Denne undersøgelse fokuserer på en in vitro- model af sår healing (scratch assay) som en mekanisme til at bestemme hvordan miljøforurenende såsom arsenik indflydelse cellulære migration. Resultaterne viser, at denne in vitro assay giver hurtige og tidlige indikationer af ændringer til cellulære migration inden i vivo eksperimenter.
Forstå de fysiologiske mekanismer for sårheling har været genstand for igangværende forskning i mange år. Denne forskning direkte giver sig udslag i ændringer i kliniske standarder bruges til behandling af sår og mindske sygelighed og dødelighed for patienter. Sårheling er en kompleks proces, der kræver strategisk celle og væv interaktion og funktion. En af de mange kritisk vigtige funktioner i sårheling er individuelle og kollektive cellulære migration. Efter skade migrere forskellige celler fra blodet, omgivende bindevæv og epitel væv hurtigt til webstedet sår ved hjælp af kemiske og/eller fysiske stimuli. Denne migration reaktion kan i vid udstrækning diktere resultater og succes af en helbredende såret. Forstå dette bestemt cellefunktion er vigtigt for Translationel medicin, der kan føre til forbedret sårheling resultater. Her, beskriver vi en protokol, der bruges til bedre at forstå cellulære migration, som den vedrører sårheling, og hvordan ændringer i det cellulære miljø i væsentlig grad kan ændre denne proces. I dette eksempel undersøgelse, blev dermal fibroblaster dyrket i medierne suppleret med føtal bovint serum (FBS) som éncellelag kulturer i vævskultur flasker. Celler var aseptisk overføres til vævskultur behandlet 12-godt plader og vokset til 100% sammenløb. Ved ankomsten til sammenløbet, blev cellerne i éncellelag lodret ridset, ved hjælp af en p200 afpipetteres tip. Arsen fortyndet i kultur medier suppleret med FBS blev føjet til individuelle brønde på miljømæssigt relevante doser spænder 0,1-10 M. billeder blev taget til fange hver 4 timer (h) over en 24-timers periode ved hjælp af en omvendt lysmikroskop at observere cellulære migration (sår lukning). Billeder var individuelt analyseret ved hjælp af billede analyse software, og procent sår lukning blev beregnet. Resultaterne viser, at arsen bremser sårheling. Denne teknik giver en hurtig og billig første skærmbillede for evaluering af virkningerne af forurenende stoffer på sårheling.
Sårheling består af en kompleks serie af overlappende trin, der involverer forskellige celletyper, signaling molekyler og ekstracellulære matrix komponenter1. Sammen, arbejder disse komponenter i fællesskab for at opnå sår opløsning eller reparation, der i sidste ende fører til dannelsen af et beskyttende fibrotisk ar afhængigt af graden af traumer1. For at fange de enkelte processer og funktioner af sår er healing i et eksperiment vanskeligt; enkelte trin inden for sårheling proces skal identificeres og testet separat. Blandt de mange trin i sårheling, processen af cellulære migration har været betragtet som kritisk når de evaluerer helbredende priser2. Cellulære migration kan iagttages i alle faser af sårheling og nødvendiggør yderligere forståelse af, hvordan ændringer i celle migration kan indvirkning sår lukning. For eksempel, er cellulære migration set i både tidlige og sene fase betændelse, med blod koagulation og trombocyttal aggregering på såret site3. Disse begivenheder forhindre overdreven blodtab ved at danne en midlertidig blokering for at fylde såret områder væv3. Blodplader i omløb vil syntetiserer og udskiller vasoaktive mediatorer sammen med kemotaktisk faktorer, som tilsammen signal for inflammatoriske leukocyt migration (hvide blodlegemer) til de sårede væv til reparation4. Re epithelialization opstår inden for timer efter vævsskade og indebærer dækker webstedet sår gennem aktivitet og migration af epitel keratinocytter at forhindre yderligere forurening eller invasion af fremmede partikler til sår site2. Disse eksempler fange kun nogle få af de mange celle migration funktioner forbundet med sårheling.
Scratch analysen er beskrevet og anvendes til bedre at forstå celle migration og sine mange roller i sårheling5,6. Denne analyse anses forsimplede, giver høj overførselshastighed og muliggør investigator at indsamle repræsentative celle migration data. Migration assays har vist at visse forbindelser kan fremskynde eller bremse hastigheden af cellulære migration6. Desuden giver disse assay resultater translationel fysiologisk oplysninger, der kan bruges til at formulere mål behandlinger, dosering koncentrationer og gener af interesse inden i vivo eksperimenter. Analysen kræver grundlæggende celle kultur teknikker og forsyninger, en cellelinje af valg og imaging-teknologi til at fange bevægelse over tid eller bevægelse i svar på behandlinger.
Analysen kan være let manipuleres eller skræddersyet til behovene af investigator. Men der er fire grundlæggende spørgsmål at overveje før eksperimenter. Hvilke generelle eller specifikke spørgsmål (r) er den forsøger at besvare en eller flere delforsøgsledere? Dette gælder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid afgørende for denne analyse fordi det vil afgøre mange af parametrene, der skulle præcist og helt besvare spørgsmål (r). Hvad celle linje eller cellelinjer (hvis der findes flere) bør bruges til at repræsentere den fysiologisk system ved at blive undersøgt? For eksempel, i en kutant sår healing undersøgelse, en dermal fibroblast5,6,7, stamcelle8, eller epidermale keratinocytter9 kan anses for at repræsentere cellepopulationer, der normalt findes i overflod i huden væv10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andre inflammatoriske celler kunne evalueres i dette system til at repræsentere celle migration af andre komponenter af sårheling inden for hud væv10. Desuden, vil at identificere de specifikke cellelinie evalueres bidrage til at identificere, hvilke reagenser er optimal at bruge til at fremme celle metaboliske aktivitet. Hvordan bliver celle migration sporet/afbildet? Der er en række teknikker, der anvendes til at observere celle migration inden for en plade eller kolbe. For eksempel, giver farvning eller fluorescently tagging celler og bruger fluorescens eller Konfokal imaging til at spore celler en stærk kontrast, som giver mulighed for investigator for klart at definere cellulære vs. ikke-cellulære placeringer og cellulær bevægelse11 . En anden almindelig teknik, beskrevet i denne undersøgelse, er anvendelsen af omvendte lysmikroskopi med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle farvestoffer og fluorescens tillader brugeren at leve spor celler uden at uhelbredeligt fix celler før imaging og giver også mulighed for at fange billeder af den samme individuelle brønde indeholdende sårede encellelag af celler på tværs af tiden point. Foranstaltninger, hvad udfaldet vil blive brugt til analyse? Ved hjælp af billeder indsamlet under hele undersøgelsen, data kan fremskaffes ændringer til cellulære migration satser kan forstås. I vores laboratorium, mikroskopiske billeder taget på den inverterede lysmikroskop er uploadet til billede analyse software og procent sår lukning og summerede arealet under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil fremhæve den konkrete anvendelse af denne analyse at belyse ændringerne dermal fibroblast migration i et kendt miljø forurenende, arsen. Arsen er et naturligt forekommende halvmetal fundet i jordskorpen. Forskellige steder er blevet fundet med forhøjede niveauer af arsen, der udgør en risiko for personer, der bor i nærheden af disse steder. Som et resultat, har mad og vand kilder vist sig at have øget niveauer af arsen kontaminering, hvilket øger sandsynligheden for enkeltpersoner til at blive udsat for arsen. Miljømæssige arsen eksponering har vist sig at have langsigtede sundhedsmæssige konsekvenser befolkningsgrupper ovenfor eller endda under den nuværende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max forurenende niveau (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om u.s. EPA har sat denne MCL og anses for det sikkert for drikkevand grænser, arsenik koncentrationer, der overskrider denne grænse er ikke ualmindelige i vandkilder på verdensplan. I det sydvestlige USA, har talrige grundvand, godt vand og springs dokumenteret for at indeholde vedrørende niveauer af arsen14. For eksempel, indeholder Montezuma godt i Verde Valley, AZ, 210 µg/L arsen15. Grundvand omkring floden Verde, AZ indeholder 16 µg/L af arsen i gennemsnit med peak værdier at nå 1,3 mg/L15,16. Navnlig overstiger arsenik koncentrationer i mange brønde i Verde floden vand skur 50 µg/L15,16. Med denne viden, miljømæssigt relevante arsen koncentrationer blev udvalgt der spænder fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), at ovennævnte MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuelt undersøgelse14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
De oplysninger, der indsamles fra disse eksperimenter vil blive brugt som en tidlig indikator for potentielle ændringer af cellulære migration priser i en i vivo sår forurenet med arsen. Bagefter, signalering molekyler kan vælges baseret på deres rolle for fremme af sårheling og cellulære migration, og fremtidige kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) baseret gen expression eksperimenter kan oprettes efter afslutningen af aktuelt undersøgelser. Hvis migration satser i denne analyse ændrer i overværelse af arsen, specifikt gen mål involveret i cellulære migration kan være mål for skadelige virkninger af arsen, og kan således være mekanismen af forstyrrelser.
Anvendelsen af denne analyse giver en høj overførselshastighed og rettidig evaluering af cellulære migration og kan direkte oversættes til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Af denne grund, den foreslåede bænk-top model tunet og praktiseres for at vurdere virkningerne af forskellige terapeutiske agenter og miljømæssige toksiner på sårheling6. Koncentrationerne af arsen bruges i den aktuelle undersøgelse blev anset for miljømæssigt relevante gennem omfattende litteratursøgning af kendte eksponeringsniveauer, og fra retrospektiv gennemgang af forskellige data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Brug af denne in vitro- scratch analyse vist, at eksponering for en arsen koncentration inden for høje, men miljømæssigt relevante udvalg, forsinket sår lukning (cellulære migration).
Denne bænk top model blev også ansat til at isolere og studere en enkelt cellelinje (fibroblast) for yderligere at forstå, hvordan fibroblast migration bidrager til sår healing resultater. Derudover er det svært at studere funktionerne i en enkelt cellelinje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og væv til stede, der kan forstyrre analysen. Analysen omfatter desuden et middel til at nå semi-kvantitative procent sår lukning data, der kan bruges til at målrette specifikke cellulære mekanismer gennem hvilke forbindelser kan påvirke sårheling. For eksempel, celler, der bruges i scratch analysen kan indsamles og opbevares i en ønskede reagens og bruges i genekspression (signal mRNA) eller protein udtryk-undersøgelser,22. Disse oplysninger kan være nyttige til investigator hvis de søger at forstå hvad signaler eller proteiner kan i vid udstrækning bidrage til ændringer i cellulære migration i overværelse af varierende behandlinger (f.eks arsen)22.
Menneskelige neonatal dermal fibroblaster blev udvalgt til dette arbejde er baseret på deres fremtrædende rolle i sårheling. Dog protokollens scratch assay er blevet gennemført ved hjælp af forskellige celletyper og for en række forskningsformål. For eksempel er scratch analysen blevet vedtaget i inden for onkologi for at studere migration hæmning af kemoterapi narkotika23; for skeletmuskulatur celle migration, spredning og diffusion24; at studere effekten af planteekstrakter på cellulære migration25; og forstå hvordan keratinocytter migration og spredning bidrager til sår healing9. Derudover evalueres en tidligere papir af Pinto et al. virkningerne af uran (U) og trombocyttal-rich plasma (PRP) på hDFn migration ved hjælp af scratch assay6. Formålet med dette arbejde var at forstå omfang som dette assay kunne teste effekten af agent menes at langsom cellulære migration (U), såvel som agent menes at fremskynde cellulære migration (PRP). Som det kan ses i den ovennævnte arbejde og forskning af andre efterforskere, anvendelse af scratch analysen har stort potentiale for brug i forskellige eksperimentelle modeller26. Trods den detalje gives inden for metoderne, skal variansen forventes mellem efterforskere og eksperimenter. Cellulære migration priser vil sandsynligvis svinge baseret på cellelinie i brug, ud over de krævede mikronæringsstoffer behov for unikke celletyper. Mange af de vigtige bemærkninger til støtte i celle udbytte og levedygtighed er angivet som noter i hele denne protokol. Det anbefales imidlertid kraftigt, at efterforskere Følg producentens anbefalinger for optimale vækstbetingelser, og at bruge denne metode som supplerende undervisning for generelle celle kultur arbejde.
Selv om scratch analysen er ekstremt alsidige for undersøgelse af cellulære aktivitet; uforudsete bias kan opstå i måleteknikker. For eksempel, når du bruger ImageJ manuelt spore celle migration fronter, kan variation findes blandt brugere, som kan begrænse nøjagtigheden og indsamling af repræsentative data. Det skal også bemærkes, at migration fronter bør læses blinde til behandling at minimere bruger bias. Desuden, manuelt identificering migration fronter kan resultere i fejlberegning af gennemsnitlige afstand på grund af pseudopod dannelse, som celler og deres evne til at nå ud til form fokale sammenvoksninger, som kan være visuelt vildledende. På lignende måde, brug af fluorescerende “celle tracker” farvestoffer på cellens overflade eller nukleare proteiner til at opdage migration kan utilsigtet fastsætte cellerne medførende unøjagtigheder ved måling af cellulære migration over tid. Det anbefales, at passende positive og/eller negative kontroller være indskrevet i eksperimentet at helt æsler effekten af behandling på cellelinjer. Praksis af denne analyse skal være afsluttet i anerkendelse af dens begrænsninger. Denne analyse kan ikke garantere at cellulære migration resultater fra in vitro forsøg direkte vil oversætte til i vivo resultater. Sår healing og cellulære migration i et komplekst levende system indebærer en lang række celletyper og molekylære signaler; hver har potentiale til at påvirke healing svar.
I Resumé, har scratch analysen vist sig for at give høj overførselshastighed screening af cellulære migration i svar til skiftende miljøer6,25. Vi udnyttede specifikt denne protokol for at med held registrerer ændringer i cellulære migration som følge af arsen eksponering på forskellige miljømæssigt relevante doser. Disse data har givet begrundelse for at bruge bunden analysen til yderligere undersøgelse og vurdere den mekanistiske veje af cellulære migration i denne analyse og hvordan disse veje er ændret af arsen eksponering.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute on mindretal sundhed og sundhed forskelle af National Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
Water Bath | Precision | Model 182 | |
Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
p200 Pipette | Gilson | ||
p20 Pipette | Gilson | ||
Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Tissue Marker | Securline | 92167 | |
Wipes | Kintech | 34155 | |
70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
Bleach | Great Value | 220-04 | |
96-well | Falcon | 353915 | |
Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
12-well plate | Corning | 3598 | |
Waste Beaker | n/a | n/a | |
1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |