Summary

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Published: January 09, 2019
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Summary

Cet article illustre une méthode puissante pour quantifier les mitochondries ou lysosomes dans les cellules vivantes. La combinaison de colorants spécifiques lysosome ou mitochondries avec des anticorps fluorescent conjugués contre marqueurs de surface permet la quantification de ces organites chez les populations de cellules mixtes, comme les cellules primaires récoltées dans des échantillons de tissus, en utilisant cytométrie en flux multicolore.

Abstract

Les cellules T utilisent différents programmes métaboliques pour correspondre à leurs besoins fonctionnels au cours de la différenciation et la prolifération. Les mitochondries sont des éléments cellulaires essentiels chargés de fournir l’énergie cellulaire ; Cependant, excès mitochondries produisent également des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui pourraient provoquer la mort cellulaire. Par conséquent, le nombre de mitochondries doit sans cesse être ajusté pour répondre aux besoins des cellules. Présent règlement dynamique est obtenue en partie grâce à la fonction de lysosomes qui éliminent les macromolécules et les organites excédent/endommagé. Cellulaire mitochondrial et lysosomal du contenu est donc des indicateurs clés pour évaluer l’adaptation métabolique des cellules. Avec le développement de sondes d’organites, lysosome bien caractérisé ou colorants spécifiques mitochondries sont devenues disponibles en divers formats d’étiqueter les mitochondries et les lysosomes cellulaires. Multicolor cytométrie en flux est un outil commun aux phénotypes cellulaires profil et a la capacité d’être intégrée aux autres épreuves. Nous présentons ici un protocole détaillé de comment combiner des colorants d’organite spécifique avec des marqueurs de surface souillure pour mesurer la quantité des lysosomes et des mitochondries dans les populations de différentes cellules de T sur un cytomètre en flux.

Introduction

L’activation et la prolifération des lymphocytes T sont des étapes cruciales pour le montage des réponses immunitaires réussies. Les progrès récents suggèrent que le métabolisme cellulaire est étroitement liée à la fois le développement et les fonctions des cellules T. Par exemple, les cellules naïves T s’appuient en grande partie sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour répondre à la demande d’énergie au cours de la recirculation parmi les organes lymphoïdes secondaires. Lors de l’activation, naïve T cellules subissent une reprogrammation métaboliques drastiques, y compris l’induction de la glycolyse aérobie pour augmenter la production d’ATP et de remplir les énormes besoins métaboliques au cours de la prolifération et la différenciation cellulaire. Les cellules qui ne parviennent pas à suivre à travers les besoins métaboliques meurent par apoptose1,2. Au cours de la reprogrammation métabolique, mitochondries jouent un rôle important car ils sont les organites en grande partie responsables de la production d’ATP à fournir de l’énergie pour la cellule, et le contenu des mitochondries cellulaires fluctue au cours de commutateurs métaboliques tout au long de la cellule T développement et activation3. Cependant, l’accumulation des mitochondries superflus ou endommagés peut produire des excès ROS qui endommagent les lipides, les protéines et l’ADN et peut éventuellement conduire à la mort4 de cellules

Les mitochondries excessives ou endommagés résultant de modifications métaboliques sont éliminés par une forme spécialisée de l’autophagie5, appelée mitophagy. Les mitochondries sont encapsulés par autophagosomes et ensuite fusionnées avec les lysosomes pour dégradation. Ces fermer communications entre les mitochondries et les lysosomes ont généré beaucoup d’intérêt6,7. Par exemple, le stress oxydant stimule les mitochondries pour former des vésicules dérivés de mitochondries (FDM) qui sont ciblés vers les lysosomes pour dégradation dans une phosphatase et tensine homologue (PTEN)-induite par la kinase putative 1 (PINK1) et parkin (une E3 ubiquitine ligase) 8de façon dépendante. On a également constaté que mitophagy est essentiel pour l’adipocyte beige et blanc transition9,10. Plus important encore, les lysosomes sont pas simplement un compartiment de dégradation, mais aussi un organisme de réglementation de la signalisation cellulaire. L’accumulation excessive de substrat en raison de déficiences enzymatiques entraîne un dysfonctionnement lysosomal en perturbant la perméabilité de la membrane lysosomale et touche Ca2 + l’homéostasie du11. Plus loin, les défauts fonctionnels des lymphocytes T en lipase acide lysosomale (LAL)12 ou métabolite lysosomal transporteur knockout souris modèle13 ont montré l’importance des lysosomes dans le maintien de l’homéostasie des lymphocytes T. Les mitochondries et les lysosomes sont des parties inséparables de la régulation du métabolisme cellulaire. Mesurer le contenu cellulaire mitochondrial a donc été un indicateur crucial pour évaluer l’état de métaboliques et fonctionnel des cellules T.

Tests couramment utilisées pour quantifier cellulaires mitochondriales ou lysosomales des matières incluent immunoblot, microscopie électronique, immunofluorescence (IF) et l’analyse PCR de l’ADN mitochondrial de14,en numéros de la copie15, 16. immunoblot pouvez comparer quantitativement les taux de protéines à travers différents échantillons et électron ou si la microscopie permet de visualiser les caractéristiques morphologiques de ces organites17, ces analyses portent certains inconvénients techniques. Par exemple, c’est beaucoup de temps pour acquérir un nombre suffisant d’images de cellule avec fort grossissement et résolution ou pour comparer les niveaux d’expression d’une protéine dans des dizaines d’échantillons, rendant ces dosages considérés comme méthodes de débit faible. En outre, ces tests ne peuvent être appliqués à une population homogène de cellules, telles que des lignées de cellules, mais pas à des échantillons de tissus qui sont composées de peuplements mixtes.

Il est également difficile d’appliquer ces tests auprès de populations rares, pour lesquelles l’exigence d’une cellule minimale des numéros de 106 108 est impossible à satisfaire. Enfin, les cellules sont habituellement lysés ou fixés au cours du processus, ce qui les rend incompatibles avec d’autres méthodes pour extraire davantage d’informations. Comparaison avec les méthodes traditionnelles, cytométrie en flux axées sur la fluorescence a un débit relativement élevé – l’information de toutes les cellules d’un échantillon composés de populations cellulaires mixtes peut être analysée et recueillie en même temps. En outre, on peut détecter plus de 10 paramètres sur la même cellule et trier les cellules issus des phénotypes désirées pour plus amples essais. Des sondes fluorescentes réactifs ont été utilisés pour étiqueter des lysosomes et des mitochondries dans les cellules vivantes et peuvent être détectées par l’écoulement cytometry18,19. Ces sondes organite spécifique sont cellulaires perméables et ont des caractéristiques physico-chimiques qui leur permettent d’être concentrée dans des emplacements spécifiques subcellulaires ou organites. Idéalement, ces sondes sont disponibles dans différents formats fluorescents, permettant ainsi à leur demande d’analyse multicolore.

Ce protocole décrit en détail comment combiner le marqueur de surface coloration avec des colorants spécifiques lysosome ou mitochondries lysosomes étiquette ou vivent de mitochondries dans les cellules. Ceci est particulièrement utile pour les échantillons produits des principaux tissus et organes, qui sont souvent composés de populations de cellules hétérogènes. Les chercheurs peuvent identifier des populations de cellules d’intérêt par leur expression du marqueur de surface et mesurer plus précisément le contenu lysosomal ou mitochondrial par l’intermédiaire de colorants organite spécifique dans ces cellules. Ici, nous démontrons la procédure détaillée de cytométrie qui évalue la masse lysosomale ou mitochondriale dans les sous-populations importante des lymphocytes T spléniques.

Protocol

La procédure de récolte de tissus de souris décrite ici a été approuvée par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université nationale Yang-Ming. 1. préparation des lymphocytes Suspension des organes lymphoïdes Euthanasier la souris par une méthode approuvée telles que l’inhalation de la CO2 dans un compartiment transparent acrylique, suivie d’une dislocation cervicale pour s’assurer de la mort.NOTE : Conserver le débit d…

Representative Results

Identification de sous-ensembles majeurs des lymphocytes T dans la rate et le thymus En bref, des suspensions de cellules simples de la rate et le thymus ont été lysées de globules rouges, incubées avec 2.4G2 surnageant, suivies d’organite spécifique colorant et marqueur de surface coloration avec l’anticorps conjugué à fluorescence (tableau 1). La progression du développement des th…

Discussion

Ce protocole combine organite spécifique colorants et marqueur de surface coloration afin de quantifier la quantité de mitochondries ou lysosomes dans les populations de différentes cellules de T. Cette méthode a été développée pour contourner la limitation de cellule nombre et homogénéité les exigences pour les méthodes traditionnelles, telles que la microscopie électronique et l’analyse par immunotransfert. Il est particulièrement utile dans l’analyse de populations cellulaires rares et examiner simul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’élaboration du présent protocole a été pris en charge par des subventions de Taiwan de la Science et la technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 et MOST104-2628-B-010-002-MY4 à C.L. Hsu. C.W. Wei est un destinataire de l’excellente thèse prix d’Institut de microbiologie et immunologie, Université nationale de Yang-Ming.

Materials

10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) ATCC HB-197 
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

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Cite This Article
Wei, C., Zhou, T., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

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