Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

Bu iletişim kuralı hem görsel olarak beyin-omurilik hazırlık iletişim kurar ve beyin sapı enine dilimleri hazırlanması kapsamlı adım adım bir şekilde açıklar. Bu tekrarlanabilirlik artırmak ve beyin solunum bölgelerinden sinir çıkış kayıt için uygun, uzun ömürlü, ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için tasarlanmıştır.

Abstract

Memeli inspiratory ritim inspiratory kasların ritmik kasılma sürüş bir sinyal üreten preBötzinger karmaşık denilen medulla (pBC), bir bölgede nöronal ağ üzerinden oluşturulur. Ritmik sinirsel aktivite pBC içinde oluşturulan ve nöronal havuzlarını solunum kas en bloc sinir kayıtları ve enine dilim kayıtları da dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak okudu sürücü için yapılır. Ancak, daha önce yayımlanmış yöntemleri yaygın beyin-omurilik diseksiyon işlem gelecekteki çalışmaları için şeffaf ve tekrarlanabilir bir şekilde tarif var değil. Burada, kapsamlı bir genel bakış tekrarlanarak ritmik aktif beyin sapı dilimleri oluşturma ve gönderme inspiratory sürücü için gerekli ve yeterli nöronal devreler içeren kesmek için kullanılan bir yöntem mevcut. Bu eser üzerine güvenilir pBC, hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), nöronal çıktısı kayıt için uygun ve ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için önceki beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolleri kurar ve hypoglossal motor nöronlar (XII MN). Sunulan iş önceki Yayınlanan yöntemleri XII rootlets içeren tüp bebek dilim tüm fare yavru, diseksiyon, ayrıntılı, adım adım çizimleri sağlayarak genişletir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beyin solunum neural ağ ritmik sinir ağları genel özelliklerini anlamak için verimli bir alan sağlar. Özellikle, nefes ve nefes ritim nasıl gelişir anlama yenidoğan kemirgen gelişiminde meselesi. Bu-ebilmek var olmak içinde vivo bütün hayvan pletismografisi, tüp bebek en bloc de dahil olmak üzere sinir kayıtları, çok düzeyli bir yaklaşım kullanarak yapılır ve tüp bebek dilim solunum ritmi jeneratör içeren kayıtları. İndirgemeci vitro tr blok ve dilim kayıtları için solunum rhythmogenesis ve kemirgenler geliştirme beyin-omurilik bölgedeki nöro çevrim arkasında mekanizmaları sorguya kullanılacak avantajlı bir yöntemi vardır. Gelişmekte olan solunum sistemi desen merkezi solunum1,2de dahil olmak üzere, ateş tarafından karakterize yaklaşık 40 hücre tipleri, içerir. Merkezi solunum ağ ritmik aktif nöron ventrolateral rostral medulla1,3' te yer alan bir grup içerir. Memeli solunum rhythmogenesis oluşturulan bir autorhythmic üzerinden olmuştur karmaşık preBötzinger lakaplı interneuron ağ (pBC), deneysel olarak lokalize yenidoğan memeli dilim ve en bloc hazırlıkları beyin-omurilik3,4,5,6,7,8kordonlar. Bu bölge merkezinde Sinoatriyal düğüm (SA) benzer bir işleve hizmet eder ve bir inspiratory zamanlama sistemi sürücü solunum için oluşturur. PBC inspiratory ritim (hypoglossal motor çekirdeğini de dahil olmak üzere) beyin sapı ve omurilik motor havuzları (örneğin diyafram sürücü frenik motor nöronlar)9diğer bölgelerinde yapılmaktadır.

Ritmik etkinlik elde edilebilir beyin omurilik tr bloku hazırlıklar veya hücre popülasyonlarının, C3-C5 sinir rootlets, XII sinir rootlets, dahil olmak üzere çeşitli dilimleri kullanarak hypoglossal motor çekirdeğini (XII MN), hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), ve pBC3,10,11,12. Bu yöntemler, veri toplama laboratuvarlar bir avuç arasında başarılı olmuş olsa da, birçok iletişim kurallarının tam olarak alan girerek yeni araştırmacılar için tekrarlanabilir bir şekilde sunulmaktadır değil. Uygun ve ritmik aktif tr blok ve dilim hazırlıklar alma diseksiyon ve dilim kesme protokol tüm adımlarda detaylara akut bir dikkat gerektirir. Önceki iletişim kuralları kapsamlı çeşitli kayıt yordamları ve Elektrofizyoloji tarif henüz eksikliği ayrıntılı olarak uygun doku hazırlık almak en önemli bölümüdür: beyin-omurilik diseksiyon ve dilim işlemi yapmadan.

Verimli bir ritmik-aktif ve uygulanabilir tr blok veya dilim hazırlık beyin-omurilik Elektrofizyoloji kayıtları alma gerektirir tüm adımların doğru dikkatli bir şekilde ve hızla gerçekleştirilmesi (genellikle, tüm prosedürü burada-ebilmek var olmak ilgili «««yapılır) yaklaşık 30 dk içinde. Kritik noktaları beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolünün değil daha önce de tarif edilmistir sinir rootlets ve vibratome Dilimleme ameliyat diseksiyon içerir. Kademeli ilk görsel olarak beyin-omurilik diseksiyon yeni araştırmacılar ve alanında uzman için iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı da iyice cerrahi teknikleri, simge ve gelecekteki araştırmacılar dilimleri ve en bloc hazırlıkları her deneyde istenen tam devre içerecek şekilde standartlaştırılması yardımcı olmak için diğer yordamları açıklar. Burada sunulan yordamları fare ve fare yenidoğan pups içinde kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki iletişim kuralı kabul ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Loma Linda Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. NIH yönergeleri için belgili tanımlık ahlaki muamele-in hayvan laboratuvarda yapılan tüm hayvan deneyleri takip edilmektedir. Bütün etik standartları bu protokolü gerçekleştiren kişiler tarafından onayladı.

1. çözümler

  1. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın.
    1. Taze aCSF akşam önce aşağıdakileri kullanarak 1 L gruplar halinde bir deneme hazırlamak tarifi: 7.250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0.5 mM), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1.0 mM) ve 5.410 g D-glukoz (30 mM), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 mM). Her zaman CaCl2 • 2 H2O son ekleyin.
    2. Bileşenleri deiyonize su 1 L geçiyoruz. 20-30 dk için karıştırın.
    3. ACSF pH ölçümü ve ayarlamak 7,40 ± 0,02 küçük birimleri kullanma (genellikle < 0.5 mL) seyreltik NaOH, KOH veya HCl.
      Not: Hazır aCSF (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) buzdolabında üç gün önce Bakteriyel büyüme canlılık dokusunun bir deney sırasında etkiler için saklanabilecek olan. Deneyler en fazla 36 saat sürebilir bu yana kirlenme mantar veya bakteri laboratuvarda mevcut azaltmak için 0.2 µm filtreleri kullanın. Verimlilik için açıklanan aCSF tarifi 4 L toplu işlemleri aynı protokol sonrası ölçekli ve bu birimin deneyler için en fazla üç gün sürecek.

2. diseksiyon ve Vibratome teçhizat hazırlanması

  1. Bıçak kadar ayarla.
    1. Bir vibratome üzerinde kesme doku için taze bir iki ucu keskin jilet kullanın. % 100 etanol bıçakla yıkama ve kesme veya bıçak ikiye yapışma ve bıçağın montaj içine ekleme vibratome üzerinde kelepçe önce deiyonize suyla durulayın.
    2. Bıçağın her zaman yeni bir doku hazırlık Dilimleme için vibratome üzerine monte veya parafin levha Dilimleme süre keser değiştirin. Herhangi bir parafin kalıntı da temiz bir şekilde yenidoğan sinir doku ile kesmek neredeyse imkansız hale getirecek.
  2. Parafin blok ayarlayın.
    1. Herhangi bir gömme tarzı parafin kullanın. Medya ısı dayanıklı cam kabı içinde katıştırma 10 g ve düşük ısı için Sıvı parafin boncuk eritmek için kullanın.
    2. Yaklaşık 0,5 g grafit tozu ve çözüm Sıvı parafin iyice ve düzgün karıştırın.
    3. Küçük bir plastik levha substrat parafin için kullanın. Plastik bir küçük (0.5 - 1 cm kalınlığında ve yaklaşık 2 x 2 cm2 geniş) parça kesip (polikarbonat veya alüminyum da kullanılabilir). Asthis parafin plastik bağlı kalır sağlayacaktır plastik içine bir makinistin dosyasını sıfırdan oluklar için kullanın.
      Not: Alternatif olarak, ısıtmalı 18 G Hipodermik İğne parafin-grafit karışımı plastik bağlıdır sağlamak için sayfa içine açılı delik eklemenizi sağlar.
    4. Bir pamuk uç aplikatör arka plastik parafin-grafit karışımı tekrar tekrar aplikatör erimiş parafin-grafit karışım içine daldırma, bulamaç plastik blok üzerine damlama ve parafin-grafit bina damla kullanın yaklaşık 1.5 cm kalınlığında plastik üzerine.
    5. Parafin-grafit mix yeterince kalın bir tabaka blok ödeme yapıldıktan sonra blok bir kenara serin ve beyin-omurilik sığması için şekli ayarlayın.

3. diseksiyon ve Neuraxis izolasyonu

  1. İlk diseksiyon ve anesthetization gerçekleştirmek.
    Not:
    bu çalışmada kullanılan hayvanlar aralığı boyutu embriyonik gün 18 (E18) Doğum sonrası günde 10-20 fare ya da sıçan E18 postnatal gün arasında değişen 5/6. Fareler veya herhangi bir zorlanma, tedavi veya cinsiyet fareler, deneysel tasarımına bağlı olarak kullanılabilir. İsoflurane (25 mL odasında 0.25 mL) kullanıldığı için anestezi ve duman başlık altında ön diseksiyon gerçekleştirin.
    1. Yavru fok tartmak ve 2 x 2 inç2 gazlı bez parçası yerleştirilir isoflurane 0.25 mL içeren bir anestezi odası yer. Hayvan (ayak çimdik yok para çekme refleks ile tarafından doğrulanmadı) anestezi cerrahi bir uçak ulaştıktan sonra PIN petri kabına hayvan parafin veya silikon elastomer ile dolu.
      Not: Yenidoğan kemirgen-da var anestezi cryoanesthesia13,14via, isoflurane buharlaşma15, veya enjeksiyon16 dengeli ile oksijen.
    2. Hayvan ventral haricinde yerleştirin ve bir ensizyon üzerinden hemen arkasında gözleri orta lomber bölgeye omurga, 10 ya da 11 numara neşter neşter ya da cerrahi makas ile yapmak. Cilt yansıtmak ve hayvan Paryetal/oksipital dikiş düzeyinde decerebrate (bkz. şekil 1) ve diyafram altında hayvan transecting deri kaldırmak. Sonra silah omuz eklemi de keserek makas veya bir neşter ile kaldırın.
    3. Bir kez cilt çıkarmak, hayvan bir perfüzyon odası silikon elastomerin daha fazla diseksiyon ve beyin-omurilik hazırlanması için alt ile aktarın.
    4. Bir aCSF rezervuar (500 mL yan-port şişe) sürekli olarak soğutulmuş (4 ° C ile pH 7,40 ± 0,02) kabarcık aCSF ve % 95'i O2 ve %5 CO2 ("carbogen" olarak da adlandırılır) karışımı ile oksijen. Diseksiyon sırasında soğutulmuş aCSF yalıtım beyin omurilik boyunca taze oksijenli aCSF sağlayan odası, düzenli olarak temizlemek için kullanın.
      Not: Kırmızı kan hücreleri kalan atar ve toplar damarlardaki görülebilir ve yeterince oksijenli, parlak kırmızı şunlardır.
    5. Sürekli oksijenli aCSF (bir stopcock, yaklaşık 0.5 - 1.0 mL/dk kullanarak bolus birim veya üzerinden yavaş damla) ile doku sıvı veya yerçekimi akış perfüzyon ile boru ve bir stopcock zaman zaman için kullanın. Bu doku havasını ve açık cerrahi bir alanı içerir.
    6. Aşırı sıvı vakum emme filtrasyon sistemi tarafından gerektiği şekilde kaldırın.
    7. Diseksiyon mikroskop kullanarak diseksiyon gerçekleştirin. Sürekli yakınlaştırma manken büyütme iyi ayarlanmasına izin ve faiz bölgenin en iyi görselleştirme her adımında diseksiyon sırasında izin vermek için tercih edilir.
      Not: Önerilen mikrocerrahi araçları dahil bir dizi dişli doku forseps, künt forseps, #5 forseps, açılı doku forseps, çeşitli mikro diseksiyon makası (Bahar makas) ve normal böcek ve mikro-anatomi pimleri.
    8. Beyin ile orta hat bölümünde kafatası sagittal dikiş boyunca maruz sonra mikro-anatomi pimleri ile yansıyan kanatları pin ve omurga 27 G kullanarak diseksiyon odası silikon kaplı altına Kaudal sonunda pin iğne.
      Not: Diseksiyon diğer doku ve kraniyal rootlets, beyin ve omurilik rootlets ritmik kurgusal çıktı alma maksimum izlenebilmesi için kullanılan Simgesel en net görünümünü sağlamak için diseksiyon mikroskop gerektirir. Diseksiyon orta bahar makas veya Iris makas ve iyi forseps kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  2. Derhal hayvan izole bagajında bir gazlı diseksiyon odasına aktar. Doku dorsal yan odasının ön bakan rostral sonunda ile (beyin) yerleştirin. PIN omuz ve omurilik en Kaudal sonunda doku.
    1. Parietal dikiş korteks ve kafatası temel beyin sapı zarar görmesini önlemek için aşağıdaki kafatası ile orta-sagittal bir kesi yapmak.
      Not: Yenidoğan kemik dokusu değil tamamen kireçlenme ve çok kırılgan. Kemik/doku bir dereceye kadar esnek ama çevreleyen bağ ve kas dokusu daha zor olacak.
    2. Oksipital dikiş sagittal dikiş başlayan ve yanal çalışma kafatası makasla kesme için orta bahar ya da Iris makas kullanın. Bu "flep" yansıyan ve kafatası rostral parçası çapa ve doku bazı istikrar sağlamak için pinned kafatası oluşturur ( Şekil 2Abakınız).
    3. Serebral korteksin diğerlerini kesmek kafatası flep yansıtan sonra beyincik (vermis) nispeten sağlam (Şekil 2B) Kaudal kısmını bırakarak.
  3. Dorsal laminektomi gerçekleştirin.
    1. Kafatası ve vertebral mikro bahar makas ve forseps kullanarak sütun çevreleyen kas kaldırın. Bu daha sonra omurilik hasarı olasılığını en aza indirgemek ventral laminektomi sırasında doku tutturmak tutturulmuş gibi göğüs kafesi dokunmadan göğüs kafesi sırt tarafındaki dokuyu.
    2. Dikkatli bir şekilde uzağa orta bahar makas veya iyi Iris makas kullanılarak vertebra lamina yanal süreçlerinin makasla kesme. Pons ve medulla örten doku Kes gitsin. Şimdi açıkça görülebilir (Şekil 2C) vermis, beyincik, pons ve spinal kord başlangıcı olacak.
  4. Ventral laminektomi gerçekleştirin.
    1. Doku dorsal tarafta sesini kısar ve göğüs kafesi ve en Kaudal omurga sonunda pin. Doku rostral tarafında kafatası kapakları (şekil 3A) kullanarak pin.
    2. Göğüs kafesi, göğüs kemiği ve aynı makas ve forseps kullanarak tüm karın organları gibi ventral yarısı kaldırın. Kaburga ve spinal kord (şekil 3B) teşhir kafesi bağlı uzak yumuşak doku incelemek.
    3. Dil, yemek borusu, nefes borusu, gırtlak ve tüm diğer yumuşak doku ve kas kafatası ve omurga ( şekil 3' teCgörüldüğü gibi) örten kaldırın.
    4. Zor palet örten doku incelemek. Sert yüzey (şekil 3C) üzerinde bir şekil V girinti ile kafatasının, kemik bir dikdörtgen tabak bularak tanımlayın. Damak orta çizgi kesmek, dikkatli bir şekilde yukarı doğru kaldırın ve (şekil 4A) kaldırmak için kesilmiş bir enine gerçekleştirmek.
    5. Ventral laminektomi ventral yüzeyinden beyin sapı ve omurilik ilk servikal omur yaklaşık torasik vertebra 7 (T7) için şekil 4' teBgörüldüğü gibi açığa lamina kaldırarak başlayın.
    6. Bu aşamada, ventral rootlets görünür hale gelir. Küçük mikro-diseksiyon veya bahar makas kullanılarak, kesim lamina gibi yakın ve uzak kökleri köken olarak mümkün olduğunca spinal kord, yapmak dikkat çekmek; kökleri germe kaçının.
    7. Her iki omurga boyunca 5-10 mm lamina makasla kesme. Çok yakın omurilik veya vertebra kesmeyin. Bu adımı servikal vertebra omurilik ortaya çıkarmak için izin verir. Rootlets kesme önlemek.
    8. Rootlets yaklaşık 20-25 mm (bilateral) omurga (yaklaşık T7) makasla kesme. Bu yordam boyunca omurilik içine kesme önlemek ve şekil 4' teCgörüldüğü gibi omurga kenarlarını işlemek.
    9. C1, C2 ve C3 dikkatle rostral kenarına her vertebra kaldırma ve yakından altında kemik kırpma çıkarın. Kemik kesme yapılır ki, ne kadar uzun rootlet yakın. Kullanım çengel veya forseps kesim (şekil 4C) yaparken her servikal vertebra sağlam bir tutuş elde yardımcı olmak için eğildi.
    10. Spinal kord istenilen uzunluğa izole ve vertebral sütundan disseke sonra spinal kord (şekil 5A ve şekil 5B) kaldırmak için bir çapraz kesim yapmak.
  5. Dura mater kaldırın.
    Not:
    daha önce açıklanan3,7olduğu gibi izole beyin-omurilik-ebilmek var olmak kullanılmış en bloc tüp bebek kayıt için. Vertebral sütundan kaldırıldı beyin-omurilik ile dura kesim kafatası ve omurga kayıtları gerçekleştirmek emme elektrotlar için optimal erişim rootles sağlamak için kaldırılması gerekir. Ayrıca, beyin zarı çıkarılması temiz bir şekilde beyin dilim ve tüp bebek kayıt için ritmik etkin ince dilimler elde etmek olanak sağlar.
    1. Dikkatli bir şekilde izole beyin-omurilik altında doku dorsal tarafta kadar beyin çevreleyen dura erişmesine izin vermek için kordon PIN (şekil 5B) rootles. İğne, beyin sapı, XII rootlets rostral yanal marjı ile uygulanmalıdır.
    2. Beyin zarı beyin dorsal yüzeyinden ince forseps (#5) ile dura kaldýrarak çýkarýn dura dorsal kenar boşluğunda ve lateral medial beyin uzunluğu boyunca güzel bahar makasla kesme. Beyin sapı kendisi içine kesme önlemek için dikkatli olun. Yavaşça damarlar beyin sapı yüzey kaldırın ve beyin sapı kesit vibratome bıçak engel önlemek için kesti.
    3. Kranial sinir rootlets dura geçmek ve beyin zarı kaldırdı kolayca uzağa yırtılmış gibi dikkatle dura beyin sapı, medial ve lateral açıdan incelemek. Yavaşça onları küçük bahar makasla keserek çıkardı rootlets olasılığını en aza indirmek.
    4. Beyin-omurilik fiske vurmak böylece yukarı dönük menfez yüzey ve kraniyal rootlets açıkça izlenebiliyor. Beyin dorsal tarafta dura doğrudan alan postrema rostral Kaudal için kesme, üzerine hafifçe dura kaldırarak incelemek. Alan postrema bu bölge Ventriküler microcapillaries çok sayıda nedeniyle biraz pembe görünür.
    5. İyi bir böcek PIN uzak kalan herhangi bir dura alay ve kafatası ve servikal rootlets yakın kalan kan damarları kaldırmak için kullanın.

4. dilim Protokolü

  1. Beyin zarı kaldırdıktan sonra beyin sapı (bundan sonra "kesme taşı" olarak anılacaktır) plastik blok parafin platformda ortasına yerleştirin. Beyin sapı ile en fazla 1 cm uzunluğunda şekil 5' teCgösterildiği gibi kesilmiş iyi böcek iğne kullanarak distal spinal kord Kaudal sonu pin.
  2. Şekilde bıçak dik beyin rostral yüzünü keser parafin kaplı kesme blok vibratome blok tutucu sabitlenmiş beyin sapı ile hizalayın.
  3. Düzensiz, yabancı dokuyu rostral en ucunda bir ilk dilim olun. Bu ilk kesik 200-300 µm genellikle ama dikkatle önlemek IX, X ve XII kraniyal rootlets kaldırılması olabilir. Bu adım genellikle yüz çekirdeği (VII) ve glossopharyngeal rootlets Kaudal ölçüde ortaya çıkaracaktır ve yüzünü par-vibratome bıçak düzlemsel böylece beyin hizalamak olanak sağlar. Par-planarity sağlamak ve düzensiz doku kaldırmak için küçük kesim yapmak için gerekli küçük ayarlamalar yapmak.
    Not: Glossopharyngeal (IX) rootlets bir birbirini izleyen her dilim keser ve bu ritim-üretimi için gerekli beyin sapı nöro çevrim rostro Kaudal uzaklık için bir dönüm noktası sağlamak gibi beyin yan kenarında görünür. Beyin ventral tarafta hypoglossal rootlets (XII) da görünür olması gereken biraz Kaudal IX rootlets gösterilen kesilmiş yüz. Son bir dönüm noktası obex (hangi dördüncü ventrikül omurilik Merkezi kanal olmak için basit bir şey insan beyni noktasında) beyin dorsal yüzünde olacak. Bu üç referans noktaları ile görünür, doğru kesme uçak (bkz. şekil 6A) kurulmuş ve ritmik aktif dilim güvenilir bir şekilde elde edilir.
  4. IX rootlets beyin sapı kesilmiş yüz yüzey olana kesme rostral-için-Kaudal devam.
  5. Şekil 6 simge ve doğru yönlendirme için bakınız. Transeksiyon sonraki açısını kesme dilim için çok hafif "kama" şekil oluşturma ve açıklanan yerlerinden olana kadar yaklaşık 100-200 µm dilimler kesip vibratome kelepçe içinde parafin levha ayarlayın (şekil 6A) açıkça görüldü.
    Not: Bu hafif takoz kesme XII motor nöronlar dilimi yakalanan sayısını artırır ve ritmik aktivite kayıt sırasında elde etme olasılığını en üst düzeye çıkarır. İşaretlerini kullanarak açıklanan (glossopharyngeal sinir demeti, rootlets üzerinden hypoglossal sinir demeti, obex rostral rootlets) dilimi tekrarlanarak pBC (şekil 6B) en az bir büyük bölümünü içeren sağlayacaktır.
  6. PBC yakalamak için bu rostral nöroanatomik işaretleri beyin sapı 300-500 µm dilim kes ve iletim devresi ilişkili.
    Not: "İdeal" bir dilim en rostral rootlet güvenilir bir şekilde ritim-oluşturma/vericisi loci içinde üzerinde emme bir elektrot kullanarak yüzey kayıtları için başvurmadan inspiratory etkinlik elde etmek için hypoglossal rootlet paket içerir Beyin sapı.

5. kayıt işlemleri

  1. Dilimi bir kayıt odasında, sürekli olarak aCSF (0.5 - 1.0 mL/dk) ile sıvı ve emme veya hücre dışı elektrotlar kayıt nüfus etkinliği için XII rootlets veya pBC, XII PMNs veya XII motoneurons kullanın. Detaylı kayıt işlemleri, önceki yayınları bkz: beyin-omurilik Elektrofizyoloji ve sıkma10,11yama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada sunulan yöntemi bir araştırmacı baktılar tekrarlanarak ve güvenilir bir şekilde kurgusal motor çıkış kaydı saatlerce sağlayacak uygun, sağlam bir dilim kesmek için beyin sapı ritmik etkin dilim elde sağlar. Üreten ve inspiratory ritim gönderme için en az gerekli nöral devre öğeleri bu yöntemi kullanarak bir ince dilim yakalanabilir. Bu öğeleri şunları içerir: preBötzinger kompleksi, premotor nöronlar hypoglossal motor nöronlar (pXII MNs) projelendirme ve hypoglossal motor nöronlar (XII MNs) ve hypoglossal sinir rootlets. PBC, XIIn ve C4 sinir rootlets yaygın olarak kullanılan inspiratory ritim kayıtları için Şekil 7' de gösterildiği gibi.

Bu yordamın başarılı kullanımı 10-15 dk uygun ve ritmik aktif tr bloku hazırlanmasında veya bir ritmik aktif dilim üretecek < 30 dak. Sonra yalıtım en bloc beyin-omurilik veya ince bir dilim 15dk denge kayıt odasında kurgusal motor çıkış üretimi için yeterlidir. Dilim durumunda, hücre dışı [K +] yaklaşık 8-9 mm artan bu laboratuvar 's deneyim 24-36 h sürebilir sağlam sinir sürücü üretecektir. Hazırlık-meli var olmak carbogenated (% 95'i O2/5% CO2) ve ısıtmalı aCSF ile sürekli superfused (~ 27 ° C). Başarılı diseksiyonlarının hızla gerçekleştirilir ve pinching, germe veya kayıtları için kullanılan sinir rootlets zarar önlemek. En iyi sonuçlar için yordamda tüm adımlar hızla gerçekleştirilir ve doku banyo veya sürekli carbogenated aCSF ile diseksiyon ve (yukarıda açıklandığı gibi) doku yalıtım gerçekleştirirken periosteum. Ruangkittisakul ve ark.13,14, Ballanyi15 ve meslektaşları çalışmalarını Nöroanatomi ve hassas atlaslar, beyin ile ilgili geniş bilgi için bakınız. Burada sunulan Protokolü kıdemli yazarın laboratuvarda güvenilir kanıtlamıştır bir yöntemdir ve bu raporu sadece yüzey yerlerinden beyin üzerinde veya içinde görünen üzerine güvenerek bu dilimler oluşturmak için bir grafik, adım adım yöntem sağlar Beyin sapı olarak burada ayrıntılı.

Figure 1
Resim 1 : İlk diseksiyon beyin-omurilik çıkarılması için. (A)Anesthetized yavru tutturulmuş diseksiyon için. Kesi yönergeleri için cilt içine sagittal kesik kesik çizgilerle gösterilir ve enine gözleri ve diyafram altında Kaudal keser. Cilt ve forelimbs hayvandan kaldırmak için (B) Kılavuzu. (C) Dorsal yönü tenli kemirgen. Kafatası-flep "kapaklı" maruz kesi ilgili kurallara kesik çizgilerle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Dorsal laminektomi aşamaları. (A)kesik çizgilerle gösterilir cerebrum kaldırmak için kesi yönergeleri. (B) sonucu doku çıkardıktan sonra. Kesikli çizgiler dorsal laminektomi için kesi yönergeleri gösterir. (C) Exposed beyin-omurilik kordon sırt laminektomi takip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : İlk ventral diseksiyon aşamaları. (A)Ventral yan kesik ön ve karın derisi yüzülmüş bir kemirgen. Kesikli çizgiler xyphoid işleminin kaldırılması ve daha sonra karın ve göğüs boşluğuna organları kaldırmak için göğüs kafesi açılış kesi yönergeleri gösterir. (B) karın ve göğüs boşluğuna organları kaldırıldı. (C) Oropharyngeal yapıları kaldırıldı. Sert yüzey Temizleme için kesi kurallar kesik çizgilerle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Ventral laminektomi aşamaları. (A)sert yüzey ve kafatası parçaları kaldırıldı kalan. Kesi yönergeleri kalan doku beyin omurilik çevreleyen kaldırmak nasıl belirtin. (B) ilk servikal vertebra (C1) maruz. C1 kaldırma ve vertebra gövdesi enine bir kesim yapmak çıkarmak için dahili (C) gösteri. Sinirler dikkatle dorsal kenarda vertebra vücudun kaldırmadan önce floş kesilir. Bu diseksiyon en önemli adımıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 5
Şekil 5 : Beyin-omurilik hazırlanması için dilimleme. (A)C1 C3 omurilik kaldırıldı. Kesi yönergeleri beyin-omurilik Kaudal omurilik üzerinden koparmaya nerede gösterir. (B) beyin-omurilik etiketli sinir rootlets ile Ventral tarafında. Kesi yönergeleri önerilen transeksiyon veya rostral yapılara ponto-medüller beyin-omurilik bölge kaydından önce kalan gösteriyor. (C) parafin levha üzerinde vibratome Dilimleme için Kur. Dilimleme bölgesi, kranial sinirler ve IX XII arasındaki doku içerir. Mikro-pins Dilimleme bölgesine koymayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 6
Şekil 6 : Dilimleri bir sağlam bir hypoglossal motor çekirdeği ve PreBötzinger kompleks ile elde etmek için kullanılan simge. (A)ilk kesme glossopharyngeal (IX) rootlets rostral yapıldıktan sonra beyin-omurilik enine görünümünü. Kesi kılavuz hypoglossal (XII) rootlets sadece Kaudal transeksiyon düzeyini gösterir. PBC ve hypoglossal motor çekirdeğini içeren bir dilim kesme önce (B) yönünü parafin blok Blade. Bir yamuk "kama" şekil kesim oluşturma ritmik aktivite kayıt sırasında elde etmek için dilim inspiratory yeterli nöronlarda yakalama olasılığını en üst düzeye çıkarır. Kama pBC, hypoglossal premotor nöronlar ve hypoglossal motor nöronlar, topluca solunum rhythmogenesis dizinidir ritmik sürücü iletmek için gerekli devresi sağlar içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Tr blok veya dilim hazırlıklar temsilci kayıtları. (A)XII rootlet entegre izleme. PBC (B) entegre izleme. PBC kayıt bir tr bloku hazırlık kullanarak bir kör yama kelepçe gerektirecektir. (C) entegre izleme C4 sinir rootlet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokol adapte burada sunulan bir tr blok veya dilim iş akışı laboratuarlar için avantajlıdır ve ya en bloc beyin-omurilik kullanmak ve/veya ince istiyorum çalışmalar Elektrofizyoloji kayıtları için hazırlıklar dilim. Diseksiyon ve dilim yöntem sundu, daha önce başkaları tarafından rapor yöntemleri ile birlikte17,18,19, tekrarlanabilir hazırlanması için bir dizi yaygın olarak uyarlanabilir sağlam ve uygun doku sağlayacak kemirgen arka beyin ya da omurilik kullanarak deneyler. Sunulan diseksiyon son derece ayrıntılı ve dilimler kesip hazırlanırken dorsal ve ventral laminektomi hem de beyin omurilik yönünü ile ilgili ayrıntılı bilgi içerir. Sunulan detaylı diseksiyonu ve dilim protokolü tüm devre üretimi ve iletimi inspiratory ritim için gerekli dahil etmek araştırmacı sağlar. Ana sinir nüfus/bu yöntemi kullanarak yakalanan yapıları içerir: hypoglossal premotor nöronlar, hypoglossal motor çekirdeğini ve karmaşık preBötzinger. Merkez CO2 sensörleri veya Ekspiratuar ritim üreten devreler (RTN/pFRG) içeren beyin bölgelerinde hazırlık dahil değildir Not burada20,21ayrıntılı. Tr bloku hazırlanması veya dilim elde sonra ritmik etkinlik, emme elektrotlar, yüzey elektrotlar veya hücre dışı birim veya yama sıkma yöntemleri3,10 gibi tek hücreli kayıt yöntemleri kullanarak temin edilebilir ,11.

Bu iletişim kuralı bir beyin-omurilik hazırlık ya da ince, ritmik aktif bir dilim oluşturmak için açık, takip etmek kolay bir yöntem sağlamak için hedeftir. Birkaç önemli adımlar yakalanması kolaylaştırmak yordamlar içinde ayrıntılı olarak bu iletişim kuralı için hem deneyimli hem de yeni araştırmacılar kendi armamentarium ritmik beyin sapı/dilim hazırlıkları birleşmeyle baktılar değerli olmalıdır sağlam, tekrarlanabilir ve uzun ömürlü ritmik etkin dilimleri.

Araştırmacı anatomik yerler ve diseksiyon için gerekli becerileri ile rahat haline gelmiştir sonra diseksiyon hızını artıracak ve yordamları için tek tek her araştırmacı optimize edilebilir. Burada ayrıntılı Protokolü Jeffrey Smith, ritmik beyin sapı dilim hazırlık3yaratıcısı ile doktora sonrası yaptığı çalışma sırasında üst düzey yazar (CGW) öğretildi. Ritmik etkinlik ve canlılık dilimleri ve tr bloku hazırlıklar emin olmak için bir dilim oluşturmak için tüm yordamları yaklaşık 30 dakika içinde başından yordamın kayıt odasında bir dilim için bitmiş olmalıdır. Sürekli perfüzyon ile doku canlılığı üzerinde çok az etkisi yoktur ama diseksiyon süre en aza indirilmesi uzun kayıt ve veri toplama sağlar. Solunum Etütler yaklaşık 280 µm kalınlığında3 ince bir dilim ritmik, sağlam inspiratory etkinlik olacak ama dilimleri ilâ 550 µm17,18,19,22Aralık. Dikkatli pratik bu yordamı gerçekleştirmek ve değişkenlik kalınlığını ve Kaudal rostral her dilimin konumunu en aza indirmek için gerekli becerileri geliştirmek için gereklidir. Dahil veya belirli hücre popülasyonlarının hariç kalite ve sağlamlık ritmik faaliyet eksitatör ve inhibitör çekirdeği beyin içinde "dilimden kaydedilen kalitesini" ritim etkisi olabilir gibi daha sonra kayıt elde etkiler 3.

Son olarak, bu da o aCSF tam olarak protokole göre hazırlanır ve bir standart pH20, sıcaklık ve oksijen düzeyde önemlidir. Anoksik ürünleri ritmik etkin olmayacak ve veri koleksiyon21etkiler.

Uygun ve ritmik aktif hazırlıkların bir araştırmacı yakalama kolaylaştırmak birkaç anahtar adım yordam vardır. Ventral laminektomi sırasında dorsal göğüs kafesi olduğu gibi tutmak ekstra kaldıraç sağlar ve oldukça hassas yalıtım beyin omurilik vertebral sütundan gerçekleştirirken hazırlık güvenliği için daha fazla doku sağlar. İnce bir dilim almak için izin veren burada ayrıntılı adımları kolayca üretmek en bloc hazırlıklar veya elzem, ek adımlar Yani ince dilimler için araştırmacı bu ayrıntılı diseksiyon atlanabilir. Diğer yararlı ipuçları içerir, ventral laminektomi yaparken sıkı vertebra vücuttaki sinir rootlets kesilmesinin ise yukarı doğru Kaldır kazanmak önemlidir. Bir kez beyin omurilik disseke ve hulâsa, dura mater ve kalan damarlara sinir dokusu yüzeyi kapalı disseke gerekir. Kan damarları ve dura sert ve vibratome bıçak temiz bir dilim kesme önleyebilirsiniz. Beyin zarı diseksiyon tr bloku hazırlık için çok önemli değil ama sinir soğurma elektrot kaplin optimize etmek için tavsiye edilir. Son olarak, vibratome kullanımında dikkatli ve sistemli pratik bir temiz, tekrarlanabilir dilim kesim için gereklidir. Bu iletişim kuralı diseksiyon ve kesme işlemleri için ayrıntılı adımlar çok kapsamlı bir listesini sağlar. Vurgu burada bir güvenilir Vakfı ve eğitim aracı hangi onlar onların Laboratuvarı yordamları gerektiği gibi değiştirebilirsiniz kullanmak için bir dedektif için adım adım ayrıntılı bir liste sağlamaktır.

Bir bütün olarak, bu yöntem bir otuz yıllık yöntemlerinden birini tüp bebek Elektrofizyoloji devrim niteliğindedir. Bu kağıt kapsamını en bloc standardizasyon üzerinde odaklanır ve genellikle P0-P5 sıçanlar ve fareler22inspiratory etkinlik eğitimi için kullanılır beyin-omurilik kayıtları dilim. Ancak, bu diseksiyon işlem hayvan boyutları, yaş ve türler için çalışmalar, E18 fareler/fareler, Yenidoğan sıçanlar ve fareler (doğum sonrası gün 0-6) ve yetişkin fareler de dahil olmak üzere çok çeşitli bir dizi genelinde yararlı. Gelecekteki çalışmalar türler ve Çağlar, üzerinden iletişim kuralları hızlandırmaya yönelik çalışmalar mekanizmaları ritim üretimi veya diğer fizyolojik süreç türler ve Çağlar sorguya izin sunulan yöntemleri kullanabilir. Sonuçta, oryantasyon, kalınlık veya konumunu dilimin veya en bloc değişen hazırlık ritmik etkinliği23etkileyecektir. Geniş edebiyat geçmişte yayımlanan sinirsel nüfus ile ilgili dilim yordamlar tarafından yakalanan ve orada stereotaksik fare ve fare atlaslar nöro çevrim ile ilgili daha ayrıntılı ele burada24, sağlamak için kullanılabilir 25,26. Burada sunulan yordamları kapsam anatomi bir laboratuvar altında kolayca görünür yerlerinden gelen ritmik dilimler kesip öğrenmek için yeni bir dedektif izin net resimli ayrıntılı bilgi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

S.B.P bir Loma Linda Üniversitesi yaz lisans araştırma bursu bir alıcı var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
  10. Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. e53071 (2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Inc. (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Inc. (2008).
Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter