Summary
Detta protokoll både visuellt kommunicerar hjärnstammen-ryggmärgen beredning och klargör utarbetandet av hjärnstammen tvärgående skivor på ett omfattande steg för steg sätt. Den var avsedd att öka reproducerbarhet och öka sannolikheten för att få livskraftiga, långvarig, rytmiskt aktiva skivor för inspelning av neurala utdata från de respiratoriska områdena i hjärnstammen.
Abstract
Däggdjur inspiratorisk rytm genereras från ett neuronala nätverk i en region i medulla kallas preBötzinger komplex (pBC), som producerar en signal körning inspiratorisk musklernas rytmiska sammandragning. Rytmiska neural aktivitet genereras i pBC och transporteras till andra neuronala pooler att köra muskulaturn av andning kan studeras med hjälp av olika metoder, inklusive klump nerv inspelningar och tvärgående segment inspelningar. Dock har tidigare publicerade metoder inte utförligt beskrivs processen hjärnstammen-ryggmärgen dissektion i ett öppet och reproducerbart sätt för framtida studier. Här presenterar vi en omfattande översikt av en metod som används reproducibly skära rytmiskt aktiva hjärnstammen skivor som innehåller de nödvändiga och tillräckliga neuronala kretsen för genererandet och sändandet av inspiratorisk drive. Detta arbete bygger på tidigare hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi protokoll att öka sannolikheten för att tillförlitligt få livskraftiga och rytmiskt aktiva skivor för inspelning av neuronala utdata från pBC, hypoglossus premotor nervceller (XII pMN), och hypoglossus motoriska nervceller (XII MN). Det arbete som presenteras expanderar på tidigare publicerade metoder genom att tillhandahålla detaljerad, steg för steg-illustrationer av dissektion, från hela råtta pup, att in vitro-skiva som innehåller de XII rottrådar.
Introduction
Respiratoriska neurala nätverk av hjärnstammen ger en bördig domän för att förstå de allmänna egenskaperna hos rytmiska neurala nätverk. Intresset är särskilt i utvecklingen av neonatal gnagare andas och förstå hur andning rytm framkallar. Detta kan vara klar med en multi-level tillvägagångssätt, inklusive i vivo hela djur pletysmografi, in vitro-klump nerv inspelningar, och in vitro-skiva inspelningar som innehåller andning rytm generatorn. Reduktionistiska i vitro sv bloc och segment inspelningar är en fördelaktig metod att använda när förhör mekanismerna bakom respiratorisk rhythmogenesis och neurala kretsar i hjärnstammen-ryggmärgen regionen utveckla gnagare. Utveckla andningsorganen omfattar cirka 40 celltyper, kännetecknas av bränning mönster, däribland de centrala luftvägarna1,2. Det centrala luftvägarna nätverket ingår en grupp av rytmiskt aktiva nervceller som ligger i rostralt ventrolaterala medulla1,3. Däggdjur respiratoriska rhythmogenesis genereras från en autorhythmic interneuron nätverk dubbade den komplexa preBötzinger (pBC), som har varit lokaliserade experimentellt via både skiva och en bloc preparat av neonatal däggdjurs hjärnstammen-spinal sladdar3,4,5,6,7,8. Denna region fyller en liknande funktion till noden sinoatrial (SA) i hjärtat och genererar en inspiratorisk tidtagningssystem till drive respiration. Från pBC bärs inspiratorisk rytmen till andra regioner av hjärnstammen (inklusive hypoglossus motorn kärnan) och spinal motor pooler (såsom de phrenic motoriska nervceller som driver membranet)9.
Rytmisk aktivitet kan erhållas med hjälp av hjärnstammen ryggmärgen sv bloc beredningar eller skivor från en mängd olika cellpopulationer, inklusive C3-C5 nerve rottrådar, XII nerv rottrådar, hypoglossus motorn kärnan (XII MN), hypoglossus premotor nervceller (XII pMN), och pBC3,10,11,12. Medan dessa metoder för datainsamling har varit framgångsrika över en handfull laboratorier, är många av protokoll som inte presenteras på ett sätt som är fullt reproducerbart för nya forskare in i området. Att få livskraftiga och rytmiskt aktiva en bloc och skiva preparat kräver en akut uppmärksamhet till detalj genom alla steg av dissektion och slice skärande protocol. Tidigare protokoll utförligt beskriva de olika inspelningsprocedurer och elektrofysiologi, men saknar detalj i den mest kritiska delen för att få en livskraftig vävnad förberedelse: utföra hjärnstammen-ryggmärgen dissektion och skiva procedur.
Effektivt att erhålla en rytmiskt aktiva och livskraftig sv bloc eller slice beredning hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi inspelningar kräver att alla åtgärder utföras korrekt, noggrant och snabbt (vanligtvis hela förfarandet relaterade här kan vara som utförs i ca 30 min). Kritiska punkter i hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi protokollet som inte tidigare väl beskrivits inkluderar dissektion av nerv rottrådar och skivning förfarandet på vibratome. Detta protokoll är först att stegvis visuellt kommunicera hjärnstammen-ryggmärgen dissektion för både nya forskare och experter på området. Detta protokoll förklarar också grundligt kirurgiska tekniker, sevärdheter och andra förfaranden för att hjälpa framtida forskare att standardisera skivor och klump preparat innehåller den exakta kretsar som önskas i varje experiment. De förfaranden som presenteras här kan användas i både råtta och mus neonatala valpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har accepterat och godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Loma Linda University. NIH riktlinjer för etisk behandling av djur följs i alla djurförsök som utförs i laboratoriet. Alla etiska normer skulle godtas av individer som utför detta protokoll.
1. lösningar
-
Förbereda konstgjorda cerebral ryggmärgsvätskan (aCSF).
- Förbereda färska aCSF kvällen innan ett experiment i 1 L partier använder följande recept: 7.250 g NaCl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO3 (25 mM), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM), och 5.410 g D-glukos (30 mM), 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Alltid lägga till den CaCl2 • 2 H2O senast.
- Lös upp komponenterna i 1 L avjoniserat vatten. Rör om 20-30 minuter.
- Mät pH-värdet i aCSF och justera till 7,40 ± 0,02 med små volymer (vanligtvis < 0,5 mL) av utspädd NaOH, KOH eller HCl.
Obs: Förberedda aCSF kan förvaras i kylskåp (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) upp till tre dagar innan bakteriell tillväxt påverkar lönsamheten av vävnad under ett experiment. Använda 0,2 µm filter för att reducera kontaminering av svamp eller bakterier förekommer i laboratoriet eftersom experiment kan pågå upp till 36 timmar. För effektivitet, aCSF receptet beskrivs kan skalas till 4 L partier efter samma protokoll och denna volym kommer att pågå i upp till tre dagar av experiment.
2. beredning av dissektion och Vibratome rigg
-
Ställa in bladet.
- Använda en färsk tveeggat rakblad för styckning vävnad på ett vibratome. Tvätta bladet med 100% etanol och skölj med avjoniserat vatten innan styckning eller snappning bladet i hälften och infoga bladet i montering klämma på vibratome.
- Ändra bladet varje gång en ny vävnad förberedelse är monterad på vibratome för skivning eller om det skär i paraffin plattan medan skivning. Alla paraffin rester blir det nästan omöjligt att skära rent igenom neonatal nervvävnad.
-
Ställa in paraffinvax platta.
- Använda någon inbäddning stil paraffin vax. Placera 10 g bädda in media i en värme-tolerant glasbägare och Använd låg värme för att smälta paraffin vax pärlorna till vätska.
- Tillsätt cirka 0,5 g Grafitpulver och blanda lösningen noggrant och jämnt i den flytande paraffinen.
- Använd en liten plast platta som substrat för paraffinet. Skär en små (0,5 - 1 cm tjock och ca 2 x 2 cm2 brett) bit av plast (polykarbonat eller aluminium kan också användas). Använd en maskinist filen att skrapa grooves i plasten asthis kommer att säkerställa att paraffinet följer plast.
Obs: Alternativt använda uppvärmda 18 G injektionsnål för att placera vinklade hål i bladet att säkerställa att paraffin-grafit blandningen klibbar till plast. - Använd baksidan av en bomull tip applikator för att droppa paraffin-grafit blandningen på plasten genom att upprepade gånger doppa applikatorn i smält paraffin-grafit blandningen, droppande suspensionen till plast blocket och bygga paraffin-grafiten till ca 1,5 cm i tjocklek ovanpå plasten.
- När ett tillräckligt tjockt lager paraffin-grafit mix deponeras på blocket, ställa in blocket åt sidan att svalna och sedan forma för att rymma hjärnstammen-ryggmärgen.
3. dissektion och isolering av Neuraxis
- Utföra första dissektion och anesthetization.
Obs: djur som används i denna studie kan variera i storlek från embryonala dag 18 (E18) till postnatal dag 10-20 i möss eller råttor som sträcker sig från E18 till postnatal dag 5/6. Råttor eller möss av stam, behandling, eller kön kan användas, beroende på experimentell design. Utföra anestesi och preliminära dissektion under ett dragskåp eftersom isofluran används (0,25 mL i en 25 mL kammare).- Väger pup och placera det i en anestesi kammare som innehåller 0,25 mL isofluran placeras på en 2 x 2 tum2 bit gasbinda. Efter djuret når ett kirurgiskt plan av anestesi (verifierad av tå nypa med inga uttag reflex), pin djuret på en petriskål fylld med paraffin eller silikon elastomer.
Obs: Neonatal gnagare kan också vara sövda via cryoanesthesia13,14, isofluran förångning15, eller injektion16 balanserad med syre. - Placera den animaliska ventral sidan nedåt och gör ett mittlinjen snitt från precis bakom ögonen i mitten av lumbal regionen av ryggrads-kolonnen med ett nummer 10 eller 11 skalpell blad eller kirurgisk sax. Återspeglar huden och decerebrate djuret på nivån av parietala/occipital suturen (se figur 1) och ta bort huden transecting djuret nedanför mellangärdet. Ta sedan bort armarna genom att skära på axelleden med sax eller skalpell.
- När huden avlägsnas, överföra djuret till en perfusion kammare med silikon elastomerin botten för ytterligare dissektion och beredning av hjärnstammen-ryggmärgen.
- Bubbla en aCSF reservoar (500 mL sidoingången flaska) kontinuerligt med kyld (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) aCSF och syresätta med en blandning av 95% O2 och 5% CO2 (kallas även ”carbogen”). Under dissektion, använda kylda aCSF att periodiskt spola igenom kammaren, som tillhandahåller färskt syresatt aCSF hela isolering av hjärnstammen-ryggmärgen.
Obs: Röda blodkroppar kan ses i den återstående artärer och vener och när tillräckligt syresatt, dessa är klarröd. - Använda gravitation flöde perfusion via slangar och en Avstängningskranen, att intermittent eller kontinuerligt BEGJUTA vävnaden med syresatt aCSF (bolus volym eller via långsamma DROPP använder en Avstängningskranen, ca 0,5 - 1,0 mL/min). Detta syresätter vävnaden och upprätthåller en tydlig operationsområdet.
- Ta bort överflödig vätska som behövs av vakuum sug filtreringssystem.
- Utföra dissektion med dissekera Mikroskop. En kontinuerlig zoom-modell är att föredra att möjliggöra finjustering av förstoring och ge optimal visualisering av regionen av intresse under varje steg av dissektion.
Obs: Mikrokirurgi verktyg rekommenderas inkluderar en rad tandade vävnad pincett, trubbig pincett, #5 pincett, vinklade vävnad pincett, en rad mikro-dissekera saxen (våren sax), och regelbundna insekt och mikro-dissekera pins. - Exponera hjärnan via mittlinjen avsnittet i skallen längs sagittal suturen och sedan fästa ned reflekterade viftar med mikro-dissekera stift och fästa ryggrads-kolonnen i kaudala slutet längst silikon-omfattas av dissektion kammaren med en 27 G nålen.
Obs: Resten av dissektion kräver en dissektion Mikroskop för att ge den klaraste utsikten över vävnad och sevärdheter som används för att säkerställa högsta sannolikheten för att erhålla rytmiska fiktiva utgång på de kraniala rottrådar av hjärnstammen och spinal rottrådar. Utför dessa steg för dissekering med medellång våren sax eller iris sax och fin pincett.
- Väger pup och placera det i en anestesi kammare som innehåller 0,25 mL isofluran placeras på en 2 x 2 tum2 bit gasbinda. Efter djuret når ett kirurgiskt plan av anestesi (verifierad av tå nypa med inga uttag reflex), pin djuret på en petriskål fylld med paraffin eller silikon elastomer.
- Utan dröjsmål överföra isolerade stammen av djuret till en pärlande dissektion kammare. Lägg vävnad ryggsidan uppåt med rostralt slutet (hjärna) som vetter mot framsidan av kammaren. Fästa vävnaden i axlar och mest kaudala slutet av ryggmärgen.
- Gör en mitten-sagittala snitt genom skallen efter parietala suturen att undvika skada cortex och hjärnstammen underliggande skallen.
Obs: Neonatal benvävnad är inte fullt förkalkade och är mycket spröda. Av benvävnad blir flexibel till en grad, men tuffare än den omgivande bindväv och muskelvävnad. - Använd medium våren eller iris sax för att klippa occipital suturer av skallen, början på sagittal suturen och arbetar sidled. Detta kommer att skapa ”flikarna” på skallen som kan reflekteras och fäst för att förankra rostralt delen av skallen och ge viss stabilitet till vävnaden (se figur 2A).
- Efter återspeglar viftar med skallen, avskurna resten av hjärnbarken, lämnar den kaudala delen av lillhjärnan (vermis) relativt intakt (figur 2B).
- Gör en mitten-sagittala snitt genom skallen efter parietala suturen att undvika skada cortex och hjärnstammen underliggande skallen.
- Utföra dorsal laminektomi.
- Ta bort den muskulatur som omger skallen och kotpelaren använder micro våren sax och pincett. Ta bort vävnad längs ryggsidan av bröstkorgen, medan bröstkorgen intakt, eftersom detta kommer att vara fastlåst senare för att förankra vävnaden under den ventrala laminektomi, minimera risken för skador på ryggmärgen.
- Försiktigt klippa bort den laterala processen i de vertebrala bladskivan använder medelstora våren sax eller fina iris sax. Skär bort någon vävnad överliggande pons och medulla. Vermis, lillhjärnan, pons, och början av ryggmärgen blir nu klart synliga (figur 2C).
- Utföra ventrala laminektomi.
- Förvandla vävnad ryggsidan ner och fästa i bröstkorgen och mest kaudala slutet av ryggraden. Fästa den rostralt sidan av vävnad använder skallen viftar (figur 3A).
- Ta bort den ventrala delen av bröstkorgen, inklusive bröstbenet och alla bukorganen använder samma sax och pincett. Dissekera bort mjukdelar bifogas bröstkorgen utsätta revbenen och ryggmärgen (figur 3B).
- Ta bort tungan, matstrupen, luftstrupen, struphuvudet, och alla andra mjukdelar och muskulatur överliggande basen av skallen och ryggraden (som kan ses i figur 3C).
- Dissekera vävnad överliggande hårda pallen. Identifiera den hårda gommen genom att lokalisera en rektangulär platta av ben vid basen av skallen med en V-form indrag på det (figur 3C). Skär längs mittlinjen av gommen, försiktigt lyfta den uppåt och utföra en tvärgående skär för att ta bort det (figur 4A).
- Påbörja en ventrala laminektomi genom att ta bort bladskivan utsätta ventrala ytan av hjärnstammen och ryggmärgen från den första halskotan till ungefärligt bröstkorg kotan 7 (T7) som kan ses i figur 4B.
- I detta skede blir de ventrala rottrådar synliga. Använder små mikro-dissektion eller våren sax, ta hand för att göra nedskärningar så nära bladskivan och så långt från rötter ursprung på ryggmärgen som möjligt. undvika stretching rötterna.
- Klipp 5-10 mm längs båda sidor av ryggraden på bladskivan. Skär inte för nära ryggmärgen eller i kotorna. Detta steg kan avlägsnande av halskotor att exponera ryggmärgen. Undvik att skära rottrådar.
- Snip rottrådar cirka 20-25 mm (bilateralt) längs ryggraden (ungefärligt T7). Hela proceduren undvika styckning i ryggmärgen och manipulera kotorna som kan ses i figur 4Ckanter.
- Ta bort C1, C2 och C3 genom att försiktigt lyfta rostralt kanten av var och en av kotorna och snipping noga under benet. Ju närmare benet att snittet görs, ju längre rootlet. Användning fast eller böjd pincett till stöd att uppnå ett fast grepp på varje halskotan samtidigt göra nedskärningar (figur 4C).
- När önskad längd på ryggmärgen är isolerade och dissekerade från kotpelaren, göra ett tvärgående snitt att avlägsna ryggmärgen (figur 5A och figur 5B).
- Ta bort dura mater.
Obs: isolerade hjärnstammen-ryggmärgen kan användas för klump in vitro-inspelning som har funnits tidigare beskrivna3,7. Med hjärnstammen-ryggmärgen bort från ryggraden, måste dura tas bort för att ge optimal åtkomst för sug elektroder att utföra inspelningar från snittet kranial och spinal rootles. Dessutom, gör borttagning av dura det möjligt att rent skiva hjärnstammen och erhålla rytmiskt aktiva tunna skivor för in vitro-inspelning.- Noggrant rootles pin den isolerade hjärnstammen-spinal cord vävnad ryggsidan upp för att tillåta åtkomst till dura kring den kraniala (figur 5B). Stiften bör tillämpas genom den laterala marginalen av hjärnstammen, rostralt om de XII rottrådar.
- Avlägsna dura från dorsala ytan av hjärnstammen genom att lyfta dura med fin pincett (#5) dura dorsala marginal och klipp från lateral till medial över längden av hjärnstammen med fina våren sax. Var noga med att undvika styckning i hjärnstammen själv. Lyft blodkärl från hjärnstammen ytan försiktigt och skär för att undvika hinder av vibratome bladet vid snittning av hjärnstammen.
- Noggrant dissekera dura från de mediala och laterala delar av hjärnstammen, som de kranialnerven rottrådar passerar dura och är lätt slet bort när dura lyfts. Minimera sannolikheten för de rottrådar dras genom att försiktigt skära runt dem med liten fjäder sax.
- Vänd hjärnstammen-ryggmärgen så att den ventrala ytan vänd uppåt och de kraniala rottrådar syns tydligt. Dissekera dura från ryggsidan av hjärnstammen genom att försiktigt lyfta dura direkt över det området postrema, skära från rostralt till stjärtfenan. Den area postrema visas något rosa på grund av det stora antalet microcapillaries startas denna region.
- Använd en fin insekt stift retas bort eventuella återstående dura och ta bort återstående blodkärl i närheten av kraniala och livmoderhalscancer rottrådar.
4. skiva protokoll
- Efter bort dura, placera hjärnstammen i mitten av paraffin plattformen på plast blocket (hädanefter benämnd ”styckning block”). Fästa i kaudala slutet av hjärnstammen genom distala ryggmärgen använda fina insekt pins som har trimmats till mer än 1 cm i längd som visas i figur 5C.
- Justera paraffin-täckt skära blocket med fästa hjärnstammen i vibratome block hållaren så att bladet skär vinkelrätt i rostralt ansiktet av hjärnstammen.
- Gör en första skiva att ta bort den ojämna, främmande vävnaden på rostralt-mest slutet. Detta inledande snitt kan vara 200-300 µm vanligtvis men noggrant undvika borttagning av IX, X och XII kraniala rottrådar. Det här steget normalt kommer att avslöja kaudala omfattningen av facial kärnan (VII) och de glossopharyngeal rottrådar och gör det möjligt att anpassa hjärnstammen så att dess ansikte är par-planar vibratome Blade. Gör små justeringar som behövs för att säkerställa par-planarity och göra små nedskärningar att avlägsna vävnad som är ojämn.
Obs: Glossopharyngeal (IX) rottrådar kommer att vara synlig på den laterala kanten av hjärnstammen som en klipper varje successiva skiva, och dessa ger ett landmärke för rostro-kaudala avståndet till hjärnstammen neurala kretsarna nödvändig för rytm-generationen. På den ventrala delen av hjärnstammen, de hypoglossus rottrådar (XII) ska också synas något kaudalt mot klippa ansikte visar de IX rottrådar. En sista milstolpe blir obex (punkten i den mänskliga hjärnan som smalnar den fjärde ventrikeln för att bli den centrala kanalen av ryggmärgen) i dorsala ansiktet av hjärnstammen. Med dessa tre referenspunkter synliga, det rätta skärande planet är etablerad (se figur 6A) och ett rytmiskt aktiva segment uppnås på ett tillförlitligt sätt. - Fortsätta skära rostralt-till-kaudala tills de IX rottrådar är nära ytan av skurna ansiktet av hjärnstammen.
- Se figur 6 för sevärdheter och rätt orientering. Justera paraffin-plattan i vibratome klämman så att transection nästa vinkel kommer att skapa en liten ”kil” form för att skära skiva och skär skivor av cirka 100-200 µm tills de landmärken som beskrivs kan vara tydligt(figur 6).
Obs: Kapning detta liten kil ökar antalet XII motoriska nervceller fångas i segmentet och maximerar sannolikheten för att erhålla rytmisk aktivitet under inspelning. Med hjälp av landmärkena som beskrivs (rostralt rottrådar från glossopharyngeal nerv bunten, rottrådar från hypoglossus nerv bunten, obex) kommer att säkerställa att segmentet reproducibly innehåller åtminstone en stor del av pBC (figur 6B). - Skär en 300-500 µm bit av hjärnstammen från dessa rostralt neuroanatomiska markörer att fånga pBC och associerade överföring kretsar.
Obs: En ”ideal” skiva kommer att innehålla den mest rostralt rootlet av hypoglossus rootlet bunt att tillförlitligt erhålla inspiratorisk aktivitet utan att tillgripa ytan inspelningar med en sug elektrod över de rytm-generera/överföra loci inom den hjärnstammen.
5. Inspelningsprocedurer
- Placera segmentet i en inspelning kammare, BEGJUTA kontinuerligt med aCSF (0,5 - 1,0 mL/min) och använda sug eller extracellulära elektroder till befolkningen aktivitet från de XII rottrådar eller från pBC, XII PMNs eller XII motoneurons. För detaljerad inspelningsprocedurer, se tidigare publikationer på hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi och lapp fastspänning10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden presenteras här tillåter forskare intresserade av att erhålla rytmiskt aktiva skivor av hjärnstammen till reproducibly och tillförlitligt skär en livskraftig, robust bit som tillåter inspelning av fiktiva motoreffekt för många timmar. Alla minimalt nödvändigt neural kretselement för att skapa och överföra inspiratorisk rytm kan fångas i en tunn skiva med den här metoden. Dessa faktorer inbegriper: preBötzinger komplexet, premotor nervceller projicera till de hypoglossus motoriska nervcellerna (pXII MNs) och hypoglossus motoriska nervceller (XII MNs) och hypoglossus nerv rottrådar. Den pBC, XIIn och C4 nerv rottrådar används ofta för inspiratorisk rhythm recordings, som illustreras i figur 7.
Framgångsrik användning av detta förfarande kommer att producera en livskraftig och rytmiskt aktiva en bloc beredning i 10-15 min, eller ett rytmiskt aktiva segment i < 30 min. Efter isolering av klump hjärnstammen-ryggmärgen eller en tunn skiva räcker 15 min av Jämviktstiden i inspelning kammaren för tillverkning av fiktiva motoreffekt. När det gäller segmentet, kommer att ökar de extracellulära [K +] till ca 8-9 mM producera robusta neurala enhet som kan pågå i 24 till 36 h i detta laboratoriets erfarenhet. Preparatet bör kontinuerligt superfused med carbogenated (95% O2/5% CO2) och uppvärmd aCSF (~ 27 ° C). Framgångsrika dissektioner utförs snabbt och undvika klämmande, stretching, eller nerv rottrådar används för inspelningar. För optimalt resultat, alla stegen i proceduren utförs snabbt och vävnaden måste badas eller kontinuerligt perfusion med carbogenated aCSF när du utför den dissektion och vävnad isolering (enligt ovan). För omfattande information om neuroanatomi och precisa atlaser i hjärnstammen, se arbetet av Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 och kollegor. Det protokoll som presenteras här är en metod som har visat sig tillförlitligt i senior författarens laboratorium och detta betänkande ger en grafisk, steg för steg metod för att generera dessa skivor förlita sig endast på surface landmärken synliga på hjärnstammen eller inom den hjärnstammen som beskrivs här.
Figur 1 : Inledande dissektion för hjärnstammen-ryggmärgen utvinning. (A) Anesthetized pup nålas för dissektion. Streckade linjer visar snittet riktlinjer för sagittala snitt i huden och tvärgående snitt stjärtfenan till ögon och nedanför mellangärdet. (B) Guide för att ta bort hud och frambenen från djur. (C) dorsala aspekt flådda gnagare. Streckade visar linjer snittet riktlinjer för skallen-flap ”clamshell” exponering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Stadier av den dorsal laminektomi. (A) streckade linjer visar snittet riktlinjer för att ta bort storhjärnan. (B) resultat efter att ta bort vävnad. Streckade visar linjer snittet riktlinjer för dorsal laminektomi. (C) utsatt hjärnstammen-spinal cord efter dorsal laminektomi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Stadier av inledande ventrala dissektionen. (A) ventrala sida en flådda gnagare med avhuggna framhjärnan och buken. Streckade visar linjer snittet riktlinjer för att ta bort xyphoid processen och öppna bröstkorgen för att därefter ta bort buk och thorax kaviteten organ. (B) buk och thorax kaviteten organ bort. (C) orofaryngeal strukturer tas bort. Streckade visar linjer snittet riktlinjer för borttagning av hårda gommen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Stadier av den ventrala laminektomi. (A) hårda gommen och resterande skalle delar tas bort. Snitt riktlinjerna anger hur tar man bort återstående vävnaden som omger hjärnstammen-ryggmärgen. (B) första halskotan (C1) exponeras. (C) Demonstration på lyft C1 och att göra ett tvärgående snitt i ryggraden kroppen att ta bort den. Nerver är försiktigt skära spola till dorsala sidan av ryggraden kroppen innan du tar bort den. Detta är det mest kritiska steget i dissektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Beredning av hjärnstammen-ryggmärgen för skivning. (A) C1-C3 bort från ryggmärgen. Snitt riktlinjer visar var att kapa hjärnstammen-ryggmärgen från kaudala ryggmärgen. (B) ventrala sida av hjärnstammen-ryggmärgen med märkta nerv rottrådar. Snitt riktlinjer anges rekommenderade transection eller återstående rostralt strukturer på den ponto-medullär innan inspelning från regionen hjärnstammen-ryggmärgen. (C) Paraffin slab setup för skivning på vibratome. Skivning regionen omfattar vävnaden mellan kranialnerv IX och XII. Placera inte mikro-pins i regionen skivning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Sevärdheter användas för att få skivor med ett intakt hypoglossus motorn kärnan och PreBötzinger komplex. (A) Transverse vy av hjärnstammen-ryggmärgen efter första snittet har gjorts rostralt om de glossopharyngeal (IX) rottrådar. Snitt riktlinje anger transection nivå bara stjärtfenan till de hypoglossus (XII) rottrådar. (B) orientering av paraffin-block till blade innan skära en skiva som innehåller pBC och hypoglossus motorn kärnan. Skapa en Trapetsformat ”kil” shape cut maximerar sannolikheten för att fånga tillräckligt inspiratorisk nervceller i segmentet att erhålla rytmisk aktivitet under inspelning. Kilen kommer att omfatta pBC, hypoglossus premotor nervceller och de hypoglossus motoriska nervceller, som tillsammans ger den nödvändiga kretsen för att överföra rytmisk enhet, vilket är ett index för respiratoriska rhythmogenesis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Representativa inspelningar från sv bloc eller slice beredningar. (A) integrerade spår från XII rootlet. (B) integrerade spår från pBC. Inspelning från pBC kommer att använder en sv bloc förberedelse kräva en blind patch-clamp. (C) integrerade spår från den C4 nerv rootlet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anpassa protokollet presenteras här i ett eget block eller slice arbetsflöde är fördelaktigt för laboratorier och studier som skulle vilja utnyttja antingen klump hjärnstammen-ryggmärgen och/eller tunn skiva preparat för elektrofysiologi inspelningar. Metoden dissektion och skiva fram, kombinerat med metoder som tidigare rapporterats av andra17,18,19, kommer att möjliggöra reproducerbar förberedelse av robust och livskraftig vävnad som är allmänt anpassas till en rad experiment med hjälp av gnagare hindbrain eller ryggmärgen. Dissekering presenteras är mycket detaljerad och inkluderar rygg- och ventrala laminektomi samt omfattande information om läggning av hjärnstammen-ryggmärgen när du förbereder skär skivor. Detaljerade dissektion och skiva protokollet presenteras tillåter forskare att inkludera alla kretsar behövs för genererandet och sändandet av inspiratorisk rytm. De huvudsakliga neurala populationer/strukturer som kan fångas med den här metoden inkluderar: hypoglossus premotor nervceller, hypoglossus motorn kärnan och den komplexa preBötzinger. Observera att regioner av hjärnstammen som innehåller centrala CO2 sensorer eller exspiratorisk rytm-genererande kretsar (RTN/pFRG) inte ingår i förberedelserna detaljerad här20,21. När sv bloc beredning eller slice har erhållits, kan rytmisk aktivitet erhållas med sug elektroder, surface elektroder eller encelliga inspelning metoder såsom extracellulära enhet eller patch-fastspänning metoder3,10 ,11.
Målet med detta protokoll är att ge en tydlig och lätt-till-följa metod för att skapa antingen en hjärnstammen-ryggmärgen beredning eller ett tunt, rytmiskt aktiva segment. Detta protokoll bör vara värdefull för både erfarna och nya forskare som är intresserade av att införliva rytmiska hjärnstammen/slice preparat i sin arsenal, eftersom det finns flera kritiska steg redovisas inom de förfaranden som underlättar fångst av robust, reproducerbar och långvarig rytmiskt aktiva skivor.
När forskaren har blivit bekväm med identifiering av de anatomiska landmärkena och färdigheterna som krävs för dissektion, hastigheten av dissektion ökar, och förfaranden som kan optimeras för varje enskild utredare. Protokollet beskrivs här lärdes till senior författare (CGW) under hans postdoktorala arbete med Jeffrey Smith, upphovsman till den rytmiska hjärnstammen slice beredning3. För att säkerställa rytmisk aktivitet och livskraft i både skivor och sv bloc preparat, bör alla förfaranden för att generera en skiva vara klar inom ca 30 min från början av förfarandet till ett segment i inspelning kammaren. Med kontinuerlig perfusion, det finns mycket liten inverkan på vävnad lönsamhet men att minimera tiden för dissektion tillåter längre inspelning och datainsamling. För respiratoriska studier, ett segment som är lika tunn som cirka 280 µm tjocka3 kommer att ha rytmiska, robust inspiratorisk aktivitet, men skivor kan variera upp till 550 µm17,18,19,22. Försiktig praxis krävs för att utveckla den kompetens som krävs för att utföra den här proceduren och minimera variabiliteten i tjocklek och rostralt-kaudala positionen för varje skiva. Inklusive eller exklusive vissa cellpopulationer kommer påverka kvalitet och robusthet av rytmisk aktivitet som erhållits i senare inspelning eftersom både retande och hämmande kärnor i hjärnstammen kan påverka ”kvaliteten” på rytmen inspelade från segmentet 3.
Slutligen är det också viktigt att aCSF är beredda exakt enligt protokoll, och är på en standardiserad pH20, temperatur och syresättning nivå. Syrefria preparat kommer inte att rytmiskt aktiva och påverkar data collection21.
I området i närheten finns det flera viktiga steg i förfarandet som underlättar en utredare tillfångatagandet av livskraftiga och rytmiskt aktiva preparat. Under den ventrala laminektomi, hålla dorsala bröstkorgen intakt tillåter extra hävstång och ger mer vävnad för att säkra preparatet medan du utför relativt känslig isoleringen av hjärnstammen-ryggmärgen från kotpelaren. Dissekering steg som beskrivs här kan utredaren att enkelt producera sv bloc beredningar eller tunna skivor så, av nödvändighet, extra steg är detaljerade som kan utelämnas att få bara en tunn skiva. Andra användbara tips inkluderar, medan du utför den ventrala laminektomi, är det viktigt att få ett fast grepp på ryggraden kroppen att lyfta den uppåt medan bryta de nerv rottrådar. När hjärnstammen-ryggmärgen har dissekeras och extraherade, måste vara den dura mater och återstående vaskulatur dissekerade av ytan av neural vävnad. Blodkärl och dura är tuffa och kan hindra vibratome bladet från skära en ren skiva. Dissektion av dura är inte avgörande för sv bloc beredning, men rekommenderas att optimera nerv-sug elektrod koppling. Slutligen är noggrann och metodisk övning i användningen av vibratome krävs för att skära en rena, reproducerbara skiva. Detta protokoll ger en mycket omfattande lista med detaljerade anvisningar för dissektion och skärande förfaranden. Betoningen ligger här är att ge en steg för steg detaljerad lista för en utredare att använda som en pålitlig foundation och träningsverktyg som de kan ändra sina laboratoriets rutiner som behövs.
Som helhet utgör denna metod en trettio års utveckling av metoder för in vitro-elektrofysiologi. Omfattningen av denna uppsats fokuserar på standardisering av klump och skiva hjärnstammen-ryggmärgen inspelningar som vanligtvis används för att studera inspiratorisk aktivitet i P0-P5 råttor och möss22. Dock kan denna dissektion process utnyttjas inom en rad olika djur storlekar, åldrar och arter för en mängd olika studier, bland annat E18 råttor/möss neonatala råttor och möss (postnatal dagar 0 till 6) och vuxna möss. Framtida studier får använda de metoder som presenteras för att effektivisera protokoll över arter och åldrar, så att studier att förhöra mekanismer i rytm generation eller andra fysiologiska processen över både arter och åldrar. Slutligen, ändra orientering, tjocklek eller lokalisering av slice eller klump förberedelse kommer att påverka rytmisk aktivitet23. Omfattande litteratur har publicerats tidigare om neurala befolkningarna tillfångatogs av slice förfaranden och det finns stereotaxic råtta och mus atlaser tillhandahåller mer i detalj om den neurala kretsen diskuteras här24, 25,26. De förfaranden som presenteras här ger omfattande detalj med tydliga illustrationer som tillåter en ny utredare att lära sig skär rytmiska skivor från sevärdheter synlig under ett laboratorium dissekera omfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
S.B.P är en mottagare av en Loma Linda University sommaren Grundutbildning Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
