной миграции (белых клеток крови) для раненых ткани для ремонта4. Эпителизация происходит в течение часов после повреждения тканей и включает в себя покрытие на рану сайт через деятельность и миграцию эпителия кератиноцитов для предотвращения дальнейшего загрязнения или вторжения посторонних частиц на рану сайта2. Эти примеры захватить только несколько из многих миграции клеток, функций, связанных с заживление ран.
Царапинам assay описано и используется для лучше понять ячейки миграции и ее многих ролей в ранозаживляющее5,6. Этот assay считается упрощенным, обеспечивает высокой пропускной способности и позволяет следователю для сбора данных о миграции представитель ячейки. Анализов миграции успешно продемонстрировали, что некоторые соединения могут ускорить или замедлить скорость клеточной миграции6. Кроме того эти результаты анализа обеспечивают поступательное физиологические информацию, которая может использоваться для сформулировать цель лечения, дозирование концентрации и гены интереса до экспериментов в естественных условиях . Assay требует основные клеточные культуры технологии и материалы, клетки линии выбора и технологии визуализации для захвата движения по времени или движения в ответ на лечение.
Assay можно легко манипулировать или соответствующий потребностям следователя. Однако есть четыре основные вопросы для рассмотрения до экспериментов. Какие общие или конкретные вопрос(ы) является/являются investigator(s), пытаясь ответить? Это справедливо для большинства гипотезы инициативе исследования; Однако важно для этот assay, потому что он будет определять многие из параметров необходимо точно и полностью ответить на вопрос (ы). Какие ячейки строки или ячейки линии (если несколько) должны использоваться для представления изучаются физиологические системы? Например, в кожной раны исцеления исследование фибробластов дермы5,6,7, стволовых клеток8, или представлять клеточных популяций, которые обычно могут рассматриваться эпидермальных кератиноцитов9 в изобилии в ткани кожи10. Кроме того нейтрофилы, макрофаги или другие воспалительные клетки могут оцениваться в этой системе для представления ячеек миграции других компонентов заживления ран в ткани кожи10. Кроме того определение конкретных клеток линии оцениваются поможет определить, какие реагенты оптимально использовать для продвижения метаболической активности клеток. Как будет отслеживаться/образы миграции клеток? Существует ряд методов, используемых для наблюдения за миграции клеток в тарелку или настой. Например окраска или дневно пометки ячеек и использование флуоресценции или конфокальный изображений для отслеживания клеток обеспечивает сильный контраст, который позволяет следователю четко определить сотовой против неклеточное мест и клеточного движения11 . Другой распространенный метод, описанный в этом исследовании, является использование Перевернутый световой микроскопии с фазы контраст6,7. Это альтернатива клеток красителей и флуоресценции позволяет пользователю жить трек клетки без необходимости неизлечимо исправить клетки до изображений, а также позволяет для захвата изображений одного и того же отдельных скважин, содержащие раненых монослои клеток через время точки. Какие результаты меры будут использоваться для анализа? С помощью изображений, собрались на протяжении всего исследования, данные могут быть получены в котором может пониматься изменения уровня клеточной миграции. В нашей лаборатории микроскопические изображения, снятые на Перевернутый световой микроскоп, загруженные для анализа изображений программное обеспечение и вычисляется процент рану закрытия и суммируются площадь под кривой (AUC)).
Мы будем выделить конкретные использования этот assay для выяснения изменений для миграции фибробластов дермы в присутствии известных экологических загрязнений, мышьяка. Мышьяк является естественным металлоида найдены в земной коре. Различные места были обнаружены с повышенными уровнями мышьяка, который создает угрозу для лиц, проживающих вблизи этих мест. В результате продовольствия и воды источников было показано увеличили уровни загрязнения мышьяком, который увеличивает вероятность для людей, чтобы стать подвергается мышьяка. Воздействия окружающей среды мышьяком было показано, имеют долгосрочные последствия для здоровья в человеческих популяциях выше или даже ниже текущего агентства по охране окружающей среды Соединенных Штатов (АООС) Макс загрязнителем уровень (мкл) 10 ppb (10 мкг/Л)12, 13. Хотя АООС США этот MCL и считается безопасной для питья пределов, мышьяк концентрации, которые превышают этот лимит не являются редкостью в воде источников во всем мире. В юго-западной части Соединенных Штатов, многочисленные грунтовые воды, воду и источники были задокументированы содержат относительно уровня мышьяка14. Например в долине Верде, AZ, Монтесума также содержит 210 мкг/Л мышьяка15. Грунтовых вод вокруг реки Верде, AZ содержит 16 мкг/Л мышьяка в среднем, с максимальными значениями, достигнув 1,3 мг/Л,1516. В частности концентрации мышьяка в многие скважины в реку Верде водой сарая превышать 50 мкг/Л15,16. С этим знанием, экологически значимых концентраций мышьяка были отобраны, начиная снизу MCL на 0,1 мкм (7,5 млрд.), учиться выше ПДК в 10 мкм (750 млрд.) в текущем14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Информация, полученная из этих экспериментов будет использоваться как ранним признаком потенциальных изменений показателей клеточной миграции в в естественных условиях раны загрязненных мышьяком. Потом сигнальные молекулы могут быть выбраны на основе их роли в деле содействия заживления ран и клеточной миграции, и будущих количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе гена выражение эксперименты могут быть созданы после завершения текущего исследования. Если уровень миграции в этот assay изменить в присутствии мышьяка, цели конкретных генов, участвующих в клеточной миграции может быть мишенью для вредного воздействия мышьяка и таким образом может быть механизмом нарушения.
Protocol
1. Подготовка кабинета II биобезопасности (BSC)
Примечание: Методы, описанные в настоящем протоколе должна проводиться с индивидуальной защиты, при использовании надлежащей лабораторной практики для достижения асептической техники.
- Снять защитное стекло BSC для эксплуатации высоту и включите ламинарным потоком болельщиков.
- Используйте изопропиловый спирт 70% водный раствор для очистки канализации рабочей области. Протрите BSC от задней стенки и боковые стены и работать вниз основание.
- Уничтожить все материалы, которые будут использоваться в assay с 70% спирта (изопропиловый спирт или EtOH) и поместите их в BSC.
2. дермальный фибробластов посева в колбе T75
- Получите флаконов с желаемой криоконсервированных клеток линии (неонатальной дермального фибробластов [hDFn], концентрация клеток 500000 клеток/флакон и проход p3-p5).
- Поместите ампулу с ячейками в 1.0-cm глубокий водяной бане при 37 ° C, чтобы позволить оттаивания. Оттепель флакона до примерно 70% клеток раствор жидкости. Протрите флакон с 70% спирта и место флакон флакон стойку внутри BSC.
Примечание: Убедитесь, что вода не вступают в контакт с потоки или колпачок флакона для предотвращения возможного загрязнения во время заполнения ячейки. Предотвратить полное размораживание клеток в воде ванны как неспособность сделать это может привести к непреднамеренному клеточной смерти.
- Поместите ампулу с ячейками в 1.0-cm глубокий водяной бане при 37 ° C, чтобы позволить оттаивания. Оттепель флакона до примерно 70% клеток раствор жидкости. Протрите флакон с 70% спирта и место флакон флакон стойку внутри BSC.
- Вытянуть 10 мл средства массовой информации дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС). Использование автоматических дозаторов и кончиком пипетки 10 мл для аспирационная в колбу T75 культуры ткани. Разрешить СМИ полностью насытить базы колбы, осторожно тряся колбу взад и вперед.
- Открытый флакон с сотовый фондовой и аспирата решение от флакона, вспоминая дозирования скорости, как будет уязвимой от криоконсервирования клеточных мембран.
- Клетки перехода к T75 ткани колбу со средствами массовой информации. Извлечь талой клеток в колбу ткани, снова Вспоминая дозирования скорости.
Примечание: Заполнение плотность клеток в тканях колбу приближена к быть 6600 клеток/см2. Плотность посева могут быть изменены для размещения пользователей и желаемого времени экспериментов. - Отмерьте 1 мл СМИ от T75 ткани колбу и объем трафика обратно в пробирку. Объем трафика из флакона обратно в колбу T75.
Примечание: Выполняя этот шаг помогает максимизировать урожайность клеток из флакона. - Завинтите крышку колбу культуры ткани и осторожно покачайте разойтись клеток в суспензии равномерно по всей поверхности. Проверка для равномерного распределения клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Метки колбы с типом ячейки, Дата, инициалы, происхождение и цель (например, hDFn, 07/11/2018, пробирного поцарапать НДЦ, 4 прохода, мышьяк). Место культуры ткани колбу в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5,0% CO2 за 72 ч.
Примечание: Среднего роста должны быть изменены 12-24 ч после первоначального заполнения для удаления следов диметилсульфоксида (ДМСО) cryopreservative, а затем изменили каждые 48 ч после этого, чтобы убедиться, что клетки правильно питаться. Период инкубации и рост будет зависеть расчетное количество клеток, необходимых для пополнения assay. Удвоение время hDFn клетки обычно является 16-24 ч при нормальных условиях. Однако, удвоение ставки могут меняться из-за высоты, рН, температуры, влажности, типа носителя и т.д.и должны быть учтены при планировании экспериментов.
3. сотовый подсчета и субкультуры 12-ну ткани культура пластины
- Извлечь T75 культуры ткани настой из инкубатора. Соблюдать придерживался клетки с помощью инвертированного микроскопа в цель увеличение 10 X (100 X общее увеличение) и определить приблизительное ячейки слияния.
- Сканировать большинство колбу культуры ткани, когда наблюдения слияния для обеспечения наиболее представительных процент приближена. Оцените отдельные ячейки морфологии для каких-либо отклонений или бактериального и грибкового заражения.
- Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 10 мл. Используйте дозаторов для аспирационная полный объем СМИ от T75 и передачи решения в контейнер для отходов. Предотвратить связаться присоединения поверхности клетки наконечник пипетки. Утилизируйте наконечник пипетки в биологической Бен.
- Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 5 мл. Аспирационная 5 мл сбалансированного солевого раствора, обойтись в колбу и встряхните флакон для полоскания избыток средств массовой информации, мертвые клетки и отходы.
- Нарисовать тома из T75 и обойтись в контейнер для отходов. Утилизируйте наконечник пипетки в биологической Бен.
- Монтаж автоматических дозаторов с адаптером Пипетка 5 мл. Аспирационная 2 мл трипсина из запасов, обойтись в колбу и встряхните флакон для разгона фермента над придерживался клетки. Обеспечить полное насыщение адэрентных поверхности. Место ткани колбу в инкубаторе для 2-3 минуты (мин).
Примечание: Максимальная фермента субстрата реакции не должен превышать 10 мин. - Наблюдать за колбу ткани под инвертированным микроскопом на 10 крат объектива (100 X общее увеличение). Примените нежной вибрации для облегчения мобильный отряд.
- Протрите T75 колбу с 70% спирта и место внутри BSC.
- Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 5 мл. Аспирационная 5 мл СМИ из запасов и добавить в настой ткани T75 остановить фермента субстрата реакции. СМИ: трипсина соотношение должно быть 3:1. Накапайте вверх и вниз база фляга 2 - 3 раза для полоскания и убедитесь, что реакция остановилась. Аспирационная полный объем жидкости из фляги и передачи в стерильных 15 мл конические.
- Заполните второй 15 мл Конические трубки с идентичными объем средств массовой информации.
- Место оба 15 мл конические трубы в противоположную позицию друг к другу. Применить 200 g центробежной силы 5 минут при температуре 25° C, задав параметры работы оборудования.
- Протрите 15 мл Конические трубки с гранулированных клетки с 70% спирта и место внутри BSC.
- Использование автоматических дозаторов с 5 мл привязанность к накапайте от СМИ, оставив примерно 250 мкл жидкости и клетки Пелле. Обратите внимание на расположение кончика пипетки, как гранулы ячейки должны оставаться нетронутыми. Распределить объем собранных в контейнер для отходов и отменить отзыв в биологической Бен.
- Для запуска в нижней части Конические трубки во флаконе слотов, создавая быстрые вибрации, беспокоить и вновь приостановить ячейки Пелле (иногда называемый «стеллаж сгребать») используйте стойку пробки microcentrifuge.
Примечание: Избегайте вихревой смеситель для выполнения этого шага. Силы тяжести созданные вихревой Смесители превышают пороговые значения ячейки g-force и может вызвать лизировать. Когда завершена правильно, новое решение ячейки будет отображаться как облачно смесь не оставшихся тампоном. Зачастую осмотрительности, выполняя этот шаг создаст одну ячейку подвеска, приводит к повышенной точности при подсчете клетки. - Добавьте 2 мл средства массовой информации в ячейки акции или ресуспендирования. Накапайте клетки мягко вниз стороне трубки 20 раз разрушить любые сгустки. Запишите объем общей ячейки подвеска и отложите в сторону кратко.
- Накапайте 20 мкл Трипановый синий запасов (0.4%) в пустой колодец 96-луночных пластину, используя стерильные пипетки.
- Mix решение акций ячейки для создания единой клетки подвеска перед передачей. Используйте стерильные пипетки подсказка для удаления 20 мкл ячейку запасов (избегая касаясь стены трубы). Добавьте 20 мкл раствора Трипановый синий в 96-луночных пластины.
- Накапайте осторожно, чтобы смешать содержимое. Накапайте 10 мкл смеси между coverslip и подсчета камеры на Горяева.
- Наблюдать за клетки и сетку под объектив 10 X. Наблюдать за девять больших площадей в поле зрения. Подсчитать ячейки только в центре и 4 угол клетки (всего 5 квадратов).
Примечание: Посмотрите на равномерное распределение клеток через всю сетку, чтобы обеспечить точный подсчет. - Подсчитайте все клетки (прозрачный и синий) в 5 выявленных квадратов сетки. Отдельно Талли только нежизнеспособных (синий) клетки в том же 5 квадратов.
- Вычислите с помощью количество жизнеспособных клеток:
где x = количество жизнеспособных клеток, = общая клетки, b = нежизнеспособных клеток - Вычислите плотность жизнеспособных клеток с помощью:
где x = плотность жизнеспособных клеток и y = общая сумма жизнеспособных клеток. - Вычислите общее жизнеспособных клеток:
где x = общая жизнеспособных клеток, y = плотность жизнеспособных клеток, f = объем ячейки подвеска (мл). - Вычислите % жизнеспособность клеток:
где x = жизнеспособности процент клеток, y = жизнеспособных клеток, рассчитывали на сетке, f = общая клетки, рассчитывали на сетке.
- Марк горизонтальную линию в нижней части пластины 12-Ну в качестве опознавательных знаков во время визуализации.
- Используйте плотность жизнеспособных клеток (рассчитывается в 3.3.7) для вычисления объема СМИ разбавлять клеток складе для посева культуры ткани 12-ну пластины.
Примечание: Оптимальное ячейки посева плотности для hDFn клеток является 5000 клеток/см2. - Разбавить ячейку запасов до 19000 клеток/мл с помощью средств массовой информации и семян каждый хорошо с 1 мл бульона клеток. Смешайте клеток фондовых периодически для обеспечения даже клетки посева во всех 12 скважин.
- Этикетке каждой пластины с типом ячейки, lineage, инициалы пользователя и цели. Поместите пластины в инкубаторе, равным 37 ° C и 5,0% CO2. Позволяют клеткам расти вплоть до слияния 100% для нуля assay.
- Используйте плотность жизнеспособных клеток (рассчитывается в 3.3.7) для вычисления объема СМИ разбавлять клеток складе для посева культуры ткани 12-ну пластины.
4. мышьяка (As) акций решений и расчетов
- Разбавить арсенита натрия (NaAsO2) непосредственно в ячейку культуры СМИ с 10% FBS в рабочих концентрациях и 10, 1.0, 0,1, 0,01 мкм как.
- Для этого сделать первоначальный 1 приклад как решение путем разбавления 3,9 мг арсенита натрия в 30 мл средств массовой информации. Серийно развести 1 приклад для остальных как решения.
| 1000 мкм как запас Расчеты | Рабочая штока концентрации мышьяка | M1V1=2V M2 | Объем раствора предыдущих мышьяка | Объем средств массовой информации | Общий объем работы фондового мышьяка |
| NaAsO2 молекулярный вес: 129.9 г/моль | 10 мкм, как | (x mL) (1000 мкм) = (30 мл)(10 µM) x = 0,3 мл | 0,3 мл = 300 мкл 1 мм как решение | 29,7 мл СМИ | 30 |
| .03 L х.001 моль/Л x 130 г/моль = 3,9 мг мышьяка | Как 1.0 мкм | (x mL) (10 мкм) = (30 мл)(1 µM) x = 3 мл | 3 мл 10 мкм, как решение | 27 мл средства массовой информации | 30 |
| Разбавить 3,9 мг арсенита натрия в 30 мл средства массовой информации | 0,1 мкм, как | (x mL) (1 мкм) = (30 мл)(0.1 µM) x = 3 мл | 3 мл 1 мкм, как | 27 мл средства массовой информации | 30 |
| 0,01 мкм как | (x mL) (0,1 мкм) = (30 мл)(0.01 µM) x = 3 мл | 3 мл 0,1 мкм, как | 27 мл средства массовой информации | 30 |
Таблицы 1. Мышьяк запасов и серийных разведений. Эта таблица объясняет расчеты, используемые для создания запасов решения As и рабочие запасов решения для лечения групп.
5. царапинам Assay технику и мышьяком
- Получите 12-ну тарелку с ячейками из инкубатора. Просмотр клетки в 10 кратном объективных (100 X общее увеличение). Определите слияния клеток в каждой скважине.
Примечание: Каждый индивидуальный хорошо, должны достичь 100% слияния до царапин. Этот критический шаг обеспечивает согласованность в рамках анализа и позволяет унифицировать assay через эксперименты. Если любой скважин не достигли 100% слияния, позволяют клеткам Инкубируйте дополнительное время до тех пор, пока все скважины достигли 100% слияния. Дополнительные роста времени в скважинах, которые уже достигли 100% слияния не будут затронуты. Вырожденная клетки обычно станет роста арестован и остаются монослойном культивировании, позволяя югу вырожденная скважин для достижения 100% слияния. - Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 10 мл. Аспирационная роста СМИ из всех скважин. Распоряжаться объема жидких отходов и кончиком пипетки в бин биологической опасности.
- Соберите Р200 дозаторов с 1-200 мкл стерильные наконечником. В каждом хорошо производят нуля «макет раны», скользя кончик по всей поверхности клетки от 12-часов 6-часов место.
Примечание: Три фактора, которые значительно повлияют на согласованности являются скорость, давление и угол кончика. Нуля должно выполняться быстро, с постоянным давлением, учитывая угол кончика, оставаясь перпендикулярным основанию пластины. Слишком медленно царапин вызовет кривых линий, избыточное давление может постоянно Оценка присоединения поверхности клетки и кончик угол меньше, чем 90° будет сузить ширину нуля. Любой из этих распространенных ошибок может привести к миграции изменены тарифы и шаблоны. - Убрать лишний мусор и клеток сгустки промыв с 1 мл раствора сбалансированного солевого раствора в колодец. Рок плита--бокового для облегчения стирки. Сбалансированного солевого раствора из скважин и утилизируют в контейнер для отходов. Выбрасывайте биологической Бен кончика пипетки 5 мл.
- Соберите Р200 дозаторов с 1-200 мкл стерильные наконечником. В каждом хорошо производят нуля «макет раны», скользя кончик по всей поверхности клетки от 12-часов 6-часов место.
Рисунок 1: Схематическое представление нуля assay. Вся работа осуществляется в рамках асептических поле, чтобы уменьшить вероятность заражения. Клетки осеменены на желаемой плотности в культуре ткани колбы и вырос в инкубаторе, набор для человеческого физиологических условиях (5% CO2, 37 ° C). После достижения желаемого слияния, клетки асептически югу культивировали в культуре ткани 12-ну пластины на желаемой плотности посева. Клетки выращивают до 100% слияния в каждой скважине пластину 12-Ну и почесал с помощью кончика стерильные пипетки. Этот «нуля» создает в vitro макет раны (обозначается двойной возглавлял стрелки), в котором клетки мигрируют естественно чтобы закрыть открытое пространство. Каждый хорошо может быть однозначно кондиционерами и уровень клеточной миграции может быть замечен и количественно в ответ на различные лечения условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Используйте p1000 дозаторов с наконечником 1000 мкл для 1000 мкл накапайте из запасов мышьяка в скважины, которые случайно были назначены с группой лечения. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины для предотвращения перекрестного загрязнения. Запишите время, когда добавляются лечения. Поместите пластины для 12-Ну в инкубаторе в 37 ° C и 5,0% CO2.
6. обработка изображений
- Захват изображения каждого из скважины на 10 объективных кратном каждые 4 ч в течение 24 ч (0, 4, 8, 12, 16, 20 и 24 ч). Ссылаться на ранее линия на нижней части пластины для изображения же расположение вдоль царапины в течение каждой скважины в последующее время точках.
Примечание: Важно, что в тех же местах фотографируются в каждый момент времени для проведения анализа точных изображений и для получения репрезентативных данных.
7. анализ
- Загружать изображения, снятые на Перевернутый световой микроскоп на компьютер и сохранить как JPEG-изображение с именем подробного файла.
- Откройте ImageJ.
- Загрузите изображение стадии микрометра с известными расстояния на программное обеспечение для преобразования пикселей в миллиметрах (мм), когда замеры изображения, перетаскивая файл в окно программы.
Примечание: Микрометра должны иметь линии демаркации известный 1 мм длиной и изображения должны быть приняты на же масштаб, используемый для захвата изображения клеток. Например в этом исследовании, что изображения были взяты на 100 X общее увеличение, таким образом, изображение микрометра стадии было принято на 100 X общее увеличение.- Нажмите кнопку Параметры прямой, сегментированныхили Произвольные линии .
- Нарисуйте линию известных расстояния на изображении микрометра с помощью деления с длиной, связанный с каждым тиком знаки. Чтобы нарисовать прямую линию: нажмите кнопку мыши, удерживая, перетащите курсор в нужное место, затем отпустить мыши.
- Выберите анализировать , а затем выберите Задать масштаб.
- Задайте Известный расстояние до известной длины линии, нарисованной в предыдущем шаге.
- Задайте единицу длины мм.
- Установите флажок с учетом глобальной.
- Выберите OK для выхода из меню.
- Закройте из сценический образ микрометра.
- Загрузка одного изображения нуля пробирного в ImageJ, перетаскивая и снижается файл изображения в окне.
- Рисование прямой линии по всей ширине нуля (от левого края ведущих к правому краю ведущий).
- Нажмите букву M на клавиатуре для записи измерения прямой линией. Небольшое окно результаты появятся сразу же после ввода буквы М. Это где будет измерение ширины.
- Повторите шаг 7.4 в общей сложности 10 раз для получения 10 измерений по длине нуля.
Примечание: Это имеет важное значение для создания наиболее репрезентативного значения ширины вниз по всей длине нуля. Убедитесь, что пространство из измерения 10 ширину равной по длине нуля сверху донизу. - Создайте файл электронной таблицы скретч пробирного для копирования и вставки измерения.
- Скопируйте и вставьте 10 ширины измерений из окна результаты в соответствующий столбец в файле электронной таблицы (Таблица 2).
Примечание: Когда измерения копируются из окна результаты и вставлены в таблицу, будет лишние столбцы значений; Эти значения следует исключить, сохраняя только 10 ширины измерений.
- Скопируйте и вставьте 10 ширины измерений из окна результаты в соответствующий столбец в файле электронной таблицы (Таблица 2).
| 10 случайных ширина измерения | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| В среднем 10 измерений |
В таблице 2. Сырые ширина измерения таблицы формат. Эта таблица показывает организационной структуры для сырых измерений получены.
- Повторите шаг выше на оставшуюся часть изображения нуля пробирного.
- Вычислить среднее 10 измерений в каждой точке времени (0-24 ч) за каждый хорошо.
- Определите, что процент закрытия вычисления, используя значения из шага 7,8.
- Создание таблицы в нижней части таблицы под названием «ширина измерения средние» (Таблица 3).
- Копировать и вставить строку Средний 10 измерений рассчитывается в шагом 7,8 в таблицу «Измерение ширины средние».
- Создайте другой таблицы рядом с Средние измерения ширины таблицы. Название это таблица Закрытия раны процентов (Таблица 4).
Примечание: Значение в столбце 0 h для каждой скважины должна быть 0, потому что нуля 0% закрыт на первоначальный 0 h фото для всех скважин. - Перейдите к следующему столбцу над (4 ч).
- Рассчитайте процент закрытия для 4, 8, 12, 16, 20 и 24 h моменты времени:
где x = процент закрытия, я = ширина начального нуля (0 h ширина), f = ширина заключительного нуля (4, 8, 12, 16, 20 или 24 h ширина).
| А ширина средние | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3А | |||||||
| 4A | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
В таблице 3. Измерение ширины средние формат таблицы. Эта таблица показывает организационной структуры для средние измерения ширины, рассчитанных с использованием сырья ширина измерения в таблице 2.
| Колодец | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3А | 0 | ||||||
| 4A | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Таблица 4 . Процент раны закрытие формат таблицы. Эта таблица показывает организационной структуры для рассчитаны значения закрытия процент раны с помощью измерения ширины в среднем в таблице 3.
- Создайте другой таблицы рядом с таблицей, Процент закрытия раны . Это название таблицы КОСС (Таблица 5).
- Вычислить 0-4 h площадь под кривой (AUC) значение в 0-4 h столбец для каждой скважины:
где x = 0-4 h значение AUC, = % закрытия значение 0 h, b = значение закрытия % за 4 ч, h = время между двумя мер (4 ч. в этом исследовании). - Вычислите 4-8 ч площадь под кривой (AUC) значение в столбце 4-8 ч для каждой скважины:
Где x = значение AUC 4-8 ч, = % закрытия значение для 4 h, b = значение закрытия % за 8 ч, h = время между двумя мер (4 ч. в этом исследовании).
Примечание: Одно значение AUC должен рассчитываться для каждого интервала времени 4 ч в течение 24 ч для каждой скважины. - Сумма всех значений АУК от 0-24 ч (рассчитывается в шаги 7.10.1-7.10.2) для получения значения суммируются AUC для каждой скважины. Убедитесь, что правильно, эти значения сохраняются для статистического анализа.
- Вычислить 0-4 h площадь под кривой (AUC) значение в 0-4 h столбец для каждой скважины:
| Колодец | 0-4 h | 4-8 ч | 8-12 ч | 12-16 ч | 16-20 h | 20-24 ч | Суммируются AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3А | |||||||
| 4A | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
В таблице 5. Формат таблицы КОСС. Эта таблица показывает организационной структуры для AUC значения, вычисленные с использованием процент раны закрытия значения в таблице 4.
8. Статистический анализ
- Определите метод статистического анализа, который лучше всего подходит как экспериментальный дизайн, так и суммируются значения АУК, полученные в ходе анализа.
Representative Results
Размеры выборки (n) для всех групп лечения был n = 28. Клетки были успешно культивировали следующие методы асептики и протоколы лаборатории (рис. 1). Единой царапины наблюдались во всех группах лечения средняя нуля шириной 0,8 мм, 0,4 мм (рис. 2). Контрольные группы имели средний суммируются площадь под кривой значение 1,355.83; 0,01 мкм как группы лечения в среднем приходилось подвел площадь под кривой значение 1,366.21; 0,1 мкм как группы лечения среднем подвел площадь под кривой значение 1,326.24, 1,0 мкм как группы лечения в среднем приходилось подвел площадь под кривой значение 1,295.10; и наконец 10 мкм как лечение группа имела средний суммируются площадь под кривой значение 535.12, которое было статистически ниже по сравнению с другими группами (p < 0,05) (рис. 3). R-программа для статистического анализа была использована для запуска односторонний дисперсионный анализ с Тьюки пост специальной регулировки для определения статистических различий между группами лечения (p < 0,05).
Рисунок 2: представитель нуля пробирного изображения в течение 20 ч. Изображение A-D представляют клеточной миграции клеток контроля; изображения E-H представляют клеточной миграции клеток, загрязненные 1.0 мкм изображения-L представляют клеточной миграции клеток, загрязненные 10 мкм как. Из этих образов становится ясно, что клеточной миграции замедляется в присутствии мышьяка. Элемент управления изображения показывают полностью «исцеление» нуля после 20 h, в то время как две другие группы как лечение не были «исцеление». 10 мкм лечения препятствует полное закрытие altogether после 24 ч. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: мышьяк замедляет клеточной миграции в скретч assay. Изображения были захвачены в течение 24 h наблюдать изменения в уровень клеточной миграции при наличии различной концентрации мышьяка. RAW изображений были проанализированы с использованием автоматизированного программного обеспечения (например, в программе MATLAB), ширина которой первоначально измеренной рану, затем рассчитывается процент закрытия и, наконец, площадь под кривой (AUC)). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. 10 мкм, как лечение группы статистически замедлился клеточной миграции дермального фибробластов новорожденных (hDFn), показано статистически меньшее значение AUC, по сравнению с всеми другими группами лечения с помощью односторонний дисперсионный анализ с регулировкой, должность Специального Тьюки (p < 0,05). Буквы «A» и «B», которые были получены с помощью метода Compact письмо отображения доступных в R-программы представлены статистические различия. Процедуры, которые не разделяют общее письмо статистически друг от друга (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Применение этот assay обеспечивает высокой пропускной способностью и своевременной оценки клеточной миграции и может непосредственно перевод сложных физиологических систем5,6,7. По этой причине предлагаемых скамейка топ-модель настроены и практикуется для оценки воздействия различных терапевтических агентов и токсинов окружающей среды на6ранозаживляющее. Концентрации мышьяка, используемых в текущем исследовании были сочтены экологически значимых через обширную литературу Поиск известных концентрациях и от ретроспективный обзор различных данных баз14,15, 16,,1718,19,,2021. Использование этого в vitro скретч пробирного показал что воздействие концентрации мышьяка в высокий, но экологически значимых диапазон, задержка закрытия РАН (клеточной миграции).
Это скамейке топ-модель также использовалась изолировать и изучения отдельных клеток линии (фибробласты) для более глубокого понимания как миграции фибробластов способствует раны лечебные результаты. Кроме того трудно изучить функции отдельной ячейки линии в комплекс в vivo системах со многими другими клеток и тканей в настоящее время, что может помешать с анализом. Кроме того assay предоставляет средства достижения полуколичественного процент рану закрытия данных, которые могут использоваться для целевых конкретных клеточных механизмов, через которые соединений может повлиять на заживление ран. Например, клетки, используемые в скретч assay может собраны и хранятся в желаемой реагента и используется в выражении гена (сигнал мРНК) или выражения протеина assays22. Эта информация может быть полезной для следователя, если они стремятся понять, какие сигналы или белков может во многом способствовать изменения в клеточной миграции при наличии различной обработки (то есть, мышьяк)22.
Фибробластов дермы новорожденных были выбраны для этой работы, основанной на их важную роль в заживлении ран. Однако, этот протокол assay скретч была выполнена с использованием различных типов клеток и для целого ряда научно-исследовательских целей. К примеру скретч assay была принята в области онкологии для изучения миграции ингибирование химиотерапии наркотиков23; для миграции клеток скелетных мышц, распространения и распространение24; изучить влияние экстрактов растений на клеточной миграции25; и чтобы понять как кератиноцитов миграции и пролиферации способствуют раны исцеления9. Кроме того предыдущий документ Пинто et al. оценивали воздействие уран (U) и тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на hDFn миграции с помощью скретч пробирного6. Целью этой работы было понять степень, в которой этот assay может проверить действие агент считается медленным клеточной миграции (U), а также агента предполагается ускорить клеточной миграции (PRP). Как видно в вышеупомянутой работе и исследования других следователей, применение скретч assay имеет высокий потенциал для использования в различных экспериментальных моделей26. Несмотря на деталь, предоставленные в рамках методов следует ожидать разница между следователями и экспериментов. Например уровень клеточной миграции скорее всего будет колебаться по линии клетки используются, помимо необходимых микроэлементов, необходимых для типов уникальных клеток. Многие из важных наблюдений для помощи в ячейке урожайность и жизнеспособности перечислены как Примечания на протяжении настоящего Протокола. Однако настоятельно рекомендуется, что следователи следовать рекомендациям производителя оптимальные условия роста и использовать этот метод как дополнительные инструкции для общей клетки культуры работы.
Хотя царапин assay чрезвычайно разностороннего изучения клеточной активности; в измерительной техники могут возникнуть непредвиденные предубеждения. Например при использовании ImageJ вручную отслеживать фронтах миграции клеток, различия могут существовать среди пользователей, которые могут ограничить точность и репрезентативных данных коллекции. Следует также отметить, что миграция фронтах следует читать слепые обращения к минимуму предвзятость пользователя. Кроме того вручную определения миграции фронтах может привести к просчет среднее расстояние, пройденное за счет формирования pseudopod клеток и их способность выйти на форме фокуса спайки, которые могут быть визуально заблуждение. Подобным образом использование флуоресцентных «трекера ячейки» краски на поверхности клетки или ядерных белков для обнаружения миграции может непреднамеренно исправить клетки, что приводит к неточности при измерении клеточной миграции с течением времени. Рекомендуется, чтобы соответствующие позитивные или негативные элементы быть зачислены в рамках эксперимента, чтобы полностью оценить эффект лечения на линии клеток. Практика этот assay должны быть завершены в знак признания его ограничения. Этот assay не гарантирует, что клеточной миграции результаты, полученные от экспериментов в vitro непосредственно переведет в естественных условиях результаты. Рану исцеления и клеточной миграции в комплекс Живая система включает в себя множество типов клеток и молекулярные сигналы; Каждый из которых имеет потенциал, чтобы повлиять исцеления ответы.
В резюме была обнаружена скретч assay для предоставления высокопроизводительного скрининга клеточной миграции в ответ на изменения среды6,25. Мы специально использовали этот протокол успешно обнаружить изменения в клеточной миграции вследствие воздействия мышьяка в различных экологически значимых дозах. Эти данные предоставили обоснование использования скретч assay для дальнейшего изучения и оценки механистический путей клеточной миграции в этот assay и как эти тропы изменяются под воздействием мышьяка.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Исследования в этой публикации было поддержано национального института здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения национальных институтов здоровья под награду номер U54MD012388. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
