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Immunology and Infection

बहुरंगा प्रवाह Cytometry-टी कोशिकाओं में Mitochondria और Lysosomes के ठहराव आधारित

doi: 10.3791/58844 Published: January 9, 2019

Summary

यह लेख एक शक्तिशाली विधि mitochondria या lysosomes यों में रहने वाली कोशिकाओं को समझाती है । lysosome के संयोजन-या mitochondria-सतह मार्करों के खिलाफ फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट रंजक मिश्रित कोशिका आबादी में इन organelles के ठहराव, प्राथमिक ऊतक नमूनों से काटा कोशिकाओं की तरह, की अनुमति देता है का उपयोग करके बहुरंगा प्रवाह cytometry.

Abstract

Introduction

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सक्रियकरण और टी कोशिकाओं के प्रसार सफल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं बढ़ते के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । हाल के अग्रिम सुझाव है कि सेलुलर चयापचय कसकर दोनों विकास और टी कोशिकाओं के कार्यों के साथ जुड़ा हुआ है । उदाहरण के लिए, भोली टी कोशिकाओं माध्यमिक लसीकावत् अंगों के बीच संचलन के दौरान ऊर्जा की मांग को पूरा करने के लिए काफी हद तक ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) पर भरोसा करते हैं । सक्रियण पर, भोली टी कोशिकाओं को एटीपी उत्पादन बढ़ाने के लिए और सेल भेदभाव और प्रसार के दौरान जबरदस्त चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए एरोबिक glycolysis की प्रेरण सहित कठोर चयापचय reprogramminging, से गुजरना । कोशिकाओं है कि चयापचय की जरूरत के माध्यम से पालन करने में विफल apoptosis1,2से मर जाते हैं । चयापचय reprogramminging के दौरान, mitochondria महत्वपूर्ण भूमिका निभा के बाद से वे organelles के उत्पादन के लिए मोटे तौर पर जिंमेदार है सेल के लिए ऊर्जा की आपूर्ति, और सेलुलर mitochondria सामग्री चयापचय स्विच के दौरान उतार चढ़ाव टी सेल विकास और सक्रियकरण3भर में । हालांकि, अनावश्यक या क्षतिग्रस्त mitochondria के संचय अतिरिक्त ROS उत्पादन कर सकते है कि लिपिड नुकसान, प्रोटीन, और डीएनए, और अंततः कोशिका मृत्यु4 के लिए नेतृत्व कर सकते है

अत्यधिक या क्षतिग्रस्त mitochondria चयापचय परिवर्तन से उत्पंन autophagy5, mitophagy के रूप में जाना के एक विशेष रूप से हटा रहे हैं । Mitochondria autophagosomes से लिपटे हुए हैं और फिर क्षरण के लिए lysosomes के साथ जुड़े हुए हैं । mitochondria और lysosomes के बीच इन बंद संचार महान ब्याज6,7उत्पंन किया है । उदाहरण के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव mitochondria mitochondria-व्युत्पन्न बुलबुले (MDVs) है कि एक lysosomes और फॉस्फेट tensin (homolog)-प्रेरित PTEN ख्यात 1 (कळेनासे) और PINK1 (एक E3 parkin ubiquitin) में क्षरण के लिए ligase करने के लिए लक्षित कर रहे हैं फार्म करने के लिए उत्तेजित करता है आश्रित रीति8. यह भी पाया गया कि mitophagy बेज रंग के लिए सफेद adipocyte संक्रमण9,10के लिए आवश्यक है । इससे भी अहम बात यह है कि lysosomes महज एक गिरावट वाले डिब्बे नहीं हैं, बल्कि सेल्यूलर सिग्नलिंग का एक रेगुलेटर है । अत्यधिक सब्सट्रेट संचय lysosomal झिल्ली पारगम्यता को बाधित करने के द्वारा lysosomal रोग में एंजाइम की कमी के परिणाम के कारण और प्रभावित करता है Ca2 + homeostasis11. टी सेल कार्यात्मक दोष में lysosomal एसिड lipase (लाल)12 या lysosomal metabolite ट्रांसपोर्टर नॉकआउट माउस मॉडल13 आगे टी सेल lysosomes को बनाए रखने में homeostasis के महत्व को दिखाया । दोनों mitochondria और lysosomes सेलुलर चयापचय विनियमन के अविभाज्य भागों हैं । इसलिए, सेलुलर mitochondrial सामग्री की माप टी सेल चयापचय और कार्यात्मक स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण संकेतक किया गया है.

परख सामांयतः सेलुलर mitochondrial या lysosomal सामग्री के लिए इस्तेमाल किया immunoblot शामिल हैं, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, immunofluorescent (यदि) धुंधला, और पीसीआर mitochondrial डीएनए की नकल संख्या14,15, 16. जबकि immunoblot मात्रा अलग नमूनों और इलेक्ट्रॉन भर में प्रोटीन के स्तर की तुलना कर सकते है या अगर माइक्रोस्कोपी इन organelles17की रूपात्मक बानगी कल्पना कर सकते हैं, इन परख कुछ तकनीकी कमियां सहन । उदाहरण के लिए, यह उच्च आवर्धन और संकल्प के साथ सेल छवियों की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए या नमूने के दर्जनों भर में एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए समय लेने वाली है, इन परख कम प्रवाह तरीकों माना जाता है । इसके अलावा, इन परख केवल सेल लाइनों के रूप में समरूप सेल जनसंख्या, के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन नहीं ऊतक नमूने है कि मिश्रित आबादी से बना रहे हैं ।

यह दुर्लभ आबादी के लिए इन परख लागू करने के लिए भी मुश्किल है, जिसके लिए 106 से 108 से ंयूनतम सेल संख्या की आवश्यकता को पूरा करने के लिए असंभव है । अंत में, कोशिकाओं को आमतौर पर लीजड ड या प्रक्रिया के दौरान तय कर रहे हैं, उंहें अंय तरीकों के साथ असंगत बनाने के लिए और अधिक जानकारी निकालने । पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में, फ्लोरोसेंट आधारित प्रवाह cytometry एक अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह है-एक मिश्रित कोशिका आबादी से बना नमूना के भीतर सभी कोशिकाओं की जानकारी का विश्लेषण किया जा सकता है और एक साथ एकत्र । इसके अलावा, एक ही सेल पर 10 से अधिक मापदंडों का पता लगाने और आगे की परख के लिए वांछित phenotypes के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट कर सकते हैं । प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट जांच जीवित कोशिकाओं में lysosomes और mitochondria लेबल और प्रवाह18,19cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है इस्तेमाल किया गया है । इन organelle-विशिष्ट जांच सेल पारगंय है और फिजिको-रासायनिक विशेषताओं है कि उंहें विशिष्ट उपसेलुलर स्थानों या organelles में केंद्रित होने की अनुमति है । आसानी से, इन जांच विभिंन फ्लोरोसेंट प्रारूपों में उपलब्ध हैं, इस प्रकार बहुरंगा विश्लेषण के लिए अपने आवेदन को सक्षम करने ।

यह प्रोटोकॉल विस्तार में वर्णन करता है कि कैसे lysosome-या mitochondria-विशिष्ट रंजक के साथ सतह मार्कर दाग गठबंधन करने के लिए lysosomes या जीवित कोशिकाओं में mitochondria लेबल । यह प्राथमिक ऊतकों और अंगों, जो अक्सर विषम कोशिका आबादी से बना रहे हैं से उत्पन्न नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. शोधकर्ताओं ने अपनी सतह मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा ब्याज की कोशिका आबादी की पहचान और विशेष रूप से इन कोशिकाओं में organelle-विशिष्ट रंगों के माध्यम से lysosomal या mitochondrial सामग्री को मापने कर सकते हैं । यहाँ, हम प्रमुख प्लीहा टी सेल उपआबादी में lysosomal या mitochondrial मास का मूल्यांकन करता है कि प्रवाह cytometric विश्लेषण की विस्तृत प्रक्रिया का प्रदर्शन.

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Protocol

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यहां वर्णित माउस ऊतक कटाई प्रक्रिया राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. लसीकावत् अंगों से लिम्फोसाइट निलंबन की तैयारी

    2. Mitochondria और Lysosomes के ठहराव

    नोट: इन रंजक के लिए इष्टतम धुंधला हालत ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन है क्योंकि organelle-विशिष्ट डाई धुंधला पहले प्रदर्शन । सतह मार्कर धुंधला एंटीबॉडी कैपिंग और उस तापमान पर internalization की वजह से काफी कम किया जा सकता है ।

    1. गोल नीचे FACS ट्यूबों के लिए 1 x 106 कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, (३०० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए) कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    2. अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए जांच स्टॉक समाधान पतला (१०० एनएम MitoTracker ग्रीन या LysoTracker ग्रीन; पहले से mitochondria-या lysosome-विशिष्ट डाई, क्रमशः) पूर्व गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में । यह lysosome के लिए काम कर समाधान है-या mitochondria-विशिष्ट डाई ।
      नोट: परीक्षण (mitochondria के लिए 20-200 एनएम-विशिष्ट डाई और ५०-७५ एनएम के लिए lysosome-विशिष्ट यहां इस्तेमाल किया डाई के लिए) निर्माता द्वारा सुझाए गए काम सांद्रता की सीमा सहित कई सांद्रता क्रम में सबसे अच्छा धुंधला दक्षता प्राप्त करने के लिए । एक सेल जनसंख्या है कि धुंधला लक्ष्य (जैसे lysosomes) सकारात्मक नियंत्रण (जैसे मानव CD14+ monocytes) की अच्छी अभिव्यक्ति के लिए जाना जाता है चुनें । नकारात्मक और सकारात्मक दाग के बीच अच्छी जुदाई के आधार पर काम एकाग्रता का चयन करें, साथ ही अच्छा सेल व्यवहार्यता ।
    3. lysosome के १०० µ एल में कोशिकाओं resuspend-या mitochondria-विशिष्ट डाई काम समाधान और 5% CO2 मशीन में 15 मिनट या 30 मिनट, क्रमशः के लिए ३७ ° c में मशीन ।
    4. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए बर्फ के 1 मिलीलीटर-शीत FACS बफर जोड़ें । (३०० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए) और supernatant त्यागना द्वारा गोली कोशिकाओं । कोशिकाओं अब सतह मार्कर धुंधला के लिए तैयार हैं ।

    3. सतह मार्कर धुंधला

    1. पूर्व के १०० µ एल के साथ ब्लॉक एफसी रिसेप्टर्स titrated 2.4 g2 hybridoma supernatant के लिए बर्फ पर 10 min. धो कोशिकाओं के साथ 1 FACS बफर की मिलीलीटर और केंद्रापसारक (३०० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए). supernatant छोड़ें ।
    2. ५० µ एल प्री-titrated प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी संयोजन के साथ कोशिकाओं को बर्फ पर FACS बफर में 20 मिनट के लिए मशीन । प्रकाश से बचें ।
      नोट: एकल रंग-सना हुआ कक्ष जो एंटीबॉडी संयोजन और कोशिकाओं में मौजूद सभी फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को शामिल करने के लिए प्रत्येक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर और प्रवाह पर क्षतिपूर्ति समायोजन की वोल्टेज की स्थापना के लिए organelle-विशिष्ट डाई के साथ ही इलाज तैयार cytometer । इसी तरह, सभी एंटीबॉडी के साथ सना हुआ कोशिकाओं का उपयोग करके पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) तैयार है, लेकिन organelle के साथ दाग-विशिष्ट रंगों के बिना ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए (३०० एक्स जी, केंद्रापसारक द्वारा FACS बफर और गोली के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें) । supernatant छोड़ें ।
    4. FACS 1 µ g/mL propidium आयोडाइड (PI) युक्त बफ़र के ३०० µ l में कक्षों को पुनर्निलंबित और तुरंत प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण करें ।

    4. फ्लो Cytometer पर नमूना संग्रह

    1. कंप्यूटर, फ्लो cytometer, FACS अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और मशीन मंच के आधार पर किसी भी अन्य गौण उपकरणों को चालू करें । लगभग 1 मिनट के लिए रन पंजाबियों को सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह लाइन पंजाबियों और म्यान बफर से भर जाता है । सुनिश्चित करें कि प्रवाह स्ट्रीम सुचारू रूप से चलती है ।
    2. नए प्रयोग खोलें और निर्माता के निर्देश के अनुसार cytometer पैरामीटर (फ्लोरोसेंट डिटेक्टरों) का चयन करें । ७०-µm सेल छलनी और भंवर के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं के झुरमुट और नक़ल गठन से बचने के लिए प्रत्येक नमूने के अधिग्रहण से पहले ।
    3. फॉरवर्ड कैटरिंग (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) के डॉट भूखंड बनाओ, जो क्रमशः सेल आकार और दानेदार का प्रतिनिधित्व करते हैं । FSC और एसएससी की वोल्टेज का अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं को भूखंडों में दिखाई देते हैं । FSC के डॉट भूखंड बनाओ-ए बनाम FSC-डब्ल्यू (या FSC-एच) और एकल कोशिकाओं के लिए एक गेट आकर्षित ।
    4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर के डॉट भूखंड बनाओ । पृष्ठभूमि संकेत का निर्धारण और एक रंग-सना हुआ नियंत्रण का उपयोग करने के लिए प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर की वोल्टेज को समायोजित करने के लिए unstain हुआ कोशिकाओं का प्रयोग करें, ताकि सकारात्मक और नकारात्मक कोशिका आबादी स्पष्ट रूप से अलग हैं और अधिग्रहण के गतिशील रेंज के भीतर.
    5. सभी वोल्टेज के बाद सेट कर रहे हैं, उपयोग ऑटो क्षतिपूर्ति अगर उपलब्ध है, या मैन्युअल रूप से धुंधला और एक रंग के साथ मुआवजा समायोजित-दाग नियंत्रण वर्णक्रमीय spillover सही करने के लिए. सैंपलों को मुआवजा लागू करें ।
    6. प्रत्येक पैरामीटर की एक डॉट साजिश बनाओ और अपने प्रयोगात्मक सेट अप के अनुसार फाटकों आकर्षित । उदाहरण के लिए, FSC-a बनाम FSC-H (या FSC-W) दोहरी को बाहर करने के लिए, FSC द्वारा पीछा-एक बनाम एसएससी-लिम्फोसाइट गेटिंग के लिए एक; एसएससी-एक बनाम PI (लाइव सेल) और CD4 बनाम सीडी 8 (चित्रा 1) ।
    7. आबादी के बीच सार्थक तुलना के लिए पर्याप्त घटनाओं (कुल सेल संख्या) लीजिए । आम तौर पर, ब्याज की जनसंख्या में १,००० की घटनाओं को20से प्राप्त किया जाना चाहिए ।
    8. सभी नमूनों के बाद, प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए निर्यात प्रवाह डेटा प्राप्त कर रहे हैं । भविष्य में समान प्रयोगों पर लागू करने के लिए cytometer सेटिंग और पैरामीटर्स को रक्षित करने के लिए प्रयोग को टेम्पलेट के रूप में सहेजें.

    5. डेटा विश्लेषण

    नोट: प्रवाह cytometric डेटा, दोनों वाणिज्यिक और मुफ्त सॉफ्टवेयर का विश्लेषण करने के लिए कई उपकरण हैं । फ्लो cytometers का अधिग्रहण सॉफ्टवेयर डेटा एनालिसिस के लिए भी काम कर सकता है । यहां हम एक उदाहरण के रूप में FlowJo इस्तेमाल किया ।

    1. सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और FCS फ़ाइलों को कार्यस्थान में खींचें । किसी ग्राफ़िक विंडो को खोलने के लिए किसी नमूने पर क्लिक करें । x और y अक्षों पर क्लिक करके x और y अक्ष पर प्रस्तुत किए जाने वाले पैरामीटर्स का चयन करें । उपकरण पट्टी का उपयोग करने के लिए अंतर व्यक्त मार्करों या सेल की आबादी के परिभाषित phenotypes के अनुसार फाटकों आकर्षित ।
    2. चित्र 1में दिखाए गए के रूप में प्रत्येक पैरामीटर के गेट्स जोड़ें । कार्यक्षेत्र में सभी नमूनों के लिए गेट्स खींचें, ताकि वे समान गेटिंग मिलता है ।
    3. ग्राफ़िकल रिपोर्ट्स बनाने के लिए प्लॉट्स को लेआउट संपादक में खींचें ।
    4. एक ग्राफिक विंडो में सांख्यिकी बटन (Σ) पर क्लिक करके और "मतलब" और उचित पैरामीटर का चयन करके ब्याज की प्रत्येक जनसंख्या के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, चैनल organelle-विशिष्ट डाई का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. तब "जोड़ें" क्लिक करें ।
    5. तालिका संपादक आइकन पर क्लिक करें और MFI को तालिका संपादक सांख्यिकीय रिपोर्ट बनाने के लिए खींचें । के रूप में सहेजें एक्सेल, पाठ या सीएसवी फ़ाइल डेल्टा mfi (ΔMFI) mfi (organelle-विशिष्ट रंजक)-mfi (FMO) के रूप में गणना करने के लिए ।
      नोट: अलग cytometer सेटिंग्स (वोल्टेज, फ्लोरोसेंट चैनलों या मुआवजा) के साथ अधिग्रहीत नमूनों के बीच MFI की गणना नहीं करते. विभिन्न सेटिंग्स के साथ प्रयोगों से व्युत्पंन मूल्यों की तुलना अर्थहीन और पक्षपातपूर्ण हैं ।
    6. तालिका और आंकड़े बनाने के लिए लेआउट संपादक से कार्यस्थान और प्लॉट से सभी मानों को निर्यात करें ।

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    Representative Results

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    तिल्ली और थाइमस में मेजर टी सेल के उपसमुच्चयों की पहचान

    संक्षेप में, तिल्ली और थाइमस से एकल सेल निलंबन लाल रक्त कोशिकाओं के लीजड ड थे, 2.4 g2 supernatant के साथ, organelle-विशिष्ट डाई और प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी (तालिका 1) के साथ सतह मार्कर दाग के बाद की मशीन । thymocytes के विकासात्मक प्रगति सह रिसेप्टर्स सीडी 8 और CD4 के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके वर्णित किया जा सकता है. सबसे अपरिपक्व thymocytes CD4 या सीडी 8 व्यक्त नहीं करते और डबल नेगेटिव (DN) कहलाते हैं । फिर, वे CD4 और सीडी 8 दोनों को विनियमित करते हैं और डबल पॉजिटिव (डीपी) बन जाते हैं । अंत में, वे नीचे-विनियमित CD4 या सीडी 8 और परिपक्व एकल सकारात्मक (सपा) कोशिकाओं को अंग छोड़ने के लिए तैयार हो जाते हैं । टी सेल विकास के प्रारंभिक चरणों, जब कोशिकाओं सह-रिसेप्टर्स CD4 और सीडी 8 व्यक्त नहीं करते हैं, आगे CD44 और CD25 अभिव्यक्ति के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है. शीघ्रातिशीघ्र progenitors CD44+ CD25- (DN1) होते हैं, और फिर वे CD25 व्यक्त करने लगते हैं और CD44+CD25+ (DN2) कोशिकाएँ बन जाते हैं. उसके बाद, कोशिकाओं को नीचे-विनियमित CD44 और CD44-CD25+ (DN3) कोशिकाओं और बन जाते हैं, अंत में, वे नीचे CD25 को विनियमित के रूप में अच्छीतरह से CD44-CD25- (DN4) कोशिकाओं है कि CD4 और सीडी 8 व्यक्त करने के लिए रास्ते पर है बनने के लिए और बनने डबल-धनात्मक (DP) कक्ष ।

    तिल्ली में, टी कोशिकाओं साइटोटोक्सिक सीडी 8+ और सहायक CD4+ टी कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता है । इन दोनों की आबादी आगे CD62L और CD44 धुंधला पर आधारित भोली, प्रभाव और स्मृति सबसेट में विभाजित किया जा सकता है । विस्तृत गेटिंग रणनीति चित्रा 1में दिखाया गया है ।

    अलग टी सेल उपसमुच्चयों में mitochondria मास की ठहराव

    Mitochondria-विशिष्ट रंजक टी कोशिका आबादी में Mitochondria की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. हमने पाया है कि mitochondrial सामग्री DN1 में सबसे कम थे, DN2 में नुकीला-DN3, और फिर थोड़ा DN4 और डीपी thymocytes में कमी आई और भी CD4 में कम थे और सीडी 8 सपा thymocytes (चित्रा 2) । हालांकि, CD4 या सीडी 8 सपा thymocytes उच्च mitochondria प्लीहा CD4 या सीडी 8 टी कोशिकाओं (चित्रा 2बी) से अधिक धुंधला MFI था । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि mitochondrial सामग्री अपरिपक्व अपने परिपक्व समकक्षों से अधिक mitochondria युक्त thymocytes के साथ टी सेल विकास के दौरान उतार चढ़ाव है, और भोली टी कोशिकाओं है कि ऑक्सीजन युक्त रक्त में पुनर्संचारित भी कम है mitochondrial मास । दिलचस्प है, mitochondrial सामग्री की इस कमी CD4 टी वंश (चित्रा 2), और टी सेल सक्रियकरण की तुलना में सीडी 8 में और अधिक प्रमुख था यह कमी आई है । के बीच सक्रिय टी कोशिकाओं, CD4+ स्मृति टी कोशिकाओं को थोड़ा अधिक mitochondria के प्रभाव की तुलना में था; हालांकि, विपरीत सीडी 8+ टी कोशिकाओं के लिए मामला था: सीडी 8+ मेमोरी टी कोशिकाओं सभी टी सेल उपसमुच्चय (चित्रा 2बी) के बीच सबसे कम mitochondrial मास था ।

    टी कोशिकाओं की विभिन्न उपजनसंख्याों में Lysosomal सामग्री मापन

    lysosome-विशिष्ट डाई का प्रयोग, हम अपेक्षाकृत कम मनाया, लेकिन पता लगाने, सभी टी सेल आबादी में lysosomal सामग्री, DN1 thymocytes में lysosomes की अधिक प्रमुख उपस्थिति के साथ (चित्रा 3) । आगे DN1 से thymocyte सबसेट के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला । परिधि में, lysosomes की एक अपेक्षाकृत अधिक संख्या स्मृति और प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं में पाया गया था । यह घटना पिछले दिखा रहा है कि सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं lysosomal की उनकी अभिव्यक्ति वृद्धि हुई झिल्ली प्रोटीन 1 (दीपक-1)21,22, उनके कब्जे को दर्शाती के साथ कतार में है lysosomal-साइटोटोक्सिक granules (चित्रा 3बी)

    Figure 1
    चित्रा 1 : प्लीहा लिम्फोसाइटों और thymocytes की गेटिंग रणनीति । FSC/एसएससी और पीआई- लाइव singlets को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं पर पूर्व gated थे । (क) चूहों से कुल thymocytes CD4, सीडी 8, CD44, और CD25 के दाग थे. CD4 और सीडी 8 भाव में भेद करने के लिएCD4 +सीडी 8- सपा,CD4-सीडी 8+ सपा, CD4+सीडी 8+ डीपी, और CD4-सीडी 8- डीएन सबसेट का इस्तेमाल किया गया. CD4-सीडी 8- DN सबसेट आगे CD44+CD25- DN1, CD44 + CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3, और CD44-CD25- DN4 उप-जनसंख्या में विभाजित किया गया था । (ख) चूहों से कुल splenocytes TCRβ, CD4, सीडी 8, CD44, और CD62L के दाग थे. TCRβ+ कोशिकाओं CD4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं है, जो आगे भोली (CD44-CD62L+), स्मृति (CD44+CD62L+), और प्रभाव में विभाजित थे में अलग थे (CD44+CD62L -) आबादी. परिणाम n = 3-4 के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2 : प्रतिनिधि प्रत्येक कोशिका जनसंख्या में धुंधला mitochondria दिखा हिस्टोग्राम । कोशिकाओं ३७ ˚ सी पर 15 मिनट के लिए mitochondria-विशिष्ट डाई के साथ दाग, सतह मार्कर धुंधला द्वारा पीछा किया गया । धुंधला कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संकेत प्रवाह cytometer द्वारा अधिग्रहीत और पर विश्लेषण किया गया था । (क) डीएन और डीपी thymocytes के Mitochondria दाग । (ख) CD4SP और CD8SP thymocytes और प्लीहा टी कोशिका आबादी के दाग Mitochondria. ΔMFI = mfi (Mitochondria धुंधला)-mfi (FMO) । ठोस लाल रेखा mitochondria धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है, ठोस नीली रेखा से पता चलता है FMO नियंत्रण, और डैश्ड लाल रेखा का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब है mitochondria प्रत्येक जनसंख्या में धुंधला । परिणाम n = 3-4 के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3: प्लीहा लिम्फोसाइटों और thymocytes में lysosome दाग दिखाने वाले प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । कोशिकाओं ३७ ˚ सी पर 30 मिनट के लिए lysosome-विशिष्ट डाई के साथ दाग, सतह मार्कर धुंधला द्वारा पीछा किया गया । धुंधला कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संकेत प्रवाह cytometer द्वारा अधिग्रहीत और विश्लेषण किया गया था । (क) डीएन और डीपी thymocytes के Lysosome दाग । (ख) CD4SP और CD8SP thymocytes और प्लीहा टी कोशिका आबादी के दाग Lysosome. ΔMFI = mfi (Lysosome धुंधला)-mfi (FMO) । ठोस हरी रेखा का प्रतिनिधित्व करता है lysosome धुंधला, ठोस नीली रेखा से पता चलता है FMO, और डैश्ड लाल रेखा का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब है lysosome प्रत्येक जनसंख्या में धुंधला । परिणाम n = 5 के साथ एक प्रयोग के प्रतिनिधि हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Table 1
    तालिका 1: बहुरंगा प्रवाह cytometry पैनल डिजाइन । fluorochrome और एंटीबॉडी की एकाग्रता/दाग मिश्रण में organelle रंजक यहां सूचीबद्ध हैं । यह दृढ़ता से अनुमापन और प्रत्येक एंटीबॉडी परीक्षण जब नए धुंधला पैनलों की स्थापना की सिफारिश की है ।

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    Discussion

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    इस प्रोटोकॉल organelle विशिष्ट रंजक और सतह मार्कर दाग को जोड़ती है mitochondria या lysosomes की राशि अलग टी कोशिका आबादी में मात्रा । इस विधि के लिए सेल संख्या और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और immunoblot विश्लेषण के रूप में पारंपरिक तरीकों, के लिए एकरूपता आवश्यकताओं की सीमा को दूर करने के लिए विकसित किया गया था । यह दुर्लभ कोशिका आबादी का विश्लेषण करने में विशेष रूप से उपयोगी है और साथ ही एक ही समय में कई सेल प्रकार की जांच ।

    प्रक्रिया की अवधि और गर्मी के तापमान इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कारक हैं । उचित organelle लेबलिंग को organelle-विशिष्ट रंगों के सटीक अनुमापन की आवश्यकता होती है । कोशिकाओं को भी कड़ाई से बर्फ पर रखा जाना चाहिए व्यवहार्यता बढ़ाने और एंटीबॉडी कैपिंग और internalization से बचने के । इसके अलावा, इन organelle-विशिष्ट रंगों के प्रतिदीप्ति प्रकाश जोखिम और तापमान में परिवर्तन की चपेट में है । इस प्रकार, नमूनों की तत्काल विश्लेषण एक बार धुंधला प्रक्रिया पूरा हो गया है बहुत महत्वपूर्ण है । हम लगातार 2 घंटे के भीतर पूरा प्रयोग पूरा कर लिया है ।

    इस प्रोटोकॉल के बाद से cytometer प्रवाह द्वारा बहुरंगा प्रतिदीप्ति का पता लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है intracellular घटकों का मूल्यांकन करने के लिए, अधिग्रहण सेटिंग्स (जैसे पीएमटी वोल्टेज) और स्पेक्ट्रा ओवरलैप का मुआवजा (spillover के पड़ोसी चैनलों में प्रतिदीप्ति) भारी संकेत की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं । यह विशेष रूप से प्रासंगिक है जब सतह मार्करों प्रासंगिक सेल प्रकार की पहचान की जरूरत छह से ऊपर वृद्धि हुई है । इस स्थिति में, बहुरंगा प्रवाह cytometry प्रयोगों डिजाइनिंग में अनुभव उच्च गुणवत्ता डेटा अधिग्रहण के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो जाता है ।

    प्रतिरक्षा प्रणाली रोगज़नक़ अपमान और संक्रमण से शरीर की रक्षा करता है, और टी सेल सक्रियण अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आवश्यक संकेत प्रदान करने में निर्णायक भूमिका है । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि अलग टी सेल आबादी अद्वितीय चयापचय कार्यक्रम है, और mitochondrial और lysosomal सामग्री चयापचय परिवर्तन के महत्वपूर्ण संकेतक हैं । हालांकि, यह घटना टी कोशिकाओं के लिए अद्वितीय नहीं है । विभेद और मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं के रूप में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण, भी बारीकी से उनके चयापचय स्थिति23,24से जुड़े हुए हैं । इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि यह वंश-विशिष्ट मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके ब्याज की किसी भी कोशिका आबादी की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, अंय organelle-विशिष्ट रंगों के साथ संयोजन में, जैसे एर-या Cyto-आईडी, यह विभिंन प्रकार की कोशिकाओं में विभिंन organelles या सेलुलर डिब्बों का मूल्यांकन करने की क्षमता है ।

    इस mitochondria या lysosome ठहराव विधि की स्थापना केवल टी कोशिकाओं में चयापचय अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई नहीं है, लेकिन यह भी रोग सेटिंग्स में चयापचय परिवर्तन पर केंद्रित है कि अनुसंधान लाभ करने के लिए महान क्षमता है, जैसे कैंसर या स्व-प्रतिरक्षित रोग25,26.

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    Disclosures

    लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं की घोषणा ।

    Acknowledgments

    इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए ताइवान विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान का समर्थन किया गया था (अधिकांश) NSC103-उंचीवर-b-010-002-MY2 and MOST104-2628-b-010-002-MY4 ते टिपू सू. C.W. वेई संस्थान के माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी, राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के उत्कृष्ट थीसिस पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
    11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
    15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
    5 mL syringe TERUMO 
    6 cm Petri dish α-plus
    70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
    Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
    Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
    Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
    Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
    Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
    Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
    Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
    BD LSRFortessa BD Biosciences
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
    FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
    Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
    Flowjo, LLC BD Biosciences
    Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
    L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
    LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
    MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
    MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
    Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
    Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
    Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
    RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
    Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
    Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

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    References

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    बहुरंगा प्रवाह Cytometry-टी कोशिकाओं में Mitochondria और Lysosomes के ठहराव आधारित
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    Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).More

    Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

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