Summary
פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.
Abstract
בתרבית של קצב inspiratory מופק ברשת העצבית באזור של לשד בשם preBötzinger את מורכבות (ות ת), אשר מייצר אות נהיגה קצבית התכווצות של השרירים inspiratory. פעילות עצבית הקצבי שנוצר נכסים ובנין ונשאנו לבריכות עצביים אחרים לכונן שמערכת השרירים של הנשימה עשויים להילמד תוך שימוש בשיטות שונות, כולל en bloc עצב הקלטות, הקלטות פרוסה רוחבי. עם זאת, שיטות שפורסמו בעבר לא בהרחבה תיארו את תהליך ניתוח גזע המוח-השדרה באופן שקוף לשחזור עבור מחקרים עתידיים. כאן, אנו מציגים סקירה מקיפה של שיטה המשמשת reproducibly חותכים פרוסות גזע המוח בקצב אחיד-פעיל המכיל את המעגלים עצביים חיוני ומספיק עבור הפקת ושידור נסיעה inspiratory. עבודה זו מתבססת על פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה הקודם כדי להגביר את הסבירות של אמין קבלת פרוסות בקצב אחיד-פעיל ובר קיימא עבור הקלטה עצביים ופלט נכסים ובנין, הנוירונים premotor hypoglossal (נויטרופיל XII), ו hypoglossal מוטורי לגלוקוז (XII MN). העבודה הציגה ומרחיב על שיטות קודמות שפורסמו על-ידי מתן איורים מפורט, צעד אחר צעד של הקרע, מן החולדה כל גור, פרוסה במבחנה המכילה את rootlets XII.
Introduction
הרשת העצבית בדרכי הנשימה של גזע המוח מספק תחום פורייה להבנת מאפייניה של קצבי רשתות עצביות. בפרט, העניין הוא בפיתוח של מכרסם neonatal נושם והבנה איך מתפתח בקצב הנשימה. זה עשוי להיות נעשה שימוש בגישה מרובת רמות, כולל ויוו plethysmography כל בעלי חיים, אין ויטרו en bloc עצב הקלטות, במבחנה לחתוך הקלטות מכילות את הגנרטור קצב הנשימה. רדיוקציוניסטי בהקלטות חוץ גופית en הגוש ופרוסות הן שיטה יתרון לשימוש בעת חקירת המנגנון מאחורי rhythmogenesis הנשימה ואת המעגלים העצביים באזור גזע המוח-עמוד השדרה של פיתוח מכרסמים. מערכת הנשימה פיתוח כולל כ 40 סוגי תאים, המאופיינת על ידי ירי דפוס, כולל אלה של מרכז הנשימה1,2. לרשת מרכזי הנשימה כוללת קבוצה של נוירונים פעילים בקצב ממוקם לשד ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis הנשימה יונקים נוצר מן autorhythmic interneuron רשת כינו את preBötzinger מורכבים (ות ת), אשר היה מקומי השפעול דרך ההכנות הגוש פרוסה והן en של מידע יונקים neonatal גזע המוח-שדרתית חוטי3,4,5,6,7,8. אזור זה משמש פונקציה דומה סינוס-פרוזדור (SA) בלב ויוצרת מערכת תזמון inspiratory נסיעה נשימה. מ נכסים ובנין, הקצב inspiratory מתבצע באזורים אחרים של גזע המוח (כולל את הגרעין מנוע hypoglossal), בריכות מנוע בעמוד השדרה (כגון הנוירונים מנוע הסרעפת לנהוג הסרעפת)9.
פעילות אומנותית ניתן להשיג באמצעות גזע המוח חוט השדרה en הגוש ההכנות או פרוסות ממגוון רחב של אוכלוסיות תאים, כולל C3-C5 עצב rootlets, rootlets עצב XII, גרעין מנוע hypoglossal (XII MN), hypoglossal premotor נוירונים (נויטרופיל XII), ו נכסים ובנין3,10,11,12. בעוד אלה שיטות איסוף הנתונים היו הצלחה מעבר קומץ של מעבדות, רבים מן הפרוטוקולים לא מוצגים באופן שאינו לשחזור באופן מלא עבור חוקרים חדשים להזין את השדה. קבלת en קיימא ופעיל בקצב ההכנות הגוש ופרוסות דורש תשומת לב חדה לפרטים דרך כל השלבים של דיסקציה, פרוטוקול חיתוך פרוסה. הפרוטוקולים הקודמים בהרחבה לתאר את ההקלטה הליכים שונים, אלקטרופיזיולוגיה, עדיין מחסור פירוט בחלק הקריטי ביותר של קבלת הכנה מעשית רקמות: ביצוע ההליך חיתוך ופרוסות גזע המוח-השדרה.
קבלת ביעילות en בקצב אחיד-פעיל בר -קיימא הגוש או פרוסה הכנה גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה הקלטות דורש כי כל השלבים להתבצע כראוי, בזהירות ובמהירות (בדרך כלל, כל התהליך קשורים כאן יכול להיות הופיעה כ 30 דקות). נקודות קריטיות של פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה לא קודם לכן טוב שתוארו כוללים את הקרע של עצב rootlets, את ההליך עם פרוסות על vibratome. פרוטוקול זה הוא הראשון stepwise באופן חזותי את הקרע גזע המוח-השדרה עבור חוקרים חדשים והן מומחים בתחום. פרוטוקול זה מסביר באופן יסודי גם טכניקות ניתוחיות, ציוני דרך, הליכים אחרים כדי לסייע לחוקרים עתידיים ביצירת אחידות פרוסות והכנות en bloc להכיל את המעגלים המדויק הרצוי ניסוי. הגורים neonatal עכבר ועכבר יכולים לשמש ההליכים המובאים כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להלן כללי התנהגות מקובלים ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת לומה לינדה. הנחיות NIH יחס מוסרי לבעלי חיים הם בעקבותיו כל הניסויים שבוצעו במעבדה. כל סטנדרטים אתיים אושרו על ידי יחידים ביצוע פרוטוקול זה.
1. פתרונות
-
להכין מלאכותית לנוזל חוט השדרה (כלנית חדד).
- להכין טרי חנה המבר ערב קודם ניסוי בקבוצות 1 ליטר באמצעות הבאות המתכון: 7.250 g NaCl (124 מ מ), 0.224 גרם אשלגן כלורי (3 מ מ), g 2.100 NaHCO3 (25 מ מ), g 0.069 NaH2PO4 • H2O (0.5 מ מ), 0.247 g MgSO4 • 7 שעות2 O (1.0 מ מ), ו- 5.410 g D-גלוקוז (30 מ מ), 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 מ מ). תמיד להוסיף CaCl2 • 2 H2O אחרונה.
- להמיס את הרכיבים לתוך 1 ליטר של מים יונים. מערבבים למשך 20-30 דקות.
- למדוד את רמת החומציות של כלנית חדד ולהתאים את 7.40 ± 0.02 שימוש באמצעי אחסון קטן (בדרך כלל < 0.5 מ ל) של NaOH שתדללו, קו או HCl.
הערה: חנה המבר מוכן ניתן לאחסן במקרר (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02) שלושה ימים לפני התפתחות חיידקים משפיעה על יכולת הקיום של הרקמה במהלך ניסוי. השתמש 0.2 µm מסננים כדי לצמצם זיהום על ידי פטריה או חיידקים המצויים במעבדה מאז ניסויים יכולים להימשך עד 36 שעות. ליעילות, המתכון כלנית חדד תיאר ייתכן וניתן לשנותם 4 L אצוות בעקבות באותו הפרוטוקול, אמצעי אחסון זה יימשך עד שלושה ימים של ניסויים.
2. הכנת לנתיחה ושמא Vibratome
-
להגדיר את הלהב.
- השתמש סכיני טריים פיפיות עבור חיתוך רקמה על vibratome. לשטוף את הסכין עם 100% אתנול, לשטוף עם מים יונים לפני חיתוך או הצמדה הלהב לשניים, הוספת את הלהב לתוך ההרכבה להיסגר על vibratome.
- לשנות את הלהב בכל פעם הכנה רקמה חדשה, מותקן על vibratome שמגיע או אם זה מוריד מערך הניתוחים פרפין בזמן החיתוך. שאריות פרפין יעשה את זה כמעט בלתי אפשרי לחתוך נקיה רקמה עצבית neonatal.
-
כוונן לוח פרפין.
- השתמש בכל בנוסח הטבעה פרפין. מקום 10 גרם של הטמעת מדיה בתוך זכוכית חום-סובלנית והשתמש בחום נמוך כדי להמיס את החרוזים פרפין לנוזל.
- להוסיף כ- 0.5 גר' אבקת גרפיט, לערבב פתרון יסודי, בצורה אחידה לתוך פרפין נוזלי.
- להשתמש לוח פלסטיק קטן המצע פרפין. לחתוך חתיכה קטנה (0.5 - 1 ס מ עבה, כ 2 x 2 ס"מ2 רחב) של פלסטיק (פוליקרבונט או אלומיניום יכול לשמש גם). להשתמש בקובץ של מכונאי כדי לגרד חריצים לתוך הפלסטיק נצחית ובלתי מעורערת יבטיח כי הפרפין לאנאפוליס הפלסטיק.
הערה: לחלופין, השתמש מחט תת-עורית 18 גרם מחומם כדי למקם את החורים בזווית הגיליון כדי להבטיח כי התערובת פרפין-גרפיט לאנאפוליס הפלסטיק. - השתמשי באחורי המוליך עצה כותנה לטפטף את התערובת פרפין-גרפיט על הפלסטיק שוב ושוב טובלים את המוליך לתוך התערובת פרפין מותכת-גרפיט, מטפטפים את slurry אל הרחוב פלסטיק ועל בניית הפרפין-גרפיט כדי כ 1.5 ס מ עובי מעל הפלסטיק.
- ברגע שכבה עבה מספיק של המיקס פרפין-גרפיט הופקד על הרחוב, הגדר את גוש בצד מגניב, אז הצורה כדי להכיל את גזע המוח-השדרה.
3. ניתוח ובידוד של Neuraxis
- לבצע ניתוח ראשוני של ההרדמה.
הערה: חיות השתמשו במחקר זה עשויים לנוע בגודל מיום עובריים 18 (E18) ליום כמחנכת 10-20 עכברים או חולדות ועד היום כמחנכת E18 5/6. חולדות או עכברים מכל זן, טיפול, או מגדר עשוי לשמש, בהתאם לעיצוב הניסיונית. מבצעים הרדמה ניתוח ראשוני ברדס fume מאז איזופלוריין משמש (0.25 mL בתוך תא 25 מ ל).- שוקל הכלבלב, ואז למקם אותו חדר הרדמה המכיל 0.25 mL של איזופלוריין מונחת 2 x 2 ס מ2 פיסת גזה. לאחר החיה מגיע מטוס כירורגי של הרדמה (נבדק על ידי צביטה הבוהן עם אין רפלקס הנסיגה), סיכת החיה על צלחת פטרי מלא elastomer פרפין או סיליקון.
הערה: גם להיות מורדם neonatal מכרסמים באמצעות13,cryoanesthesia14, איזופלוריין אידוי15, או הזרקת16 מאוזנת עם חמצן. - במקום הצד הבטני בעלי חיים למטה ולעשות קו האמצע חתך של ממש מאחורי העיניים באזור המותני באמצע השדרה עם להב סכין מספר 10 או 11 או מספריים כירורגיים. לשקף את העור, decerebrate החיה ברמה של התפר הקודקודית/העורפית (ראה איור 1) ולהסיר את העור transecting החיה מתחת לסרעפת. ואז להסיר את הזרועות על ידי חיתוך המשותפת כתף עם מספריים או אזמל.
- לאחר הסרת העור, להעביר תא זלוף עם סיליקון elastomerin התחתון עבור עוד ניתוח והכנה של גזע המוח-השדרה החיה.
- בועה של מאגר כלנית חדד (בקבוק הצדדית 500 מ"ל) ברציפות עם צוננת (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02) חנה המבר ואת חמצן בתערובת של 95% O2 ו- 5% CO2 (נקרא גם"carbogen"). בזמן, השתמש חנה המבר צוננת לרוקן מעת לעת את התא, מתן חנה המבר מחומצן טריים לאורך בידוד של חוט השדרה-גזע המוח.
הערה: כדוריות דם אדומות ניתן לראות העורקים והוורידים הנותרים ואלה, כאשר מספיק חמצן, אדום בהיר. - השתמש זלוף זרימת הכבידה באמצעות צינורות של צימוד, כדי לסירוגין או ברציפות perfuse הרקמה עם חנה המבר מחומצן (בולוס נפח או באמצעות איטי טפטוף באמצעות של צימוד, כ 0.5 - 1.0 mL/min). זה מחמצן את הרקמה ושומר על שדה כירורגית ברור.
- הסרת עודפי נוזלים כנדרש על ידי מערכת סינון היניקה ואקום.
- לבצע את הקרע באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. מודל רציף זום הוא העדיף כדי לאפשר התאמת משובח של ההגדלה ולאפשר להדמיה אופטימלית של האזור עניין במהלך כל שלב של הקרע.
הערה: כלים למיקרו מומלץ לכלול מגוון של רקמות במיתולגיות מלקחיים מלקחיים בוטה, מלקחיים #5, רקמות בזווית מלקחיים, מגוון של מספריים לנתח מיקרו (מעיין מספריים), וחרק רגיל וסיכות לנתח מיקרו. - לחשוף את המוח דרך מקטע קו אמצע של הגולגולת לאורך התפר המשונן ואז לרתק את המדפים משתקף עם סיכות לנתח מיקרו ולהדק השדרה בסוף סימטרית בתחתית מצופה סיליקון לחדר ניתוח באמצעות 27 G מחט.
הערה: השאר הקרע דורש מיקרוסקופ לנתיחה לספק את התצוגה הברורה של רקמות, ציוני דרך להשתמש כדי להבטיח את הסבירות המרבית של קבלת פלט פיקטיבי קצבית את rootlets הגולגולת של גזע המוח, עמוד השדרה rootlets. בצע את השלבים הבאים של הקרע בעזרת מספריים האביב בינוני או מספריים איריס ומלקחיים בסדר.
- שוקל הכלבלב, ואז למקם אותו חדר הרדמה המכיל 0.25 mL של איזופלוריין מונחת 2 x 2 ס מ2 פיסת גזה. לאחר החיה מגיע מטוס כירורגי של הרדמה (נבדק על ידי צביטה הבוהן עם אין רפלקס הנסיגה), סיכת החיה על צלחת פטרי מלא elastomer פרפין או סיליקון.
- מיד העברת המטען מבודד של החיה חדר דיסקציה קצף. במקום הצד הגבי רקמות עם תום rostral (המוח) מול החלק הקדמי של החדר. להצמיד את הרקמה הכתפיים ובסוף הכי סימטרית של חוט השדרה.
- עושים חתך מאמצע-הווריד דרך הגולגולת בעקבות את התפר הקודקוד כדי למנוע נזק בקליפת המוח, גזע המוח שבבסיס הגולגולת.
הערה: רקמת העצם neonatal לא התקשחה באופן מלא, והוא מאוד שביר. לרקמת העצם/יהיה גמיש במידה, אבל קשה יותר החיבור שמסביב ואת רקמת השריר. - להשתמש במספריים באביב או איריס בינוני כדי לגזור את התפרים העורפית של הגולגולת, שמתחילים בהתפר המשונן ועבודה רוחבית. פעולה זו תיצור "כנפיים" של הגולגולת כי ייתכן משתקפת ויש המוצמדת לשורת לעגן את החלק rostral של הגולגולת, מספקים יציבות ברקמות (ראה איור 2א).
- לאחר המשקף את המדפים הגולגולת, לחתוך את שאר קליפת המוח, עוזב את סימטרית החלק של המוח הקטן (vermis) ללא פגע יחסית (איור 2B).
- עושים חתך מאמצע-הווריד דרך הגולגולת בעקבות את התפר הקודקוד כדי למנוע נזק בקליפת המוח, גזע המוח שבבסיס הגולגולת.
- לבצע laminectomy הגבי.
- הסר את מערכת השרירים המקיפים את הגולגולת ואת עמוד השדרה באמצעות מלקחיים ומספריים האביב מיקרו. הסרת רקמת לאורך הצד הגבי של כלוב הצלעות, עוזב את כלוב הצלעות ללא פגע, כפי שזה ניתן להצמיד מאוחר יותר לעגן את הרקמה במהלך laminectomy הגחון, למזער את הסיכוי של נזק לחוט השדרה.
- בזהירות לגזור משם תהליכי לרוחב סחוס בחוליות באמצעות מספריים האביב בינוני או מספריים איריס משובחים. לחתוך כל רקמות המכסים את פונס ו לשד. Vermis, המוח הקטן, פונס ו תחילתו של חוט השדרה עכשיו יהיה נראה בבירור (איור 2C).
- לבצע laminectomy הגחון.
- להנמיך את הצד הגבי רקמות ולהדק הצלעות ובסוף סימטרית ביותר של עמוד השדרה. להצמיד את הצד rostral של רקמת באמצעות המשק הגולגולת (איור 3א).
- הסר את החצי הגחון של כלוב הצלעות, עצם החזה כולל כל אברי הבטן בעזרת מלקחיים ומספריים באותו. לנתח משם רקמות רכות מחוברת קשת הצלעות לחשוף את הצלעות ועמוד השדרה (איור 3ב).
- הסר את הלשון, הוושט, קנה הנשימה, הגרון, כל אחרים רקמות רכות ואת השרירים המכסים בבסיס הגולגולת, עמוד השדרה (כפי שניתן לראות באיור 3C).
- לפרק רקמות המכסים על משטח קשה. לזהות בחך באיתור צלחת מלבנית של העצם בבסיס הגולגולת עם כניסה V-צורה על זה (איור 3ג'). חתך לאורך הקו האמצעי של החיך, בזהירות להרים את זה כלפי מעלה, ולבצע רוחבי לחתוך כדי להסיר אותו (איור 4א).
- מתחילים עם laminectomy הגחוני על-ידי הסרת שנבזזו חשיפת השטח הגחון של גזע המוח, חוט השדרה של צוואר הרחם החוליה הראשונה כדי כ בית החזה חוליה 7 (T7) כפי שניתן לראות באיור 4B.
- בשלב זה, rootlets הגחון יהיה גלוי. באמצעות ניתוח מיקרו קטן או מעיין מספריים, שמור על עצמך כדי. לעשות חתכים קרוב של סחוס, רחוק ממקור של שורשים-חוט השדרה ככל האפשר; הימנע מתיחה השורשים.
- חיתוך 5-10 מ מ לאורך צידי השדרה-שנבזזו. Not גזור קרוב מדי אל חוט השדרה או אל החוליות. שלב זה מאפשר הסרה של חוליות צוואר הרחם כדי לחשוף את חוט השדרה. הימנע לחתוך את rootlets.
- לגזור rootlets כ 20-25 מ מ (נשימה) לאורך עמוד השדרה (כ T7). במהלך הליך זה להימנע לחתוך לתוך חוט השדרה ולטפל על הקצוות של החוליות כפי שניתן לראות באיור 4C.
- הסר C1, C2, C3 על ידי הרמת קצה אחד של החוליות rostral ובזהירות החיתוך מקרוב מתחת לעצם. קרוב לעצם כי החתך, ככל rootlet. שימוש מכור או כפופות מלקחיים כדי לסייע להשגת אחיזה חזקה על כל חוליית הצוואר בעת ביצוע חתכים (איור 4C).
- לאחר לאורך הרצוי של חוט השדרה הוא מבודד, גזור מן בעמודה השדרה, לבצע חתך רוחבי כדי להסיר את חוט השדרה (איור 5א ואיור 5B).
- הסר הדורה.
הערה: מבודדים גזע המוח-השדרה יכול לשמש עבור הקלטה en bloc במבחנה כבר שתואר לעיל3,7. עם גזע המוח-השדרה להסיר את עמוד השדרה, יש להסיר את דורא כדי לספק גישה אופטימלית עבור אלקטרודות היניקה לבצע הקלטות מתוך החתך הגולגולת, עמוד השדרה rootles. בנוסף, ההסרה של השכבה הקשה של המוח מאפשר נקיה לחתוך את גזע המוח ולקבל פרוסות דקות בקצב פעיל עבור הקלטת במבחנה.- בזהירות pin מבודדים גזע המוח-השדרה בצידו הגבי רקמות למעלה כדי לאפשר גישה השכבה הקשה של המוח המקיפים את הגולגולת rootles (איור 5B). צריך להיות מיושם סיכות דרך השוליים הצדדיים של גזע המוח, rostral כדי rootlets השנים עשר.
- להסיר את השכבה הקשה של המוח מפני השטח הגבי של גזע המוח על ידי הרמת השכבה הקשה של המוח עם מלקחיים בסדר (#5) בקצה תחום הגבי של דורה, חצו מן הצד המדיאלי האורך של גזע המוח עם מספריים אביבי נאה. להיות זהירים כדי למנוע חיתוך לתוך גזע המוח עצמו. בעדינות להרים את כלי הדם מפני השטח גזע המוח וחותכים כדי למנוע מכשול של הלהב vibratome בעת חלוקתה לגזע המוח.
- בזהירות לנתח דורא מן ההיבטים המדיאלי, לרוחב של גזע המוח, וגם rootlets עצבי הגולגולת עוברים דרך השכבה הקשה של המוח בקלות נקרעים. משם בעת הסרת השכבה הקשה של המוח. לצמצם את הסבירות של rootlets להיות הוריד ידי בעדינות חיתוך סביבם במספריים מעיין קטן.
- להעיף את גזע המוח-השדרה כך (גחוני) פונה, rootlets הגולגולת הם נראים בבירור. לנתח את דורא מן הצד הגבי של גזע המוח על-ידי בעדינות הרמת השכבה הקשה של המוח ישירות מעל postrema באזור, גזירה מן rostral סימטרית. Postrema אזור יופיע ורוד מעט בשל המספר הגדול של microcapillaries מה קורה באזור.
- השתמש סיכה חרקים בסדר כדי לקנטר משם כל דורא הנותרים ולהסיר כלי הדם הנותרים בסמיכות rootlets הגולגולת ואת צוואר הרחם.
4. פרוסה פרוטוקול
- לאחר הסרת השכבה הקשה של המוח, מקום לגזע המוח במרכז של פלטפורמת פרפין על הבלוק פלסטיק (ןלהל הרחוב"חיתוך"). להצמיד הסוף סימטרית של גזע המוח דרך חוט השדרה דיסטלי באמצעות סיכות חרקים בסדר זה היה גזוז לא יותר מ 1 ס"מ אורך כמוצג באיור 5C.
- יישר לבלוק מכוסה פרפין חיתוך עם המוצמד לגזע המוח בהמחזיק בלוק vibratome כך הלהב חתכים בניצב את פניו rostral של גזע המוח.
- להפוך פרוסה הראשונית כדי להסיר את הרקמה לא אחידה, שאינם שייכים בקצה rostral ביותר. החתך הראשוני הזה יכול להיות 200-300 מיקרומטר בדרך כלל אבל בזהירות למנוע הסרה של rootlets הגולגולת התשיעי, X, ויב. שלב זה בדרך כלל תחשוף את היקף סימטרית לגרעין פנים (VII), את rootlets glossopharyngeal, מאפשרת ליישר את גזע המוח כך שהפנים שלה par-מישורי הלהב vibratome. לעשות שינויים קטנים לפי הצורך כדי להבטיח par-סבתא סורגת ולבצע חתכים קטנים כדי להסיר רקמות לא אחידה.
הערה: Rootlets Glossopharyngeal (IX) יהיה גלוי על קצה לרוחב של גזע המוח כפי אחד חותך כל פרוסה רצופים, אלה מספקות נקודת ציון המרחק rostro-סימטרית גזע המוח המעגלים העצביים הכרחי עבור קצב-דור. בצד הגחוני של גזע המוח, rootlets hypoglossal (XII) צריך גם להיות גלוי מעט סימטרית להתמודד לחתוך מציג את rootlets התשיעי. נקודת ציון סופי יהיה obex (נקודת במוח האנושי שבו הנוזלים הרביעי מצמצם להפוך התעלה המרכזית של חוט השדרה) על פני הגבי של גזע המוח. עם אלה שלוש נקודות התייחסות גלויה, שהמישור החותך הנכונה היא נוסדה (ראה איור 6א), פרוסה בקצב אחיד-פעיל ניתן להשיג באופן אמין. - המשך חיתוך rostral-כדי-סימטרית עד rootlets התשיעי נמצאים קרוב לפני השטח של הפנים לחתוך של גזע המוח.
- עיין באיור 6 לקבלת ציוני הדרך והכיוון הנכון. להתאים את המתים-הפרפין ב המלחציים vibratome כך הזווית הבא של חיתוך ליצור צורת "טריז" קלים מאוד כדי לחתוך הפרוסה חותכים פרוסות של 100-200 מיקרומטר עד ציוני הדרך המתוארת ניתן לראות בבירור (איור 6א).
הערה: חותכים טריז קלה זו מגדילה את מספר השנים עשר מוטורי לגלוקוז בשבי הפרוסה ומגדיל את הסיכוי של קבלת פעילות קצבית במהלך ההקלטה. באמצעות ציוני הדרך המתואר (rostral rootlets הצרור והלוע, rootlets מן הקיבוץ עצב, obex) יבטיח כי הפרוסה reproducibly מכיל לפחות חלק גדול נכסים ובנין (איור 6B). - לחתוך פרוסה מיקרומטר 300-500 של גזע המוח מ אלה סמנים neuroanatomical rostral כדי ללכוד את נכסים ובנין ומקושרת שידור המעגלים.
הערה: פרוסה "אידאלי" יכיל את rootlet ביותר rostral של הקיבוץ hypoglossal rootlet אמין לקבל פעילות inspiratory מבלי להזדקק הקלטות השטח באמצעות אלקטרודה היניקה של מעל קצב יצירת/משדר לוקוסים בתוך גזע המוח.
5. הקלטה נהלים
- הצב את הפרוסה בחדר ההקלטה, perfuse ללא הרף עם כלנית חדד (0.5 - 1.0 mL/min) והשתמש אלקטרודות יניקה או חוץ-תאית לפעילות האוכלוסייה הרשומה את rootlets XII או נכסים ובנין, יב PMNs, או XII motoneurons. להליכי הקלטה מפורטת, לראות פרסומים קודמים על גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה, תיקון10,clamping11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המוצגת כאן מאפשר חוקר מעוניינת לקבל פרוסות פעיל בקצב של גזע המוח reproducibly ובאמינות חותך קיימא, חסון, שיאפשר הקלטה של פלט מנוע פיקטיבי במשך שעות רבות. כל הרכיבים מעגלים עצביים מינימלית הכרחי עבור הפקת ושידור קצב inspiratory ניתן ללכוד פרוסה דק בשיטה זו. רכיבים אלה כוללים: preBötzinger את המתחם, הנוירונים premotor מבליט את הנוירונים מנוע hypoglossal (pXII MNs) נוירונים מוטוריים hypoglossal (XII MNs) לבין עצב rootlets. נכסים ובנין, XIIn ו- C4 עצב rootlets משמשות עבור קצב inspiratory הקלטות, כמופיע באיור איור7.
שימוש מוצלח של הליך זה יהיה לייצר הכנה הגוש en קיימא ופעיל בקצב של 10-15 דקות, או פרוסה בקצב אחיד-פעיל ב- < 30 דקות. לאחר בידוד של חוט השדרה-גזע המוח en bloc או פרוסה דק, 15 דקות של equilibration בבית הבליעה הקלטה מספיקה להפקת פלט מנוע פיקטיבי. במקרה של הפרוסה, הגדלת את חוץ-תאית [K +] עד בערך 8-9 מ מ יהיה לייצר נסיעה עצבית חזקה שיכולה להימשך 24 עד 36 h בחוויה של המעבדה הזו. הכנת צריך להיות ללא הרף superfused עם carbogenated (95% או2/5% CO2), חנה המבר מחוממת (~ 27 ° C). מוצלח והניתוחים מתבצעים במהירות ולהימנע צובט, מתיחה או נזק עצבי rootlets המשמש עבור הקלטות. לקבלת תוצאות מיטביות, כל השלבים בהליך מבוצעות במהירות, הרקמה חייב להיות שטוף או ברציפות perfused עם carbogenated חנה המבר כשמבצעים דיסקציה ובידוד רקמות (כמתואר לעיל). לפרטים מקיף בנוגע נוירואנטומיה של אטלסים מדויק של גזע המוח, נא לראות את עבודתו של13,et al. Ruangkittisakul14, Ballanyi15 ועמיתים. פרוטוקול המוצג כאן הוא שיטה אחת הוכיחה אמין במעבדה של המחבר, דוח זה מספק שיטה גרפית, שלב אחר שלב ליצירת פרוסות אלה הסתמכות רק על גלוי על גזע המוח או בתוך השטח ציוני גזע המוח כמו מפורט כאן.
איור 1 : Îàé לנתיחה על החילוץ גזע המוח-השדרה. (א) Anesthetized pup ריתקו לנתיחה. קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות החתך הסאגיטלי לתוך העור וחותך רוחבי סימטרית לעיניים ומתחת לסרעפת. (B) מדריך להסרת העור, forelimbs מן החי. (ג) ההיבט הגבי של מכרסם עור. קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות הגולגולת-דש "צדפה" חשיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שלבי laminectomy הגבי. (א) קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות הסרת המוח הגדול. תוצאה (B) לאחר הסרת רקמות. קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות laminectomy הגבי. (ג) חשופים גזע המוח-שדרתית כבל בעקבות laminectomy הגבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : שלבי ניתוח הגחון הראשונית- (א) בצד הגחוני של מכרסם עור עם הקדמי קטועה והבטן. קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות הסרה התהליך xyphoid ופתיחת הצלעות לאחר מכן להסיר את אברי חלל הבטן ואת בית החזה. אברי חלל הבטן, החזה (B) הוסרו. (ג) מבנים הלוע התחתון הוסר. קווים מקווקווים מציינים את החתך הנחיות להסרת בחך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : שלבי הגחון laminectomy. (א) בחך, נותרו חלקים הגולגולת הוסר. החתך הנחיות מציינות כיצד להסיר את הרקמה הנותרת המקיפים את גזע המוח-השדרה. (B) הראשון חוליית הצוואר (C1) חשוף. (ג) הפגנה על הרמת C1, ביצוע חתך רוחבי הגוף בחוליות כדי להסיר אותו. העצבים הם לחתוך בזהירות סומק בצד הגבי של הגוף בחוליות לפני הסרתו. זהו השלב הקריטי ביותר הקרע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : הכנה של גזע המוח-השדרה שמגיע. (א) C1-C3 להסיר מן השדרה. החתך הנחיות לציין היכן לנתק את חוט השדרה של גזע המוח-של חוט השדרה סימטרית. (B) בצד הגחוני של גזע המוח-השדרה עם עצב שכותרתו rootlets. החתך הנחיות מציינים חיתוך מומלצים או נותרו מבנים rostral ב פונטו מדולרי לפני הקלטה באזור גזע המוח-השדרה. (ג) פרפין סלאב ההתקנה שמגיע על vibratome. האזור עם פרוסות כולל רקמות בין הגולגולת עצבים IX ו XII. אין למקם מיקרו-פינס לאזור עם פרוסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ציוני דרך המשמש להשגת פרוסות עם שלם גרעין מנוע hypoglossal, מתחם PreBötzinger- (א) נוף רוחבי של גזע המוח-השדרה לאחר חתך ראשוני שבוצע rostral כדי rootlets glossopharyngeal (IX). החתך מנחה מציין רמת חיתוך פשוט סימטרית rootlets (XII) hypoglossal. (B) כיוון של פרפין הבלוק כדי להב לפני חיתוך פרוסה המכילה את נכסים ובנין, גרעין מנוע hypoglossal. יצירת חתך צורה הבסיסי "טריז" הגדלת הסבירות של לכידת מספיק נוירונים inspiratory בתוך הפרוסה להשיג פעילות קצבית במהלך ההקלטה. התבנית תכלול את נכסים ובנין, הנוירונים premotor hypoglossal ו hypoglossal מוטורי לגלוקוז, אשר באופן קולקטיבי לספק את המעגלים הנחוצים כדי לשדר כונן קצבית, אשר הוא אינדקס של הנשימה rhythmogenesis. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : הקלטות נציג ההכנות הגוש או פרוסה en- (א) מעקב משולב של XII rootlet. (B) מעקב משולב של נכסים ובנין. הקלטה מ נכסים ובנין באמצעות הכנה הגוש של en ידרוש מלחציים תיקון עיוור. (ג) מעקב משולב מ rootlet עצב C4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התאמת הפרוטוקול המוצגים כאן לתוך הגוש en או פרוסה זרימת העבודה היא יתרון עבור מעבדות ולחתוך מחקרים כי הייתי רוצה לנצל גם en bloc גזע המוח-השדרה ו/או דק ההכנות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה. שיטת חיתוך ופרוסות שהוצגו, בשילוב עם שיטות דיווח בעבר על-ידי אחרים17,18,19, יאפשר לשחזור הכנת רקמות חזקים בר -קיימא שניתן לסגלה נרחב מגוון ניסויים באמצעות hindbrain מכרסמים או חוט השדרה. . הקרע הציג מאוד מפורט, כולל laminectomy הגבי ו הגחון, כמו גם פרטים רבים לגבי הכיוון של גזע המוח-השדרה בעת הכנת לחתוך פרוסות. פרוטוקול חיתוך ופרוסות מפורט שהוצג מאפשר החוקר לכלול כל המעגלים הנחוצים כדי להפוך את הדור שידור של קצב inspiratory. הראשי עצבית האוכלוסיות/המבנים כי ניתן ללכוד בשיטה זו כוללים: הנוירונים premotor hypoglossal את הגרעין מנוע hypoglossal, את preBötzinger מורכבים. הערה כי אזורים של גזע המוח מכילות המרכזית CO2 חיישנים או expiratory קצב יצירת מעגלים (RTN/pFRG) אינם נכללים ההכנה מפורטת כאן20,21. ברגע en הגוש הכנה או פרוסה התקבל, פעילות אומנותית ניתן להשיג באמצעות אלקטרודות היניקה, אלקטרודות שטח או תא בודד הקלטה שיטות כמו יחידת חוץ-תאית או מחבר תיקון-חובק למעקה שיטות3,10 ,11.
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה ברורה, easy-to-בצע ליצירת גזע המוח-השדרה הכנה או פרוסה דק, בקצב אחיד-פעיל. פרוטוקול זה צריך להיות חשוב לחוקרים מנוסים וגם חדשים מעוניינים בעזרתם ההכנות גזע המוח אומנותית/פרוסה ב armamentarium שלהם, שכן ישנם מספר שלבים קריטיים מפורט בתוך ההליכים המקלות על לכידתו של פרוסות פעיל בקצב אחיד, לשחזור, ועמיד לאורך זמן.
ברגע החוקר הפך נוח עם זיהוי של ציוני הדרך אנטומי ואת המיומנויות הדרושות לנתיחה, המהירות של הקרע יגדל, ניתן למטב את ההליכים עבור כל חוקר בודדים. פרוטוקול מפורט כאן לימדו אותי המחבר (CGW) במהלך עבודתו פוסט דוקטורט עם ג'פרי סמית, היוזם של גזע המוח קצבית פרוסה הכנה3. כדי להבטיח פעילות קצבית של הכדאיות ' פרוסות ' והן en הגוש ההכנות, כל ההליכים ליצירת פרוסה להסתיים בתוך כ 30 דקות מתחילתו של ההליך לפרוסה בתא ההקלטה. עם רציף זלוף, יש מעט מאוד השפעה על רקמות הכדאיות אבל מזעור זמן לנתיחה מאפשר הקלטה ארוך יותר של הנתונים. ללימודים בדרכי הנשימה, פרוסה רזה כמו מיקרומטר כ 280 עבה3 יהיה פעילות inspiratory אומנותית, חזקים, אבל פרוסות עשויים לנוע עד 550 מיקרומטר17,18,19,22. תרגול זהירות נדרשת כדי לפתח את הכישורים הדרושים כדי לבצע הליך זה ולצמצם את מידת ההשתנות עובי, עמדה rostral-סימטרית של כל פרוסה. הכללה ואי -הכללה אוכלוסיות תאים מסוימים ישפיעו על איכות ועמידות של פעילות קצבית להשיג הקלטה מאוחר יותר כמו גרעינים סינאפסות והן מעכבות ב לגזע המוח יכול להשפיע "איכות" הקצב הקליטה של הפרוסה 3.
לבסוף, חשוב גם את חנה המבר מוכן בדיוק לפי פרוטוקול, והיא ברמה20, טמפרטורה, חמצון pH סטנדרטית. ההכנות אנאוקסיים לא יהיה פעיל בקצב וישפיע על איסוף נתונים21.
ישנם מספר שלבים מרכזיים בהליך להקל על לכידת חוקר של ההכנות קיימא ופעיל בקצב אחיד. במהלך laminectomy הגחון, לשמור על כלוב הצלעות הגבי שלמים מאפשר תנופה. נוספת ומספק יותר רקמות לאבטחת ההכנה בעת ביצוע הבידוד עדין יחסית של חוט השדרה-גזע המוח מ עמוד השדרה. ניתן להשמיט את הקרע שלבים מפורטים כאן לאפשר החוקר בקלות לייצר ההכנות הגוש en או פרוסות דק, כך, לפי הצורך, הם צעדים נוספים מפורט זה להשיג רק פרוסה דק. טיפים שימושיים נוספים כוללים, בעת ביצוע laminectomy על הגחון, חשוב להשיג אחיזה חזקה על הגוף בחוליות להרים אותה כלפי מעלה תוך ניתוק של העצב rootlets. לאחר גזע המוח-השדרה גזור, חילוץ, הדורה, להערכת הנותרים חייב להיות גזור את פני השטח של רקמה עצבית. כלי הדם דורא קשים ואני יכול למנוע את הלהב vibratome חיתוך פרוסה נקי. דיסקציה של דורה לא חיוני לשם הכנת הגוש en, אך מומלץ למטב את העצב-שאיבה אלקטרודה צימוד. לבסוף, זהיר ושיטתי לתרגול בשימוש של vibratome הוא הכרחי עבור חיתוך פרוסה נקי, לשחזור. פרוטוקול זה מספק רשימה מאוד מקיף של שלבים מפורטים הקרע ונהלים חיתוך. הדגש כאן הוא לספק רשימה מפורטת צעד אחר צעד עבור חוקר להשתמש קרן אמין, כלי הדרכה שממנו הם יכולים לשנות הנהלים של המעבדה שלהם לפי הצורך.
בכללותה, מתודולוגיה זו מייצג של שלושים שנות התפתחות שיטות אלקטרופיזיולוגיה במבחנה. הטווח של מאמר זה מתמקד סטנדרטיזציה של en bloc ולחתוך הקלטות גזע המוח-השדרה המשמשות בדרך כלל לימוד פעילות inspiratory P0-P5 חולדות ועכברים22. עם זאת, תהליך זה דיסקציה היכולה לשמש במגוון של גדלים בעלי חיים, הגילאים מינים עבור מגוון רחב של מחקרים, כולל E18 חולדות/עכברים, חולדות neonatal, עכברים (כמחנכת ימים 0 עד 6) של עכברים בוגרים. מחקרים עתידיים עשויים להשתמש בשיטות הציג להחדיר הפרוטוקולים בכל המינים והגילאים, המאפשר לימודים לחקור מנגנונים דור קצב או אחר תהליך פיזיולוגי בין המינים והגילאים. בסופו של דבר, שינוי כיוון, עובי, או מיקום של הפרוסה או en bloc הכנה ישפיע הדבר על פעילות קצבית23. ספרות נרחבת שפורסמה בעבר לגבי האוכלוסיות עצבית שנתפסו על ידי פרוסה נהלים ויש עכברוש stereotaxic העכבר אטלסים זמין בכדי לספק יותר פרטים הנוגעים את המעגלים העצביים שנדונו כאן24, 25,26. ההליכים המובאים כאן לספק פירוט נרחב עם איורים ברורים לאפשר חוקר חדש ללמוד חותכים פרוסות קצבית מן ציוני דרך גלויות תחת מעבדה לנתח היקף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
S.B.P הוא אחד מנמעני לומה לינדה אוניברסיטת קיץ לתואר ראשון מחקר לאגודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
