Summary
Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.
Abstract
Mamífero ritmo inspiratorio se genera de una red neuronal en una región de la médula llamada la preBötzinger complejo (pBC), que produce una señal que conduce a la contracción rítmica de los músculos inspiratorios. Actividad neuronal rítmica generada en el pBC y llevado a otras piscinas neuronales a la musculatura de la respiración puede ser estudiada mediante varios enfoques, incluyendo en bloque del nervio grabaciones y grabaciones de corte transversal en coche. Sin embargo, métodos previamente publicados no han descrito el proceso de disección de la médula espinal tronco encefálico extensivamente de manera transparente y reproducible para futuros estudios. Aquí, presentamos una visión completa de un método reproducible Cortar rodajas rítmicamente activa del médula oblonga que contiene los circuitos neuronales necesarios y suficientes para generar y transmitir la impulsión inspiratoria. Este trabajo se basa en protocolos anteriores de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico para aumentar la probabilidad de obtener confiablemente sectores viables y rítmicamente activa para grabación salida neuronal de la pBC, neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y neuronas motoras hipoglosos (XII MN). El trabajo presentado se expande sobre los métodos publicados anteriores proporcionando ilustraciones detalladas, paso a paso de la disección, de crías de rata entera, cortar en vitro con las raicillas XII.
Introduction
La red neuronal respiratoria del médula oblonga proporciona un dominio fértil para entender las características generales de las redes neuronales rítmicas. En particular, el interés es en el desarrollo de roedores neonatales respirar y entender cómo se desarrolla el ritmo de la respiración. Esto puede ser hecho usando un acercamiento de niveles múltiples, incluidas en la pletismografía todo animal vivo, in vitro en bloque del nervio grabaciones e in vitro cortar grabaciones que contienen el generador de ritmo de respiración. Reduccionista en vitro en bloque y rebanar las grabaciones son un método ventajoso utilizar al interrogar los mecanismos detrás de rhythmogenesis respiratoria y los circuitos neuronales en la región de la médula espinal tronco encefálico de desarrollo de roedores. El sistema respiratorio en desarrollo incluye aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por el disparo de patrón, los del centro respiratorio1,2incluidos. La red respiratoria central incluye un grupo de rítmicamente activas neuronas localizadas en la médula ventrolateral rostral1,3. Mamíferos rhythmogenesis respiratorio se genera de un autorhythmic interneurona red apodado el complejo preBötzinger (pBC), que ha sido localizada experimentalmente mediante preparaciones de rebanada y en bloque de mamíferos neonatal tronco encefálico espinal cordones3,4,5,6,7,8. Esta región sirve una función similar a la del nódulo sinoauricular (SA) en el corazón y genera un sistema de tiempo inspiratorio para respiración de la unidad. De la pBC, el ritmo inspiratorio es llevado a otras regiones de la médula oblonga (incluyendo el núcleo hipogloso motor) y piscinas de motor espinal (por ejemplo, las neuronas motoras frénicas que impulsan el diafragma)9.
Actividad rítmica puede obtenerse utilizando preparaciones de médula oblonga médula espinal en bloque o rebanadas de una variedad de poblaciones celulares, incluyendo raicillas del nervio de C3-C5, raicillas de nervio XII, núcleo motor hipogloso (XII MN), neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y el pBC3,10,11,12. Mientras que estos métodos de recogida de datos han tenido éxito a través de un puñado de laboratorios, muchos de los protocolos no se presentan de una manera que es totalmente reproducible para nuevos investigadores entrar en el campo. Viable y rítmicamente activa en la obtención de preparaciones y rebanada requiere una aguda atención al detalle a través de todos los pasos de la disección y el protocolo de corte de rebanada. Protocolos anteriores ampliamente describir los diversos procedimientos de grabación y electrofisiología, sin embargo, carecen de detalle en la parte más crítica de la obtención de una preparación de tejido viable: realizar el procedimiento de disección y corte de médula espinal tronco encefálico.
Eficiente la obtención de una preparación de bloque o rebanada de rítmicamente activa y viable en grabaciones de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico requiere realizar todos los pasos correctamente, con cuidado y rápidamente (por lo general, todo el procedimiento relacionado aquí, puede ser realizado en aproximadamente 30 min). Puntos críticos del Protocolo de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico que no han sido previamente bien descritos incluyen la disección de las raicillas del nervio y el procedimiento de corte en el vibratome. Este protocolo es el primero que paso a paso comunicar visualmente la disección de la médula espinal tronco encefálico para nuevos investigadores y expertos en la materia. Este protocolo explica también muy bien las técnicas quirúrgicas, hitos y otros procedimientos para ayudar a futuros investigadores en estandarización de cortes y preparaciones en bloque para contener el circuito exacto deseado en cada experimento. Los procedimientos aquí presentados pueden usarse en cachorros neonatales de rata y ratón.
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Protocol
El siguiente protocolo ha sido aceptado y aprobado por la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Loma Linda. Se siguen pautas de NIH para el tratamiento ético de animales en todos los experimentos con animales realizados en el laboratorio. Todos los estándares éticos fueron confirmados por personas realizar este protocolo.
1. las soluciones
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Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF).
- Preparar la aCSF fresco por la noche antes de un experimento en lotes de 1 L con la siguiente receta: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0,247 g de MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM) y g 5,410 D-glucosa (30 mM), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 mM). Siempre añadir CaCl2 • 2 H2O último.
- Disolver los componentes en 1 L de agua desionizada. Agitar durante 20-30 min.
- Medir el pH de la aCSF y ajustar a 7,40 ± 0.02 con pequeños volúmenes (típicamente < 0,5 mL) de NaOH, KOH o ácido clorhídrico diluido.
Nota: ACSF preparado puede ser almacenado en el refrigerador (4 ° C, pH 7,40 ± 0.02) tres días antes de que crecimiento bacteriano afecta la viabilidad del tejido durante un experimento. Utilizar 0,2 μm filtros para reducir la contaminación por hongos y bacterias presentes en el laboratorio ya que los experimentos pueden durar hasta 36 h. Para la eficacia, la receta de la aCSF descrita puede ampliarse a 4 L lotes siguiendo el mismo protocolo y este volumen tendrá una duración de hasta tres días de experimentos.
2. preparación de la disección y la plataforma de Vibratome
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Configurar hoja.
- Utilice una hojas de afeitar de doble filo fresco para el tejido en un vibratome corte. Lave la lámina con 100% de etanol y aclare con agua desionizada antes de corte o ajuste de la hoja por la mitad e Inserte la segueta en el montaje de la abrazadera en el vibratome.
- Cambiar la cuchilla cada vez que una nueva preparación de tejido se monta en el vibratome para rebanar o si corta de la losa de la parafina mientras corte. Cualquier residuo de la parafina hará casi imposible cortar limpiamente a través de tejido neural neonatal.
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Configurar placa de cera de parafina.
- Utilice la cera de parafina de cualquier estilo de incrustación. Coloque 10 g de medio de inclusión en un vaso de vidrio tolerantes al calor y utilizar fuego para derretir las perlas de cera de parafina líquido.
- Agregar aproximadamente 0,5 g de grafito en polvo y solución de la mezcla minuciosa y uniformemente en la parafina líquida.
- Utilice una pequeña losa de plástico como el substrato para la parafina. Corte una pieza pequeña (0.5 - 1 cm de espesor y aproximadamente 2 x 2 cm2 amplia) de plástico (policarbonato o aluminio puede también ser utilizado). Usar archivo de maquinista a rasguños surcos en el plástico asthis se asegurará de que la parafina se adhiere al plástico.
Nota: Alternativamente, utilizar una aguja de hipodérmica 18 G climatizada para hacer agujeros de ángulo en la hoja para asegurar que la mezcla de parafina y grafito se adhiere al plástico. - Use la parte posterior de un aplicador de punta de algodón para la mezcla de parafina y grafito en el plástico del goteo por repetidamente sumergir el aplicador en la mezcla de grafito de parafina fundida, chorreando la mezcla sobre los bloques y la construcción del grafito de parafina a aproximadamente 1,5 cm de espesor en la parte superior del plástico.
- Una vez que se deposita una capa suficientemente gruesa de la mezcla de parafina y grafito sobre el bloque, establecer el bloque a un lado para enfriar y luego la forma para dar cabida a la médula espinal de la médula oblonga.
3. disección y aislamiento de los Neuraxis
- Realizar disección inicial y anestesia.
Nota: animales utilizados en este estudio varían en tamaño desde embrionario día 18 (E18) a día postnatal 10-20 en ratones o ratas que van de E18 a día postnatal 5/6. Ratas o ratones de cepa, tratamiento o género pueden utilizarse, dependiendo del diseño experimental. Realizar anestesia y disección preliminar bajo una campana de humos ya que el isoflurano se utiliza (0,25 mL en una cámara de 25 mL).- Pesar el cachorro y luego colocarlo en una cámara de anestesia que contenga 0.25 mL de isoflurano a un 2 x 2 pulgadas2 trozo de Gasa. Después de que el animal alcance un plano quirúrgico de anestesia (verificado por el pellizco del dedo del pie con ningún reflejo de retirada), pin el animal en una caja Petri lleno de parafina o silicona elastómero.
Nota: Roedores neonatales también pueden anestesiar por crioanestesia13,14, isoflurano vaporización15, o inyección16 equilibrado con oxígeno. - Coloque el lado ventral del animal hacia abajo y hacer una incisión de línea media por detrás de los ojos a la región lumbar media de la columna vertebral con una hoja de bisturí número 10 o 11 o tijeras quirúrgicas. Reflejar la piel y el animal a nivel de la sutura parietal/occipital de descerebración (ver figura 1) y quite la piel transecting el animal debajo del diafragma. Luego quite los brazos por el corte en la articulación del hombro con unas tijeras o un bisturí.
- Una vez que se quita la piel, traslado del animal a una cámara de perfusión con silicona elastomerin la parte inferior para mayor disección y preparación de la médula espinal de la médula oblonga.
- Un depósito de la aCSF (botella de 500 mL puerto lateral) de la burbuja continuamente refrigerada (4 ° c, pH 7,40 ± 0.02) aCSF y oxigeno con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2 (también llamado "carbogen"). Durante la disección, utilice aCSF refrigerado para limpiar periódicamente la cámara, proporcionando aCSF oxigenada fresca en todo aislamiento de la médula espinal de la médula oblonga.
Nota: Células de sangre rojas puede verse en las restantes arterias y venas y, cuando suficientemente oxigenada, estas son de color rojo brillante. - Utilizar perfusión de flujo por gravedad vía tubería y una llave de paso, que intermitentemente o continuamente inundar el tejido con la aCSF oxigenada (bolo volumen o a través de lento goteo usando una llave de paso, aproximadamente 0.5 - 1.0 mL/min). Esto oxigena el tejido y mantiene un campo quirúrgico claro.
- Eliminar exceso de líquidos según sea necesario por el sistema de filtración de aspiración vacío.
- Realizar la disección utilizando un microscopio de disección. Es preferible un modelo de zoom continuo permite ajuste fino de aumento y permitir una visualización óptima de la región de interés durante cada paso de la disección.
Nota: Herramientas de microcirugía recomendadas incluyen una gama de dientes tejido pinzas, fórceps romos, #5 pinzas, pinzas de ángulo del tejido, una gama de tijeras micro disección (tijeras del resorte) y regular insectos y micro disección de alfileres. - Exponer la sección del cerebro a través de línea media del cráneo a lo largo de la sutura sagital, pasador aletas reflejada con micro disección de alfileres y la columna vertebral del perno en el extremo caudal en la parte inferior cubierta de silicona de la sala de disección utilizando 27 G aguja.
Nota: El resto de la disección requiere un microscopio de disección para proporcionar la visión más clara de los tejidos y lugares utilizados para asegurar la máxima probabilidad de obtener salida fictive rítmico en las raicillas craneales del tronco encefálico y espinales raicillas. Realice estos pasos de la disección con tijeras resorte mediano o iris tijeras y pinzas finas.
- Pesar el cachorro y luego colocarlo en una cámara de anestesia que contenga 0.25 mL de isoflurano a un 2 x 2 pulgadas2 trozo de Gasa. Después de que el animal alcance un plano quirúrgico de anestesia (verificado por el pellizco del dedo del pie con ningún reflejo de retirada), pin el animal en una caja Petri lleno de parafina o silicona elastómero.
- Inmediatamente transferir el tronco aislado del animal a una sala de disección aireado. Coloque el lado dorsal de tejido hacia arriba con el extremo rostral (cerebro) hacia la parte delantera de la cámara. Pin el tejido en los hombros y el extremo más caudal de la médula espinal.
- Haga una incisión sagital a través del cráneo tras la sutura parietal para evitar dañar la corteza y tronco cerebral subyacente del cráneo.
Nota: Tejido óseo neonatal no está completamente calcificada y es muy frágil. Tejido óseo será flexible a un grado, pero más dura que el conectivo circundante y el tejido muscular. - Utilice tijeras resorte o diafragma medio cortar las suturas occipitales del cráneo, comenzando por la sutura sagital y lateral. Esto creará las "aletas" del cráneo que puede ser reflejado y cubrió para anclar la parte rostral del cráneo y dar cierta estabilidad al tejido (véase la figura 2A).
- Después de reflexionar las aletas del cráneo, cortadas el resto de la corteza cerebral, dejando la porción caudal del cerebelo (vermis) relativamente intacto (figura 2B).
- Haga una incisión sagital a través del cráneo tras la sutura parietal para evitar dañar la corteza y tronco cerebral subyacente del cráneo.
- Realizar laminectomía dorsal.
- Quitar la musculatura que rodea el cráneo y la columna vertebral utilizando pinzas y tijeras resorte micro. Remover el tejido a lo largo del lado dorsal de la caja torácica, dejando la caja torácica intacta, como esto se cubrió más adelante para anclar el tejido durante la laminectomía ventral, minimizando las posibilidades de daños a la médula espinal.
- Recorte cuidadosamente a los procesos laterales de las láminas vertebrales utilizando tijeras resorte mediano o fino iris tijeras. Corte cualquier tejido que cubre el puente de Varolio y la médula. El vermis cerebelo, puente de Varolio y comienzo de la médula espinal ahora será claramente visible (figura 2C).
- Realizar laminectomía ventral.
- Baje el lado dorsal de tejido y la clavija en la caja torácica y el extremo más caudal de la espina dorsal. Precisar la parte rostral del tejido con las solapas de cráneo (figura 3A).
- Quite la mitad ventral de las costillas, el esternón como todos los órganos abdominales con la misma tijera y pinzas. Disecar tejidos blandos lejos a la caja torácica exponiendo las costillas y la médula espinal (figura 3B).
- Sacar la lengua, esófago, tráquea, laringe y todos otros tejidos blandos y la musculatura que cubre la base del cráneo y la columna vertebral (como se ve en la figura 3C).
- Disecar el tejido que cubre la plataforma duro-a. Identificar el paladar duro ubicando una placa rectangular de hueso en la base del cráneo con una muesca en forma de V en él (figura 3C). Corte a lo largo de la línea media del paladar, cuidadosamente levante hacia arriba y realizar un corte para quitarla (figura 4A) transversal.
- Comenzar una laminectomía ventral retirando láminas exponiendo la superficie ventral del tronco encefálico y la médula espinal de la primera vértebra cervical a aproximadamente vértebra torácica 7 (T7) como se ve en la figura 4B.
- En esta etapa, las raicillas ventrales será visibles. Usando pequeños micro-disección o tijeras primavera, tenga cuidado de hacer cortes a las láminas y lo más lejos del origen de las raíces en la médula espinal como sea posible; evitar estiramiento de las raíces.
- SNIP 5-10 mm a ambos lados de la columna vertebral en las láminas. No corte demasiado cerca a la médula espinal o en las vértebras. Este paso permite la eliminación de las vértebras cervicales para exponer la médula espinal. Evite cortar las raicillas.
- SNIP raicillas aproximadamente 20-25 mm (bilateral) a lo largo de la columna vertebral (aproximadamente T7). A través de este procedimiento evitar el corte en la médula espinal y manipular los bordes de las vértebras como se ve en la figura 4C.
- Eliminar C1, C2 y C3 levantando el borde rostral de cada una de las vértebras con cuidado y cortar con tijeras muy por debajo del hueso. Cuanto más cerca del hueso que se efectúa el corte, cuanto más tiempo la raicilla. Enganchado o dobladas pinzas para lograr un agarre firme sobre cada vértebra cervical haciendo cortes (figura 4C).
- Una vez la longitud deseada de la médula espinal aislada y disección de la columna vertebral, hacer un corte transversal para quitar la médula espinal (figura 5A yBde la figura 5).
- Retire el mater del dura.
Nota: el cordón espinal tronco encefálico aislado puede ser utilizado para grabación en bloque en vitro como ha sido descrito previamente3,7. Con la médula oblonga-medular de la columna vertebral, debe eliminarse la duramadre para proporcionar un acceso óptimo para los electrodos de succión realizar grabaciones del corte craneal y espinal rootles. Además, eliminación de la duramadre hace posible limpio cortar el tronco del encéfalo y obtener lonchas finas rítmicamente activas para la grabación de in vitro.- Cuidadosamente el pasador de la aislada del médula oblonga-en la médula espinal lateral dorsal de tejido hacia arriba para permitir el acceso a la duramadre que rodea el cráneo rootles (figura 5B). Pernos se deben aplicar por el margen lateral del médula oblonga, rostral a las raicillas XII.
- Retire la duramadre de la superficie dorsal de la médula oblonga dura con pinzas finas (#5) en el margen dorsal de la duramadre y corte de lateral a medial a través de la longitud del tronco encefálico con una tijera fina primavera. Tenga cuidado para evitar cortar dentro del médula oblonga sí mismo. Los vasos sanguíneos de la superficie del médula oblonga de Levante suavemente y corte para evitar el impedimento de la hoja vibratome al seccionar el tronco del encéfalo.
- Disecar cuidadosamente dura desde los aspectos mediales y laterales del tronco encefálico, como las raicillas del nervio craneal pasan a través de la dura y son fácilmente rasgadas lejos cuando se levanta la duramadre. Minimizar la probabilidad de que las raicillas se quitó cortando suavemente a su alrededor con una tijera pequeña primavera.
- Tirón de la médula espinal tronco encefálico para que la superficie ventral se enfrenta y las raicillas craneales son claramente visibles. Disecar la duramadre de la parte dorsal del tronco encefálico levantando suavemente la dura directamente sobre el área postrema, corte de rostral a caudal. El área postrema aparecerá ligeramente rosado debido a la gran cantidad de microcapilares inunda la región.
- Usar un fino alfiler insectos para fastidiar a cualquier dura restante y eliminar vasos restantes en proximidad cercana a raicillas craneales y cervicales.
4. rodaja de protocolo
- Después de retirar la duramadre, colocar el tronco encefálico en el centro de la plataforma de parafina en el bloque de plástico (en lo sucesivo, el "bloque de corte"). Prender con alfileres el extremo caudal del tronco encefálico a través de la médula espinal distal con finos alfileres insectos que han sido recortados a no más de 1 cm de longitud como se muestra en la figura 5C.
- Alinee el bloque de corte cubierta de parafina con el médula oblonga fijado en el soporte del bloque vibratome que la cuchilla corte perpendicular a la cara rostral del tronco encefálico.
- Hacer un corte inicial para extirpar el tejido desigual, extraño en el extremo más rostral. Este corte inicial puede ser de 200-300 μm típicamente pero cuidadosamente evitar eliminación de raicillas craneales IX, X y XII. Este paso normalmente revelará la parte caudal del núcleo facial (VII) y las raicillas del glosofaríngeo y permite alinear el tronco encefálico para que su cara es par es plana la hoja vibratome. Hacer pequeños ajustes cuando sea necesario para garantizar la par-planaridad y hacer pequeños cortes para remover el tejido que es desigual.
Nota: Raicillas del glosofaríngeo (IX) será visibles en el borde lateral del médula oblonga y uno corta cada rebanada sucesiva, estos proporcionan un punto de referencia para la distancia rostro caudal a los circuitos neuronales de la médula oblonga es necesario para la generación de ritmo. En el lado ventral del tronco encefálico, las raicillas hipoglosos (XII) deben también verse ligeramente caudal a la cara de corte mostrando las raicillas IX. Un punto de referencia final será el obex (el punto en el cerebro humano en el que el cuarto ventrículo se estrecha para convertirse en el canal central de la médula espinal) en la cara dorsal del tronco encefálico. Con estos tres puntos de referencia visibles, que el plano de corte correcta es establecieron (véase la figura 6A) y se obtendrá confiablemente una rebanada rítmicamente activa. - Continuar corte caudal a rostral hasta las raicillas IX están cerca de la superficie de la cara cortada del tronco encefálico.
- Consulte la figura 6 para puntos de referencia y orientación correcta. Ajuste la placa de parafina en la abrazadera de vibratome para que el siguiente ángulo de transección se crea una forma muy leve "cuña" a la rebanada cortada y cortar rodajas de aproximadamente 100-200 μm hasta los hitos descritos pueden ser visto claramente (figura 6A).
Nota: Esta cuña ligera aumenta el número de las neuronas motoras de la XII en el segmento y maximiza la probabilidad de obtener actividad rítmica durante la grabación. Utilizando los hitos descritos (raicillas rostrales del paquete del nervio glosofaríngeo, raicillas del paquete del nervio hipogloso, el obex) se asegurará de que el segmento reproductivo contiene al menos una gran parte de la pBC (figura 6B). - Cortar una rebanada del μm 300-500 del médula oblonga de estos marcadores neuroanatomical rostrales para capturar el pBC y asociados circuitos de transmisión.
Nota: Una rebanada "ideal" contendrá la raicilla más rostral del paquete raicilla hipogloso confiablemente obtener actividad inspiratoria sin recurrir a grabaciones superficiales utilizando un electrodo de succión sobre el ritmo-generación/transmisión de lugares geométricos en el médula oblonga.
5. grabación procedimientos
- Coloque la rebanada en una cámara de grabación, perfusión continua con aCSF (0.5 - 1.0 mL/min) y utilizar electrodos de succión o extracelulares a la actividad de registro de población de las raicillas XII o de la pBC, XII PMNs o motoneurons XII. Grabación detallada de procedimientos, ver publicaciones anteriores sobre electrofisiología de la médula espinal de la médula oblonga y parche sujeción10,11.
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Representative Results
El método presentado aquí permite un investigador interesado en la obtención de rodajas rítmicamente activas del médula oblonga reproducible y fiable cortar un sector viable y robusto que permite la grabación de salida del motor fictive de muchas horas. Todos los elementos de circuito neuronal mínimamente necesario para generar y transmitir el ritmo inspiratorio pueden ser capturados en una rebanada fina usando este método. Estos elementos incluyen: preBötzinger complejo premotor neuronas proyectan a las neuronas de motor hipoglosos (pXII MNs) y las neuronas motoras hipoglosos (XII MNs) y raicillas del nervio hipogloso. El pBC XIIn y C4 raicillas nervio utilizan con frecuencia para las grabaciones de ritmo inspiratorio, como se ilustra en la figura 7.
Uso exitoso de este procedimiento producirá una preparación de bloque en viable y rítmicamente activa en 10-15 minutos, o una tajada de rítmicamente activa en < 30 min. Después de aislamiento de la médula en bloque del tronco encefálico o una rebanada fina, 15 minutos de conseguir el equilibrio en la cámara de grabación es suficiente para la producción de salida del motor fictive. En el caso de la rebanada, aumentando la [K + extracelular] a alrededor de 8-9 mM producirá robusta unidad neural que puede durar de 24 a 36 h en la experiencia de este laboratorio. La preparación debe ser continuamente sobrefundida con carbogenated (5% 95% O2CO2) y climatizada de la aCSF (~ 27 ° C). Disecciones de éxito se realizan rápidamente y evitar pellizcar, estirar o dañar las raicillas del nervio utilizados para grabaciones. Para obtener resultados óptimos, todos los pasos en el procedimiento se realiza rápidamente y el tejido debe ser bañado o continuamente inundado con carbogenated aCSF al realizar la disección y aislamiento del tejido (como se describe anteriormente). Extensa sobre la neuroanatomía y Atlas precisa del médula oblonga, véase el trabajo de Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 y colegas. El protocolo presentado aquí es un método que ha demostrado ser confiable en el laboratorio del autor principal y este informe proporciona un método gráfico, paso a paso para la generación de estas rodajas confiando sólo en puntos de referencia superficiales visibles en el tallo cerebral o en el médula oblonga como detallados aquí.
Figura 1 : Inicial de la disección para la extracción de la médula espinal de la médula oblonga. (A) cachorro Anesthetized cubrió para la disección. Las líneas punteadas indican las directrices de la incisión para incisión sagital en piel y transversal corta caudal a los ojos y debajo del diafragma. (B) guía para la eliminación de piel y patas delanteras del animal. (C) aspecto Dorsal del roedor de piel. Las líneas punteadas indican las directrices de la incisión para la exposición de "clamshell" cráneo-aleta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Etapas de la laminectomía dorsal. (A) las líneas punteadas indican las directrices de la incisión para extraer el cerebro. (B) resultado después de retirar el tejido. Las líneas punteadas indican las directrices de la incisión para laminectomía dorsal. (C) expuesto del tronco encefálico espinal cordón tras laminectomía dorsal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Etapas de la disección ventral inicial. (A) lado Ventral de un roedor piel con cortadas forebrain y el abdomen. Las líneas punteadas indican las directrices de la incisión para eliminar el proceso de la xyphoid y la apertura de la caja torácica para posteriormente remover órganos de cavidad abdominal y torácica. Órganos de la cavidad Abdominal y torácica (B) retirados. (C) estructuras orofaríngeas quitadas. Las líneas punteadas indican las directrices de incisión para la extracción de paladar duro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Etapas de la laminectomía ventral. Paladar (A) y las partes de cráneo quitadas restantes. Las normas de incisión indican cómo quitar tejido restante que rodea la médula espinal de la médula oblonga. (B) primera vértebra cervical (C1) expuesta. (C) demostración de elevación C1 y realizar un corte transversal al cuerpo vertebral para quitarlo. Los nervios son cuidadosamente corte al ras hacia el lado dorsal del cuerpo vertebral antes de retirarlo. Este es el paso más crítico en la disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Preparación de médula espinal tronco encefálico para rebanar. (A) C1-C3 de la médula espinal. Las normas de incisión indican donde cortar la medula médula oblonga de la médula espinal caudal. (B) lado Ventral de médula espinal de médula oblonga con raicillas nervio marcado. Las normas de incisión indican recomendado transección o restantes estructuras rostrales en el ponto-medular antes de grabar de la región de la médula espinal de la médula oblonga. Parafina (C) losa de configuración para rebanar en el vibratome. El corte incluye tejido entre los nervios craneales IX y XII. No coloque el micro-pins en la región de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Puntos de referencia utilizados para la obtención de lonchas con un intacto núcleo motor hipogloso y complejo PreBötzinger. (A) vista transversal de la médula oblonga médula después de corte inicial rostral a las raicillas del glosofaríngeo (IX). Guía de incisión indica transection justo caudal a las hipoglosos raicillas (XII). (B) orientación del bloque de parafina a la hoja antes de cortar una rebanada con la pBC y el hipogloso núcleo motor. Crear un corte de forma trapezoidal "cuña" maximiza la probabilidad de capturar suficientes neuronas inspiratorias en el segmento para obtener actividad rítmica durante la grabación. La cuña incluye la pBC, el hipoglosos premotor neuronas y las neuronas de motor hipoglosos, que colectivamente la circuitería necesaria para transmitir la impulsión rítmica, que es un índice del rhythmogenesis respiratoria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Grabaciones representativas de preparaciones de bloque o segmento en. (A) seguimiento integrado de raicilla XII. (B) seguimiento integrado de la pBC. Grabación de la pBC utilizando una preparación de bloque en requerirá una abrazadera del remiendo ciego. (C) seguimiento integrado de las raicillas del nervio C4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Adaptando el protocolo presentado aquí en un en bloque o rebanada workflow es ventajosa para los laboratorios y estudios que le gustaría utilizar ya sea medular en bloque del tronco encefálico o delgada rebanada preparados para grabaciones de electrofisiología. El método de disección y corte presentado, combinado con métodos divulgados previamente por otros17,18,19, permitirá la preparación reproducible de tejido viable y robusto que es ampliamente adaptable a una gama de experimentos con roedor cerebelo o la médula espinal. La disección presentada es altamente detallada e incluye laminectomía dorsal y ventral, así como extenso detalle sobre orientación de la médula espinal tronco encefálico cuando se prepara para cortar láminas. El protocolo de disección y corte detallado presentado permite al investigador incluir todos los circuitos necesarios para la generación y transmisión del ritmo inspiratorio. Las principales poblaciones/estructuras neuronales que pueden ser capturadas utilizando este método incluyen: las neuronas premotor hipoglosos, el núcleo motor hipogloso y el complejo preBötzinger. Nota que las regiones del tronco encefálico que contienen central CO2 sensores o circuitos de generación de ritmo espiratorios (RTN/pFRG) no están incluidas en la preparación había detallada aquí20,21. Una vez que se cuente con la preparación de en bloque o rebanada, actividad rítmica puede obtenerse utilizando electrodos de succión, electrodos de superficie o métodos de grabación unicelular como unidad extracelular o sujeción parche métodos3,10 ,11.
El objetivo de este protocolo es proporcionar un método claro, fácil de seguir para generar una preparación de la médula espinal tronco encefálico o una rodaja fina, rítmicamente activa. Este protocolo debe ser valiosa para los investigadores experimentados y nuevos interesados en incorporar preparaciones rítmica del médula oblonga/rebanada en su arsenal, ya que hay varios pasos críticos detallados dentro de los procedimientos que facilitan la captura de reproducibles, robustos y duradero rebanadas rítmicamente activas.
Una vez que el investigador se ha convertido en cómodo con identificación de los puntos anatómicos y las habilidades necesarias para la disección, aumentará la velocidad de la disección y los procedimientos pueden ser optimizados para cada investigador individual. El protocolo detallado aquí fue enseñado para el autor mayor (CGW) durante su trabajo post-doctoral con Jeffrey Smith, el creador de la rítmica del médula oblonga rodaja preparación3. Para garantizar la actividad rítmica y su viabilidad en las rebanadas y en preparaciones de bloque, todos los procedimientos para generar una rebanada deben acabar dentro de aproximadamente 30 minutos de inicio del procedimiento a una rebanada en la cámara de grabación. Con la perfusión continua, hay muy poco impacto sobre la viabilidad del tejido pero minimizando el tiempo de disección permite ya la grabación y adquisición de datos. Estudios respiratorios, un sector que es tan fino como gruesa de aproximadamente 280 μm3 tendrá actividad inspiratoria rítmica, robusta, pero rebanadas pueden variar hasta 550 μm17,18,19,22. Práctica cuidadosa es necesaria para desarrollar las habilidades necesarias para realizar este procedimiento y minimizar la variabilidad en el grosor y posición rostral y caudal de cada rebanada. Incluyendo o excluyendo ciertas poblaciones celulares influirá en la calidad y la robustez de la actividad rítmica en más adelante la grabación como núcleos tanto excitatorios como inhibitorios en el médula oblonga pueden afectar la "calidad" del ritmo grabada desde la división de 3.
Por último, también es fundamental que aCSF se prepara exactamente según protocolo y está a un nivel de pH estándar20, temperatura y oxigenación. Preparaciones anóxicas no rítmicamente activas y afectarán los datos colección21.
Hay varios pasos claves en el procedimiento que facilitan una captura del investigador de preparaciones viables y rítmicamente activas. Durante la laminectomía ventral, manteniendo intacta la jaula de la costilla dorsal permite apalancamiento adicional y proporciona más tejido para asegurar la preparación mientras se realiza el aislamiento relativamente delicado de la médula espinal del médula oblonga de la columna vertebral. La pasos detallados aquí permiten al investigador a fácilmente productos en bloque preparaciones o rodajas finas por lo que, por necesidad, son pasos adicionales detallados la disección puede omitirse para obtener sólo una rebanada fina. Otros consejos incluyen, al realizar la laminectomía ventral, es importante obtener un agarre firme en el cuerpo vertebral se levante hacia arriba y cortar las raicillas del nervio. Una vez diseccionada y extraída la médula espinal de la médula oblonga la duramadre y la vasculatura restante deben disecados de la superficie del tejido neural. Los vasos sanguíneos y dura son difíciles y pueden impedir que la hoja vibratome corte un trozo limpio. Disección de la duramadre no es vital para la preparación de en bloque, pero se recomienda para optimizar el acoplamiento de electrodo de succión del nervio. Por último, cuidadosa y metódica práctica en el uso de la vibratome es necesaria para cortar un trozo limpio y reproducible. Este protocolo proporciona una lista muy completa de instrucciones detalladas para los procedimientos de corte y disección. El énfasis aquí es proporcionar una lista detallada paso a paso para un investigador usar como una base confiable y herramienta de formación que pueden modificar los procedimientos de su laboratorio según sea necesario.
Como un todo, esta metodología representa una evolución de treinta años de métodos de electrofisiología in vitro. El alcance de este trabajo se centra en la normalización de en bloque y cortar grabaciones de médula espinal tronco encefálico que se suelen utilizar para el estudio de actividad inspiratoria en ratas y ratones de P5 P022. Sin embargo, este proceso de disección puede utilizarse en una amplia gama de animales tamaños, edades y especies para una amplia variedad de estudios, incluyendo las ratas/ratones E18, neonatales ratas y ratones (postnatales días 0 a 6) y ratones adultos. Los estudios futuros pueden utilizar los métodos presentados para optimizar los protocolos en las especies y edades, permitiendo estudios a interrogar a mecanismos de generación de ritmo u otro proceso fisiológico a través de las especies y edades. En última instancia, cambiar la orientación, el grosor o la ubicación de la rebanada o en bloque preparación influirá en actividad rítmica23. Extensa literatura ha sido publicada en el pasado con respecto a las poblaciones neuronales capturado por procedimientos de rebanada y hay estereotáxicas rata y ratón Atlas disponibles para proporcionar más detalle sobre los circuitos neuronales debatido24, 25,26. Los procedimientos presentados aquí ofrecen detalle extensa con ilustraciones claras que permitan un nuevo investigador aprender a cortar rodajas rítmicas de hitos visibles en un laboratorio de disección alcance.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
S.B.C. es un receptor de una beca de investigación en pregrado Loma Linda Universidad de verano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
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