Denne studien fokuserer på en i vitro modell av sår helbredelse (scratch analysen) som en mekanisme for å bestemme hvordan miljøgifter som arsen innflytelse mobilnettet migrasjon. Resultatene viser at denne i vitro analysen gir rask og tidlige indikasjoner på endringer i mobilnettet overføringen før i vivo eksperimentering.
Forstå fysiologiske mekanismene av sårheling har vært fokus for pågående forskning i mange år. Denne forskningen oversettes direkte endringer i kliniske standarder som brukes til behandling av sår og redusere sykelighet og dødelighet for pasienter. Sårheling er en komplisert prosess som krever strategiske celler og vev samhandling og funksjon. En av mange kritisk viktige funksjoner av sårheling er individuelle og kollektive mobilnettet migrasjon. Ved skade overføre ulike celler fra blodet, omkringliggende connective og epitel vev raskt til såret området ved hjelp av kjemiske og/eller fysiske stimuli. Dette migrasjon svaret kan i stor grad diktere resultater og suksess av en healing sår. Forstå denne bestemte cellulære funksjoner er viktig for translasjonsforskning medisin som kan føre til forbedret sårheling resultater. Her beskriver vi brukes til å forstå mobilnettet overføring som gjelder sårheling, og hvordan endringer i mobilnettet miljø kan betydelig endre denne prosessen. I denne eksempel studien var dermal fibroblaster vokst i media med fosterets bovin serum (FBS) som monolayer kulturer i vev kultur flasker. Cellene ble tas aseptisk overført til vev kultur behandlet 12-vel plater og vokst til 100% samløpet. Ved å nå samløpet, var cellene i monolayer vertikalt riper bruker et p200 Pipetter tips. Arsen fortynnet i kultur medier med FBS ble lagt til individuelle brønner på miljømessig relevante doser alt 0.1-10 M. bilder ble tatt hver 4 timer (h) over en 24-timers periode med en invertert lys mikroskop å observere mobilnettet overføring (sår nedleggelsen). Bildene ble individuelt analysert ved hjelp av analyseprogramvare og prosent sår nedleggelsen ble beregnet. Resultatene viser at arsen bremser ned sårtilheling. Denne teknikken gir en rask og billig første skjermen for evaluering av effekter av miljøgifter på sårtilheling.
Sårheling består av en kompleks serie av overlappende trinn som involverer ulike celletyper, signalnettverk molekyler og ekstracellulær matrix komponenter1. Sammen jobber disse komponentene sammen å oppnå såret oppløsning eller reparasjon, som til slutt fører til dannelse av et beskyttende fibrotiske arr avhengig av traumer1. For å fange den individuelle prosesser og funksjoner av sår er helbredelse i ett eksperiment vanskelig; enkelttrinn i såret helbredelsesprosessen må identifiseres og testet separat. Blant de mange trinnene av sårheling, prosessen med cellular overføring har vært ansett som kritisk når du vurderer helbredende priser2. Mobilnettet migrasjon kan observeres i alle faser av sårheling, og dermed nødvendiggjør videre forståelse av hvordan endringer i celle migrasjon kan påvirke såret nedleggelse. For eksempel er mobilnettet overføring sett i begge tidlige og sene fasen betennelse, med blod koagulasjon og blodplater samling på såret området3. Disse hendelsene hindre overdreven blodtap ved å danne en midlertidig blokkering for å fylle såret områder uten vev3. Blodplater i omløp vil syntetisere og utsondre vasoactive meglere sammen med chemotactic faktorer, som sammen signalet for inflammatorisk leukocytter migrasjon (hvite blodlegemer) til de sårede vev for reparere4. Re epithelialization oppstår i timene av vev skade og innebærer dekker såret området gjennom aktivitet og migrering av epitelial keratinocytter å hindre videre smitte eller invasjon av fremmede partikler til såret området2. Disse eksemplene ta bare noen av mange celle migrasjon funksjonene tilknyttet sårtilheling.
Scratch analysen er beskrevet og brukes til å forstå celle migrasjon og dens mange roller på sårtilheling5,6. Denne analysen anses forenklede, gir høy gjennomstrømming og gjør etterforskeren samle representant celle migrasjon data. Migrasjon analyser har vist at visse stoffer kan akselerere eller redusere hastigheten av mobilnettet migrasjon6. Videre gir disse analyseresultatene translasjonsforskning fysiologiske informasjon som kan brukes til å formulere målet behandlinger, dosering konsentrasjoner, og gener rundt før i vivo eksperimentering. Analysen krever grunnleggende celle kultur teknikker og forsyninger, en celle linje av valg og bildeteknologi å fange bevegelse over tid eller bevegelse svar på behandlinger.
Analysen kan lett manipulert eller tilpasset behovene til etterforskeren. Men er det fire grunnleggende spørsmål du bør vurdere før eksperimentering. Hvilke generelle eller spesifikke spørsmålet (er) er investigator(s) prøver å besvare? Dette gjelder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid avgjørende for denne analysen fordi den vil finne mange av parameterne for å nøyaktig og fullstendig svar på spørsmålene. Hva celle linje eller cellelinjer (Hvis flere) skal brukes til å representere fysiologiske systemet blir studert? For eksempel i en cutaneous sår helbredelse studie, dermal fibroblast5,6,7, Stamcelle8eller epidermal keratinocyte9 kan anses å representere celle populasjoner som normalt finnes i overflod i huden vev10. Alternativt kan nøytrofile, makrofager eller andre inflammatoriske celler evalueres i dette systemet til å representere celle migrasjon av andre komponenter i sårheling innenfor huden vev10. I tillegg vil identifiserer bestemt celle linjen evaluering bidra til å identifisere hvilke reagenser er optimal å bruke å fremme cellen metabolsk aktivitet. Hvordan blir celle migrasjon sporet/fotografert? Det finnes en rekke teknikker brukes til å observere celle migrasjon i en tallerken eller kolbe. Inneholder for eksempel en sterk kontrast, som lar etterforskeren klart definere mobilnettet vs ikke-mobilnettet steder og mobilnettet bevegelse11 farging eller fluorescently merking celler og bruker fluorescens eller AC confocal imaging for å spore celler . En annen vanlig teknikk, beskrevet i denne studien er bruken av omvendte * lys med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle fargestoffer og fluorescens lar brukeren live spor celler uten å måtte fikse terminalt celler før bildebehandling og også kan fange bilder av samme individuelle brønner som inneholder sårede monolayers celler over tidspunkt. Hva utfallet tiltak vil bli brukt for analyse? Bruker bildene samlet gjennom hele studiet, data kan genereres som endringer i mobilnettet overføring priser kan forstås. I vår lab, mikroskopiske bilder på invertert lys mikroskopet er lastet opp til analyseprogramvare og prosent såret nedleggelse og summerte området under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil markere bestemt bruk av denne analysen å belyse endringer dermal fibroblast overføring i nærvær av en kjent miljømessige miljøgifter, arsen. Arsen er en naturlig forekommende metalloid funnet i jordskorpen. Forskjellige steder er funnet med forhøyede nivåer av arsen, som utgjør en risiko for personer som bor i nærheten av disse stedene. Som et resultat, har mat og vann kilder vist har økte nivåer av arsen forurensning, noe som øker sannsynligheten for enkeltpersoner å bli utsatt for arsen. Miljømessige arsen eksponering har vist seg å ha langsiktige helsemessige konsekvenser i menneskelige populasjoner over eller selv under den gjeldende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max miljøgifter nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om USEPA har satt denne MCL og ansett det trygt for drikkevann grenser, arsen konsentrasjoner som overstiger denne grensen er ikke uvanlig i vannkilder over hele verden. I det sørvestlige USA, er mange grunnvann, godt vann og kilder dokumentert for å inneholde om nivåer av arsen14. I Verde Valley, AZ inneholder for eksempel Montezuma godt 210 µg/L arsen15. Grunnvann rundt elven Verde, AZ inneholder 16 µg/L av arsen i gjennomsnitt med topp verdier nå 1.3 mg/L15,16. Spesielt overstige arsen konsentrasjoner i mange brønner i Verde elva vann skjulet 50 µg/L15,16. Med denne kunnskapen, miljømessig relevante arsen konsentrasjoner ble valgt som spenner fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), over MCL på 10 µM (750 ppb) i gjeldende studere14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Informasjonen som samles inn fra disse eksperimentene vil bli brukt som en tidlig indikator på mulige endringer til mobilnettet overføring priser i en i vivo sår forurenset med arsen. Etterpå signalnettverk molekyler kan velges basert på deres rolle i tilrettelegge sårheling og mobilnettet migrasjon, og fremtidige kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) basert gene expression eksperimenter kan settes opp ved gjennomføring av gjeldende studier. Hvis overføring priser i denne analysen endrer i nærvær av arsen, bestemte genet mål involvert i cellulær migrasjon være for skadelige effekter av arsen, og dermed kan være mekanisme avbrudd.
Anvendelsen av denne analysen gir en høy gjennomstrømming og rettidig evaluering av mobilnettet migrasjon og kan direkte oversette til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Derfor er foreslått benk toppen modellen innstilt og praktisert for å evaluere effekten av ulike terapeutiske agenter og miljøgifter på sårtilheling6. Konsentrasjonen av arsen i denne studien ble ansett som miljøvennlig relevante gjennom omfattende litteratursøk av kjente eksponeringsnivåer, og fra Retrospektiv gjennomgang av ulike data baser14,15, 16,,17,,18,,19,,20,,21. Bruk av denne i vitro scratch analysen viste at eksponering for en arsen konsentrasjon i høy, men miljømessig relevante området, forsinket såret nedleggelse (mobilnettet migrasjon).
Denne benken toppmodellen var også ansatt å isolere og studere en enkeltcelle linje (fibroblast) for ytterligere å forstå hvordan fibroblast overføring bidrar til sår helbredelse resultater. Det er vanskelig å studere funksjonene i en enkeltcelle linje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og vev tilstede som kan forstyrre analysen. Dessuten gir analysen et middel til å oppnå semi kvantitative prosent såret nedleggelse data som kan brukes til å målrette bestemte cellulære mekanismer som forbindelser kan påvirke sårtilheling. For eksempel cellene i scratch analysen kan samles og lagres i en ønskede reagensen og brukes i genuttrykk (signal mRNA) eller protein uttrykk søk22. Denne informasjonen kan være nyttig å etterforskeren hvis de søker å forstå hva signaler eller proteiner kan i stor grad bidra til endringer i mobilnettet migrasjon i nærvær av varierende behandlinger (dvs. arsen)22.
Menneskelig neonatal dermal fibroblaster ble valgt for dette basert på deres framtredende rolle i sårtilheling. Men denne scratch analysen protokollen er implementert ved hjelp av ulike celletyper og for en rekke forskningsformål. For eksempel er scratch analysen vedtatt i onkologi for å studere migrasjon hemming av kjemoterapi narkotika23; for skjelettlidelser muskel celle migrasjon, spredning og diffusion24; å studere effekten av planteekstrakter på mobilnettet migrasjon25; og for å forstå hvordan keratinocyte migrasjon og spredning bidra til sår helbredelse9. I tillegg evaluert en tidligere artikkel av Pinto et al. virkningene av uran (U) og blodplater-rich plasma (PRP) på hDFn overføring ved hjelp av scratch analysen6. Hensikten med verket var å forstå omfanget som denne analysen kan teste effekten av en agent trodde å bremse mobilnettet overføring (U), samt en agent å fart cellular migrasjon (PRP). Som kan sees i de nevnte arbeidet og forskning av andre etterforskere, anvendelse av scratch analysen har stort potensial for bruk i ulike eksperimentelle modeller26. Til tross for detaljer gitt metodene, bør avvik forventes mellom etterforskere og eksperimenter. For eksempel vil mobilnettet overføring priser trolig variere basert på celle linjen i bruk, i tillegg til nødvendig mikronæringsstoffer kreves for enestående celletyper. Mange av de viktige observasjonene til hjelp i cellen avkastning og levedyktighet er oppført som notater i denne protokollen. Men anbefales det sterkt at etterforskerne følger produsentens anbefalinger for optimale forhold, og bruke denne metoden som supplerende instruksjon for generelle celle kultur arbeid.
Selv om scratch analysen er ekstremt allsidig for studier av cellular aktivitet. uforutsette biases kan oppstå i måling teknikker. For eksempel når du bruker ImageJ å manuelt trace celle migrasjon fronter, kan variasjon finnes blant brukere som kan begrense nøyaktigheten og representant datainnsamling. Det bør også bemerkes at overføringen fronter bør leses blind til behandling å minimere bruker bias. Videre kan manuelt identifisere migrasjon fronter resultere i feilberegning av gjennomsnittlig distanse på grunn av pseudopod dannelsen av celler og deres evne til å nå ut til skjemaet fokal adhesjon, som kan være visuelt villedende. På samme måte, bruk av fluorescerende “celle tracker” fargestoffer på celleoverflaten eller kjernefysiske proteiner å oppdage migrasjon kan utilsiktet fastsette celler som resulterer i feil ved måling av mobilnettet overføring over tid. Det anbefales at aktuelle positiv og/eller negative kontroller være registrert i eksperimentet til helt esler effekten av behandling på cellelinjer. Praktisering av denne analysen må fullføres i erkjennelse av begrensninger. Denne analysen garanterer ikke at mobilnettet migrasjon resultatene i vitro eksperimentering direkte vil oversette til i vivo resultater. Sår helbredelse og mobilnettet migrasjon i en kompleks levende system innebærer en rekke celletyper og molekylære signaler; hver har potensial til å påvirke helbredende svar.
I sammendraget, har scratch analysen blitt funnet for å gi høy gjennomstrømming screening av mobilnettet overføring som svar på endrede miljøer6,25. Vi utnyttet spesielt denne protokollen for å oppdage endringer i mobilnettet migrering som følge av arsen eksponering ved ulike miljømessig relevante doser. Disse dataene har gitt begrunnelse for å bruke scratch analysen videre studier og vurdere mekanistisk veier for mobilnettet denne analysen og hvordan disse veiene er endret av arsen eksponering.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institute on minoritet helse og helse forskjeller i National Institutes of Health under prisen nummer U54MD012388. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
Water Bath | Precision | Model 182 | |
Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
p200 Pipette | Gilson | ||
p20 Pipette | Gilson | ||
Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Tissue Marker | Securline | 92167 | |
Wipes | Kintech | 34155 | |
70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
Bleach | Great Value | 220-04 | |
96-well | Falcon | 353915 | |
Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
12-well plate | Corning | 3598 | |
Waste Beaker | n/a | n/a | |
1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |