Summary
Denna artikel visar en kraftfull metod för att kvantifiera mitokondrier eller lysosomer i levande celler. Kombinationen av Lysosomen - eller mitokondrierna-specifika färgämnen med fluorescently konjugerade antikroppar mot ytmarkörer tillåter kvantifiering av dessa organeller i blandad cellpopulationer, som primära celler skördas från vävnadsprover, med hjälp av multicolor flödescytometri.
Abstract
T-celler använder olika metaboliska program för att matcha deras funktionella behov under differentiering och spridning. Mitokondrierna är viktiga cellulära komponenter ansvarar för att leverera cellen energi. dock producerar överflödig mitokondrier även reaktiva syreradikaler (ROS) som kan orsaka celldöd. Därför måste antalet mitokondrier ständigt justeras för att passa behoven hos cellerna. Denna dynamiska förordning uppnås delvis genom funktionen i lysosomer som tar bort överskott/skadade organeller och makromolekyler. Därför är cellulära mitokondrie och lysosomala innehållet viktiga indikatorer för att utvärdera den metabola justeringen av celler. Med utvecklingen av sonder för organeller, har välkarakteriserad Lysosomen eller mitokondrierna-specifika färgämnen blivit tillgängliga i olika format att märka cellulära lysosomer och mitokondrier. Multicolor flödescytometri är ett vanligt verktyg till profil cell fenotyper och har förmågan att integreras med andra analyser. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för hur man kombinerar organell-specifika färgämnen med yta markörer färgning för att mäta mängden lysosomer och mitokondrier i olika T-cells populationer på en flödescytometer.
Introduction
Aktivering och spridning av T-celler är kritiska moment för montering av framgångsrika immunsvar. Senaste framstegen föreslår att cellulära metabolismen är tätt förknippad med både utveckling och funktioner av T-celler. Till exempel beroende naiva T-celler till stor del oxidativ fosforylering (OXPHOS) för att möta energibehovet under recirkulation bland sekundära lymfoida organ. Vid aktivering genomgår naiva T-celler drastiska metabola omprogrammering, inklusive induktion av aerob glykolys att öka ATP produktionen och för att uppfylla de enorma metabola krav under celldifferentiering och spridning. De celler som misslyckas med att följa via metabola behov dör av apoptos1,2. Under metabola omprogrammering, spelar mitokondrierna en viktig roll eftersom de är till stor del ansvarig för produktionen av ATP att leverera energi för cellens organeller och cellulär mitokondrier innehållet varierar under metabola växlar hela T cell utveckling och aktivering3. Dock kan ansamling av överflödiga eller skadade mitokondrier producera överskott ROS som skada lipider, proteiner och DNA, och kan så småningom leda till cell död4
Överdriven eller skadade mitokondrierna följd av metabola förändringar tas bort av en specialiserad form av autofagi5, känd som mitophagy. Mitokondrierna är insvept av autophagosomes och sedan smält med lysosomer för nedbrytning. Dessa nära kommunikation mellan mitokondrier och lysosomer har genererat stort intresse6,7. Till exempel oxidativ stress stimulerar mitokondrierna bildar mitokondrier-derived blåsor (MDVs) som är riktade till lysosomer för nedbrytning i ett fosfatas och Tenzin homolog (PT)-inducerad förmodad kinase 1 (PINK1) och parkin (en E3 ubiquitin ligase) koncentrationsberoende sätt8. Det konstaterades också att mitophagy är viktigt för beige till vita fettceller övergången9,10. Lysosomer är viktigare, inte bara en nedbrytning kupé, men också en regulator av cellulär signalering. Överdriven substrat ackumulering på grund av enzymbrist resulterar i lysosomala dysfunktion genom att störa lysosomala membranet permeabilitet och påverkar Ca2 + homeostas f11. T-cell funktionella brister i lysosomalt surt lipas (LAL)12 eller lysosomala metabolit transportör knockout mus modell13 visade ytterligare vikten av lysosomer att upprätthålla T cell homeostas. Både mitokondrier och lysosomer är oskiljaktiga delar av cellulära metaboliska förordning. Mätning av cellulära mitokondriell innehåll har därför varit en viktig indikator för att utvärdera T cells metaboliska och funktionella status.
Analyser som vanligen används för att kvantifiera cellulära mitokondrie eller lysosomala innehållet inkluderar immunoblot, elektronmikroskopi, Immunofluorescerande (om) färgning och PCR-analys av mitokondrie DNA kopia nummer14,15, 16. medan immunoblot kan kvantitativt jämföra proteinnivåer mellan olika prover och electron eller om mikroskopi kan visualisera morfologiska kännetecken för dessa organeller17, dessa analyser bära vissa tekniska nackdelar. Exempelvis är det tidskrävande att förvärva tillräckligt antal cell bilder med hög förstoring och upplösning eller att jämföra de uttrycksnivåerna av ett protein i dussintals prover, att göra dessa analyser anses vara låg genomströmning metoder. Dessutom kan dessa analyser endast tillämpas till homogen cell befolkningen, såsom cellinjer, men inte till vävnadsprover som består av blandade populationer.
Det är också svårt att tillämpa dessa analyser på sällsynta populationer, som kravet på minimal cell nummer från 106 108 är omöjligt att uppfylla. Slutligen, celler vanligtvis lyserat eller fast under processen, vilket gör dem oförenligt med andra metoder för att extrahera ytterligare information. Jämfört med de traditionella metoderna, fluorescerande-baserade flödescytometri har en relativt hög genomströmning - informationen för alla cellerna i ett prov består av blandad cellpopulationer kan analyseras och samlas in samtidigt. Dessutom kan upptäcka mer än 10 parametrar på samma cell och sortera celler baserat på önskad fenotyper för vidare analyser. Reaktiva fluorescerande sonder har använts för att märka lysosomer och mitokondrier i levande celler och kan upptäckas av flöde flödescytometri18,19. Dessa organell-specifika prober har cell genomsläpplig och fysikalisk-kemiska egenskaper som tillåter dem att vara koncentrerade till särskilda subcellulär platser eller organeller. Bekvämt, finns dessa sonder i olika fluorescerande format, vilket gör att deras ansökan om multicolor analys.
Det här protokollet beskriver i detalj hur man kombinerar ytan markör färgning med Lysosomen - eller mitokondrierna-specifika färgämnen till etikett lysosomer eller mitokondrier i levande celler. Detta är särskilt användbart för prover som genereras från primära vävnader och organ, vilka ofta består av heterogena cellpopulationer. Forskare kan identifiera cellpopulationer av intresse av sin yta markör uttryck och specifikt mäta lysosomala eller mitokondrie innehållet genom organell-specifika färgämnen i dessa celler. Här visar vi detaljerade förfarandet för flöde flödescytometrisk analys som utvärderar lysosomala eller mitokondrie massan i stora mjälten T cell subpopulationsna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus vävnad skörd proceduren som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av National Yang-Ming University.
1. beredning av lymfocyter Suspension från lymfoida organ
- Avliva musen med en godkänd metod såsom CO2 inandning i transparent akryl avdelning följt av cervikal dislokation se till döden.
Obs: Hålla flödet klassar av CO2 för en 20% förskjutning per minut på avdelningen, och inte högre än 5 psi (pound per kvadrattum). Det tar 2-3 min för en mus att förlora medvetandet. Upprätthålla CO2 flödet minst för 1 min efter att djuret har slutat andas (5-7 min övergripande). - Placera musen på ryggen på en ren ombord (t.ex. en polystyren plast styrelse) och fixa benen med tejp. Skölj med 70% etanol.
- Att skörda mjälte, skära och öppna bukhålan med 11 cm dissekera saxen (mjälte är under magen och ovanför den vänstra njuren). Ta bort mjälten med pincett och rengör från bindväv (använd sax om nödvändigt).
- För att skörda bräss, skär mellangärdet och bröstkorgen från båda sidor med dissekera saxen. Använd tången för att lyfta upp bröstbenet att avslöja hela brösthålan. Separera bräss noggrant från omgivande vävnader med en sax och ta bort eventuella kvarvarande bindväv på en pappershandduk fuktad med PBS.
- Mekaniskt separera vävnader med en kolv i en 6-cm maträtt som innehåller 5 mL iskallt FACS buffert (PBS kompletteras med 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1 mM EDTA). Överföra de encelliga suspensionen till en 15 mL centrifugrör; Tvätta 6 cm skålen med ytterligare 2 mL FACS buffert och kombinera tvätten med cellsuspension samt.
- Centrifugera cellsuspensionen (300 x g, för 5 min vid 4 ° C) och Kassera supernatanten. Resuspendera pelleten med 2 mL av Ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringslösning buffert (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 och 0,1 mM Na2EDTA) för 1 min i rumstemperatur (RT) att lysera röda blodkroppar. Neutralisera ACK bufferten genom att lägga till 10 mL FACS buffert cellsuspension.
- Centrifugera cellsuspensionen (300 x g, för 5 min vid 4 ° C) och Kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 5 mL komplett RPMI medium (RPMI 1640 medium, kompletteras med 44 mM NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 1% MEM icke-essentiella aminosyror och 10% FBS).
- Filter cellsuspension genom en cell sil (por storlek 70 µm) ta bort cell klumpar. Räkna celler med en hemocytometer eller automatiserade cell räknare.
2. kvantifiering av mitokondrier och lysosomer
Obs: Utföra organell-specifika färgämnet färgning först eftersom det optimala färgning villkoret för dessa färgämnen är inkubation vid 37 ° C. Yta markör färgningen kan minskas avsevärt på grund av antikropp tak och internalisering vid denna temperatur.
- Lägg till 1 x 106 celler för att runda-botten FACS rör, Centrifugera celler (300 x g, för 5 min vid 4 ° C) och Kassera supernatanten.
- Späd ut sonden lager lösningarna till arbetande slutkoncentration (100 nM MitoTracker grön eller LysoTracker Green; hädanefter mitokondrierna - eller Lysosomen-specifika färga, respektive) i förväg värmde 37 ° C serumfritt odlingsmedium. Detta är en fungerande lösning för Lysosomen - eller mitokondrierna-specifika färgämne.
Obs: Testa flera koncentrationer inklusive spänna av arbetande koncentrationer föreslås av tillverkaren (20-200 nM för mitokondrierna-specifika färga) och 50-75 nM för Lysosomen-specifika färgämnet används här för att få den bästa färgning effektivitet. Välja en cell befolkning som är kända för att ha bra uttryck för färgning mål (t.ex. lysosomer) som positiv kontroll (t.ex. mänskliga CD14+ monocyter). Välj arbeta koncentrationen baserat på god separation mellan negativ och positiv färgning, samt bra cellernas viabilitet. - Återsuspendera cellerna i 100 µL av Lysosomen - eller mitokondrierna-specifika dye fungerande lösning och inkubera i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 15 min eller 30 min, respektive.
- Tillsätt 1 mL iskallt FACS buffert för att stoppa reaktionen. Pellet celler genom centrifugering (300 x g, för 5 min vid 4 ° C) och Kassera supernatanten. Cellerna är nu klara för surface markör färgning.
3. ytan markör färgning
- Blockera Fc receptorer med 100 µL av förtitrerad 2.4G2 Hybridomteknik supernatant på is för 10 min. Tvätta cellerna med 1 mL FACS buffert och centrifugera (300 x g, för 5 min vid 4 ° C). Kassera supernatanten.
- Inkubera cellerna med 50 µL förtitrerad fluorescens-konjugerad antikropp kombination i FACS buffert på is för 20 min. Undvik ljus.
Obs: Förbereda enstaka färg-färgade celler som inkluderar alla fluorescerande antikropparna som finns i antikroppen kombination och celler behandlas endast med organell-specifika färgämne för att ange spänning på varje fluorescens detektorn och ersättning justering på flödet cytometer. Jämväl, förbereda fluorescensen Minus en (FMO) som bakgrund kontroller med hjälp av celler som färgas med alla antikroppar, men utan färgning med organell-specifika färgämnen. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL FACS buffert och pellet genom centrifugering (300 x g, för 5 min vid 4 ° C). Kassera supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 300 µL av FACS buffert innehållande 1 µg/mL propidium jodid (PI) och omedelbart analysera proverna på flödescytometer.
4. provtagning på flödescytometer
- Slå på datorn, flödescytometer, FACS förvärv programvara och andra tillbehör enheter beroende på vilken maskin-plattform. Kör PBS för ca 1 min att säkerställa flödet linjen är fylld med PBS och slida buffert. Kontrollera flödet strömmen löper smidigt.
- Öppna nya experiment och välj cytometer parametrar (fluorescerande detektorer) enligt tillverkarens anvisning. Filtrera celler genom 70 µm cell sil och vortex före förvärvet av varje prov att undvika klumpar och doublet bildandet.
- Gör dot tomter framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC), som representerar Cellstorlek och kornighet, respektive. Optimera spänningar av FSC och SSC för att se till att cellerna av intresse visas i tomterna. Gör dot tomter FSC-A vs. FSC-W (eller FSC-H) och rita en utfärda utegångsförbud för de enstaka cellerna.
- Gör dot tomter varje fluorescerande parameter. Använd ofärgade celler att bestämma bakgrund signal och använda enda färg-färgade kontroller för att justera spänningar av varje fluorescerande parameter, så att positiva och negativa cellpopulationer är klart urskiljbara och inom det dynamiska omfånget av förvärvet.
- Efter alla spänningar är inställda, använda auto-ersättning om tillgängligt, eller manuellt justera ersättningen med ofärgade och enda färg-färgade kontroller att korrigera den spektrala spridningseffekter. Ersättning gälla prover.
- Gör en dot tomt varje parameter och utarbeta gates enligt din experimentell uppsättning. Till exempel FSC-A vs. FSC-H (eller FSC-W) att utesluta midjekort jacka, följt av FSC-A vs. SSC-A för lymfocyter gating; SSC-A vs. PI (levande celler) och CD4 vs. CD8 (figur 1).
- Samla tillräckligt händelser (totala cell nummer) för meningsfull jämförelse mellan populationer. Vanligtvis behöver minst 1000 händelser i befolkningen av intresse erhållas20.
- Efter alla prover är förvärvade, exportera flödesdata ska analyseras med flödescytometri mjukvara Flödesanalys. Spara experimentet som mall att bevara cytometer inställning och parametrar för att tillämpa liknande experiment i framtiden.
5. dataanalys
Obs: Det finns många verktyg för att analysera flödescytometrisk flödesdata, både kommersiella och gratis programvara. Programvaran förvärvet av den flöde cytometers kan också fungera för dataanalys. Här använde vi FlowJo som exempel.
- Starta programmet och dra FCS filer till arbetsytan. Klicka på ett prov att öppna grafiska fönster. Välj parametrar att presenteras på X och Y-axeln genom att klicka på X och Y-axeln. Använd verktygsfältet Rita gates enligt Differentiellt uttryckta markörer eller definierade fenotyper av cellpopulationer.
- Lägga till portar för varje parameter som visas i figur 1. Dra grindar till alla prover i arbetsytan så att de blir identiska gating.
- Dra tomterna till layout editor för att skapa grafiska rapporter.
- Visa medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI) för varje population av intresse genom att klicka på statistikknappen (Σ) i grafiska fönster och välja ”betyder” och lämplig parameter, till exempel den kanal som används för att upptäcka organell-specifika färgämne. Klicka på ”Lägg till”.
- Klicka på ikonen tabell redaktör och dra MFI till tabellen editor för att skapa statistikrapporter. Spara som Excel, Text eller CSV-fil för att beräkna delta MFI (ΔMFI) som MFI (organell-specifika färgämnen) - MFI (FMO).
Obs: Inte beräkna MFI mellan prover förvärvade med olika cytometer inställningar (spänningar, fluorescerande kanaler eller ersättning). Jämförelser av värden som härrör från experiment med olika inställningar är meningslös och partisk. - Exportera alla värden från arbetsytan och tomter från layout editor för att göra tabeller och figurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifiering av stora T-cell delmängder i mjälte och thymus
I korthet var enda cellsuspensioner från mjälte och thymus lyserat av röda blodkroppar, inkuberas med 2.4G2 supernatanten, följt av organell-specifika färgen och ytan markör färgning med fluorescens-konjugerade antikroppar (tabell 1). Den utvecklande progressionen av tymocyter kan beskrivas med hjälp av antikroppar till samtidig receptorer CD8 och CD4. De mest omogna tymocyter uttrycker inte CD4 eller CD8 och kallas dubbel negativ (DN). Sedan de uppreglera både CD4 och CD8 och blivit dubbel positiv (DP). Slutligen de ned-reglerar CD4 eller CD8 och bli mogen enda positiva (SP) celler redo att lämna orgeln. De tidigaste stadierna av T cell utveckling, när cellerna inte uttrycker samtidig receptorerna CD4 och CD8, kan ytterligare klassificeras på grundval av CD44 och CD25 uttryck. Tidigaste föräldraparets är CD44+ CD25– (DN1), och då de börjar uttrycka CD25 och bli CD44+CD25+ (DN2) celler. Efter att cellerna ner-reglera CD44 och bli CD44–CD25+ (DN3) celler och, slutligen, de ned-reglera CD25 samt att bli CD44–CD25– (DN4) celler som är på väg till uttrycker CD4 och CD8 och blir dubbel-positiv (DP) celler.
I mjälten, T-cellerna kan delas in i cytotoxiska CD8+ och helper CD4+ T celler. Båda dessa populationer kan delas in ytterligare naiva, effektor och minne undergrupper baserat på CD62L och CD44 färgning. Strategin detaljerad Usenets visas i figur 1.
Kvantifiering av mitokondrier massa olika T-cell grupper
Mitokondrierna-specifika färger användes för att mäta mängden mitokondrier i T-cells populationer. Vi hittade att mitokondriell innehållet var den lägsta i DN1, nådde DN2-DN3, och sedan något minskade i DN4 och DP tymocyter och ännu lägre i CD4 och CD8 SP tymocyter (figur 2A). CD4 eller CD8 SP tymocyter hade dock högre mitokondrier färgning MFI än mjälten CD4 eller CD8 T-celler (figur 2B). Dessa observationer tyder på att mitokondriell innehåll varierar under T cell utveckling med omogna tymocyter som innehåller fler mitokondrier än motsvarigheterna mogna, och de naiva T-celler som återcirkulera i syrerikt blod har ännu lägre mitokondriemassa. Intressant, denna minskning av mitokondriell innehållet var mer framträdande i CD8 än CD4 T härstamning (figur 2B), och T-cellsaktivering minskade ytterligare det. Bland aktiverade T-celler, CD4+ minne T celler hade något fler mitokondrier jämfört effektorer; men motsatsen var fallet för CD8+ T celler: CD8+ minne T celler hade den lägsta mitokondriemassa bland alla T-cell grupper (figur 2B).
Lysosomala innehåll mätning i olika subpopulationer av T-celler
Använda Lysosomen-specifika färgämne, observerat vi relativt låg, men påvisbar lysosomala innehållet i alla T-cells populationer, med mer framträdande närvaro av lysosomer i DN1 tymocyter (figur 3A). Ingen signifikant skillnad upptäcktes bland thymocyte delmängder från DN1 framåt. I periferin, ett relativt stort antal lysosomer hittades i minnet och effektor CD8+ T celler. Detta fenomen är i linje med tidigare studier som visar att aktiveras CD8+ T celler ökat deras uttryck av lysosomala-associerade membranprotein 1 (lampa-1)21,22, återspeglar deras besittning av lysosomala-cytotoxiska granulat (figur 3B)
Figur 1 : Gating strategi av mjälten lymfocyter och tymocyter. Cellerna var pre gated på FSC/SSC och PI– för att få levande undertröjor. (A) totala tymocyter från möss var fläckade av CD4, CD8, CD44 och CD25. CD4 och CD8 uttryck användes för att skilja CD4+CD8– SP, CD4–CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, och CD4–CD8– DN delmängder. CD4–CD8– DN delmängd delades ytterligare CD44+CD25– DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44–CD25+ DN3, och CD44–CD25– DN4 subpopulations. (B) Total splenocytes från möss var färgas med TCRβ, CD4, CD8, CD44 och CD62L. TCRβ+ cellerna avskildes till CD4+ och CD8+ T celler, som ytterligare var uppdelade i naiv (CD44–CD62L+), minne (CD44+CD62L+), och effektor (CD44+CD62L -) populationer. Resultaten är representativa för tre oberoende experiment med n = 3-4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa histogram som visar mitokondrier färgning i varje cell befolkningen. Cellerna var fläckade av mitokondrier-specifika färgämne under 15 minuter vid 37 ° c, följt av surface markör färgning. Fluorescerande signal av färgade celler förvärvades av flödescytometer och analyseras. (A) mitokondrier färgning av DN och DP tymocyter. (B) mitokondrier färgning av CD4SP och CD8SP tymocyter och mjälten T-cells populationer. ΔMFI = MFI (mitokondrierna färgning) - MFI (FMO). Den röda linjen representerar mitokondrier färgning, den heldragna blå linjen visar FMO kontroll, och streckad röd linje representerar medelvärdet fluorescensintensiteten hos mitokondrierna färgning i varje population. Resultaten är representativa för tre oberoende experiment med n = 3-4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa histogram som visar Lysosomen färgning i mjälten lymfocyter och tymocyter. Cellerna var målat med Lysosomen-specifika färgämne under 30 minuter vid 37 ° c, följt av surface markör färgning. Fluorescerande signal av färgade celler förvärvades av flödescytometer och analyseras. (A) Lysosomen färgning av DN och DP tymocyter. (B) Lysosomen färgning av CD4SP och CD8SP tymocyter och mjälten T-cells populationer. ΔMFI = MFI (Lysosomen färgning) - MFI (FMO). Den gröna linjen representerar Lysosomen färgning, den heldragna blå linjen visar FMO, och streckad röd linje representerar medelvärdet fluorescensintensiteten hos Lysosomen färgning i varje population. Resultaten är representativa för ett experiment med n = 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Multicolor flöde flödescytometri panel design. De fluorokrom och koncentrationen av antikroppar/organell färgämnen i färgning blandningar listas här. Det rekommenderas starkt att titrera och testa varje antikropp när du konfigurerar nya färgning paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll kombinerar organell-specifika färgämnen och ytan markör färgning för att kvantifiera mängden mitokondrier eller lysosomer i olika T-cells populationer. Denna metod utvecklades för att övervinna begränsning av cell nummer och homogenitet krav för traditionella metoder, såsom elektronmikroskopi och immunoblot analys. Det är särskilt användbart i analysera ovanlig cellpopulationer och samtidigt undersöka flera celltyper samtidigt.
Varaktigheten av förfarandet och temperaturen av inkubation är de mest kritiska faktorerna i detta protokoll. Rätt organell märkning kräver noggrann titrering av organell-specifika färgämnen. Cellerna bör också hållas strängt på is att förbättra lönsamheten och undvika antikropp tak och internalisering. Fluorescensen av dessa organell-specifika färgämnen är dessutom utsatta för ljus exponering och temperaturförändringar. Omedelbar analys av prover när färgningsproceduren är klar är därför mycket viktigt. Vi har konsekvent kunnat slutföra hela experimentet inom 2 timmar.
Eftersom protokollet bygger på förmåga att upptäcka multicolor fluorescens av flödescytometer att utvärdera intracellulära komponenter, förvärv inställningar (t.ex. PMT spänningar) och ersättning av spectra överlappar varandra (spridningseffekter av fluorescens i närliggande kanaler) kan kraftigt påverka intensiteten av signalen. Detta är särskilt relevant när de yta markörer som behövs för att identifiera de relevanta celltyper öka över sex. I denna situation blir erfarenhet av att designa multicolor flöde flödescytometri experiment mycket viktigt för högkvalitativa datainsamling.
Immunförsvaret skyddar kroppen från patogen förolämpningar och infektioner och T-cellsaktivering har central roll i att tillhandahålla viktiga signaler till andra immunceller. Nyligen genomförda studier föreslår att olika T-cells populationer har unika metabola program och mitokondrie och lysosomala innehållet är viktiga indikatorer på metabola förändringar. Detta fenomen är dock inte unikt för T-celler. Den differentiering och aktivering av innate immuna celler, såsom makrofager och dendritiska celler, är också nära kopplade till deras metaboliska status23,24. Fördelen med detta protokoll är att det kan anpassas att undersöka eventuella cellpopulationer av intresse med hjälp av antikroppar mot härstamning-specifika markörer. Dessutom i kombination med andra organell-specifika färgämnen, såsom ER - eller Cyto-ID, har den potential att utvärdera olika organeller eller cellulära fack i olika typer av celler.
Etableringen av denna mitokondrier eller Lysosomen kvantifiering metod är inte bara instrumental att studera metabolismen i T-celler, men också har stor potential att gynna forskning som fokuserar på metaboliska förändringar i sjukdomen inställningar, till exempel cancer eller autoimmuna sjukdomar25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Utvecklingen av detta protokoll stöds av bidrag från den Taiwan ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta) NSC103-2320-B-010-002-MY2 och MOST104-2628-B-010-002-MY4 till C.L. Hsu. C.W. Wei är mottagare av utmärkta avhandling Award av Institutet för mikrobiologi och immunologi, National Yang-Ming University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
