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Neuroscience

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

Abstract

In-vitro- Autoradiographie zielt darauf ab, die anatomische Verteilung eines Proteins des Interesses an Gewebe von Versuchstieren sowie Menschen zu visualisieren. Die Methode basiert auf die spezifische Bindung von Radioligand zu seinem biologischen Ziel. Daher sind gefrorene Gewebeschnitte mit Radioligand Lösung inkubiert und die Bindung an das Ziel später lokalisiert ist durch den Nachweis des radioaktiven Zerfalls, z. B. mithilfe von lichtempfindlichen Film oder Phosphor imaging-Platten. Daraus resultierende digitale Autoradiograms zeigen bemerkenswerte räumlichen Auflösung, der Quantifizierung und Lokalisierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen ermöglicht. Darüber hinaus erlaubt die Quantifizierung für die pharmakologische Charakterisierung von Liganden Affinität durch Dissoziation konstanten (K-d), Hemmung konstanten (Kich) sowie die Dichte der Bindungsstellen (Bmax) in ausgewählten Geweben. So bietet die Methode Informationen über Ziel Lokalisierung und Liganden Selektivität. Hier ist die Technik mit autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren Gewebe, mit besonderem Schwerpunkt auf methodische Überlegungen bezüglich der verbindlichen Test beispielhaft dargestellt Parameter, die Wahl der Radioligand und das Nachweisverfahren.

Introduction

Autoradiographie ist eine Methode, die Bilder des radioaktiven Zerfalls liefert. Die Technik wird routinemäßig eingesetzt, um die Gewebeverteilung eines Proteins des Interesses in Vitro basierend auf eine spezifische pharmakologische Interaktion zwischen einer radioaktiv Verbindung und ihr Ziel zu studieren. Dies bietet direkte Informationen über die Selektivität des Liganden für das Ziel. In-vitro- Autoradiographie kann auch verwendet werden, für die quantitative Bestimmung der pharmakologischen Bindungsparameter von Radioligands, wie z. B. die Dissoziationskonstante (K-d) und die Dichte der Bindungsstellen (Bmax), sowie für die Bestimmung die Hemmung-Konstante (Ki) von konkurrierenden Liganden1,2. Im Vergleich zu traditionellen Homogenat Radioligand Bindung, hat Autoradiographie den Vorteil des Seins in der Lage, räumliche Anatomie zu visualisieren und prägnante Angabe der regionalen Ausdruck Muster3. Die Methode der Autoradiographie ist daher eine entsprechende Alternative zu Immunocytochemistry, insbesondere in der Abwesenheit eines validierten Antikörpers. Autoradiographie ist in einem standard Radioisotop Labor angesichts der Verfügbarkeit von geeigneten Radioligand mit der erforderlichen pharmakologischen Spezifität, Zugriff auf ein Mikrotom Kryostat für die Zubereitung von Gewebeschnitten und eine geeignete Imaging einfach umsetzen. Gerät, das die Verteilung der Radioaktivität in den jeweiligen Gewebeschnitten analysieren kann. Bemerkenswert ist, ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Radioligand eine begrenzte Menge an Bindung an Nichtziel-Seiten. Dies kann an andere Proteine, Membranen oder Materialien wie Kunststoff oder Filter, und ist gemeinsam als unspezifische Bindung bezeichnet. In der Regel kann unspezifische Bindung ist nicht Humanserumproteine aber Humanserumproteine wenn es handelt sich um ein bestimmtes Ziel-Protein. Der beste Weg der Validierung wahre spezifische Bindung ist vergleichbar zu den Geweben fehlt das Ziel, z.B.genetisch (Knock-out) Gewebe4entwickelt.

Hier ist die Methode mit der autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität Bindungsstelle für γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) in das Gehirn von Säugetieren illustriert. Verständnis der pharmakologischen Wechselwirkung zwischen GHB und seine Bindungsstelle ist von Bedeutung, da GHB sowohl ein klinisch nützlich Medikament in der Behandlung von Narkolepsie und Alkoholismus5, sondern auch ein natürlicher Bestandteil der das Gehirn von Säugetieren und ein Erholungs-ist Droge-6. Hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden erstmals über [3H] GHB Bindung an Ratte Gehirn Homogenat7beschrieben. Im Laufe der Jahre weitere Autoradiographie Studien mit [3H] GHB und die analoge [3H] NCS-382 zeigte eine hohe Dichte an Bindungsstellen im Vorderhirn Regionen Ratte8,9,10, Maus9 ,11und Affe/Mensch Gehirn12Schwein. Jedoch blieben die molekulare Identität und genaue funktionelle Relevanz der diese Bindungsstellen schwer fassbaren.

Mit der Absicht, weiter die Bindungsstellen charakterisieren, und Studien über die physiologische Rolle von GHB zu erleichtern, wurden mehrere Radioligands mit verschiedenen Isotopen, ausgestattet mit verschiedenen Affinitäten entwickelt ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA und [125ich] BnOPh GHB)13,14,15,16(rezensiert in17) (Abbildung 1). Die Kombination von selektiven High-Affinity Radioligands und eine sehr hohe Gewebe Dichte der Bindung, die Standorte für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bilder mit den Phosphor imaging Technik9,11erlaubt haben. Zusammen mit einen Überblick über die praktischen Punkte bei der Einrichtung ein autoradiographischen Experiment und eine Illustration zu Details zu veranschaulichen wird die Diskussion Abschnitt (i) die Wahl des Radionuklids, (Ii) die Wahl der Assay-Bedingungen und (Iii) die Verwendung von Phosphor betonen. Bildplatten versus Röntgenfilm. Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, die wissenschaftlichen, technischen und methodischen Details auf die Autoradiographie Technik zur Verfügung, für die Information über Gewebeverteilung und pharmakologische Analyse von Protein-Targets.

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Protocol

Alle Tier Handhabung wurde nach den Richtlinien von der dänischen Tier Experimente Inspektion durchgeführt.

Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll deckt Gewebe Vorbereitung (d.h.Maus Hirngewebe), die in-vitro- autoradiographischen Assay ausreichend detailliert für den Aufbau der Methode in ein neues Labor, die Exposition gegenüber Phosphor imaging-Platten sowie anschließenden densitometrischen Analyse der Autoradiograms (Abbildung 2) mit dem Ziel der Lokalisierung und Quantifizierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen. Bei histologischen dagegen ist ein Protokoll für Cresyl violette Färbung enthalten. Darüber hinaus ist die Bestimmung der unspezifischen Bindung mit einer konkurrierenden Liganden in das Protokoll aufgenommen. Für eine detaillierte Beschreibung zur Bestimmung von K-d, Bmax oder Kichsiehe vorherige Veröffentlichung4.

(1) Gewebe Vorbereitung von Kryoschneiden

  1. Einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation und sofort das Gehirn mit Schere und Pinzette zu sezieren. Gehen Sie direkt zum nächsten Schritt, um Gewebeschäden zu vermeiden.
  2. Snap-Einfrieren des Gewebes durch Untertauchen in Pulverform Trockeneis, gasförmigen CO2 oder Isopentane. Direkt transfer gefrorene Gewebe nach einem Kryostaten mit Temperatur bis-20 ° C. Alternativ lagern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zur Verarbeitung.
    Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen/Einfrieren um Gewebeschäden zu reduzieren.
  3. Lassen Sie das Gewebe auf-20 ° C in den Kryostaten für 20 min zu akklimatisieren, vor der Weiterverarbeitung um erschütternde Gewebe zu vermeiden.
  4. Decken Sie die Gewebe-Halter mit einbetten Medium außerhalb des Kryostaten ab und platzieren Sie die gefrorenen Gewebeprobe schnell in der gewünschten Richtung zu, während das einbettende Medium noch flüssig ist. Platzieren Sie zum Beispiel das Gehirn der Maus vertikal auf Kleinhirn um rostral koronalen Abschnitte zu erreichen. Transfer des Gewebe-Halters zurück zu den Kryostaten und entlarven einbetten Mittel-und Temperaturen unter-10 ° C zum Härten.
    Hinweis: Fragile Gewebeprobe sollte bei Einbettung Medium innerhalb der Gewebe Formen vor der Montage beschichtet werden.
  5. Position der Gewebe-Inhaber im Mikrotom des Kryostaten. Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes, schräge Abschnitte zu vermeiden.
  6. Schneiden Sie das Gewebe mit der Leitung einer stereotaktischen Atlas18 in Abschnitten der gewünschten Stärke (12 µm empfohlen für [3H] gekennzeichnet Liganden). Sorgfältig zu begradigen Sie und entfalten Sie Abschnitt mit einer Bürste von kleiner Größe zu, wenn nötig und Tauwetter-Mount Abschnitt auf einen Objektträger. Sammeln Sie nacheinander in den Abschnitten aus der Region von Interesse für die gewünschte technische Replikation (z.B. 4 Abschnitte pro Folie).
  7. Die Abschnitte auf den Folien für 1 h an der Luft trocknen vor der weiteren Bearbeitung zu ermöglichen.
    Hinweis: Zugabe von Trockenmittel, Dia Boxen minimiert Feuchtigkeit auf die Gewebeschnitte aufbauen. Alternativprodukt kann hier angehalten werden, durch die Speicherung Abschnitte langfristige in Folie Boxen bei-80 ° C.

2. in-vitro- Autoradiographie

Vorsicht: Radioaktivität. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Labor gemäß den örtlichen Bestimmungen. Tragen Sie Schutzkleidung. Gemäß den radioaktiven Zerfall entsorgen oder an ein zertifiziertes Unternehmen auslagern.

  1. Tauen Sie die Abschnitte für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT). Beschriften Sie die Folien mit experimentellen Bedingungen. Benutzen Sie einen Bleistift, da die Folien in Ethanol während der anschließenden Färbung gebadet werden.
  2. Legen Sie die Folien horizontal in Kunststoffschalen.
    Hinweis: Dias auf einer erhöhten Plattform in Kunststoffschalen Positionierung erleichtert ihre Handhabung.
  3. Pre-incubate bereinigt die Abschnitte auf den Folien in Testpuffer montiert zum Ziel in Frage (GHB Protokoll, 50 mM KHPO4 Puffer pH 6.0 verwendet wird) durch sorgfältige Anwendung eine angemessene Lautstärke auf der Folie (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4).
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist.
    1. Decken Sie die Kunststoff-Schalen mit Deckel zur Vermeidung von Verdampfung und inkubieren Sie vorab bei relevanten Temperatur (für GHB Protokoll Pre incubate für 30 min bei RT) unter ständige sanfte (20 u/min) auf einem Teller Shaker schütteln.
    2. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung ergänzen Sie Testpuffer mit entsprechenden Konzentration von ungekennzeichnete Compound (für GHB Protokoll, 1 mM GHB).
      Hinweis: Vorinkubation möglicherweise nicht erforderlich sein.
  4. Gießen Sie Vorinkubation Flüssigkeit aus jeder Folie und übertragen Sie die Folien an der Plastikschale zurück.
  5. Um Austrocknung zu vermeiden, sofort inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Konzentration von Radioligand in Testpuffer gewünschten Bedingungen (für GHB-Protokoll, 1 nM [3H] HOCPCA für 1 h bei RT) durch Abdecken der Abschnitte komplett mit der Radioligand Lösung (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4).
    1. Inkubieren Sie unter unter ständige sanfte (20 u/min) Schütteln der Kunststoffschalen mit geschlossenem Deckel.
      Hinweis: Die Radioligand Konzentration kann durch zählen ein Aliquot in einem flüssigen Szintillationszähler validiert werden.
  6. Die Inkubation Lösung durch Gießen die Flüssigkeit entfernen und die Folien Folie einbauen möchten Mikroskop zu übertragen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt zu Abschnitt Austrocknung zu vermeiden.
  7. Waschen Sie die Folien. Für die GHB-Protokoll mit eiskalten Testpuffer zweimal für 20 s und dann spülen waschen Sie zweimal durch Eintauchen der Folie Rack in die Schalen gefüllt mit eiskaltem destilliertes Wasser, Salze zu entfernen. Positionieren Sie die Folien vertikal in Racks für mindestens 1 h bei RT Lufttrocknung oder trocknen Sie die Folien für 5 min mit einem Gebläse auf kalten Temperatur einstellen.
    Hinweis: Waschen muss optimiert werden, z.B.umfangreiche waschen kann zur Verringerung der unspezifischen Bindung nützlich sein.
  8. Übertragen Sie die Folien auf einem Fixateur mit Paraformaldehyd (PFA) Pulver für Übernachtung Fixierung mit PFA-Dämpfen bei RT zum Schutz die Integrität des Komplexes Liganden-Ziel.
    Achtung: PFA ist giftig. Positionthe Fixateur in Rauch Haube und Haut/Augenkontakt mit PFA vermeiden.
  9. Übertragen Sie am Folgetag die Folien auf einen Exsikkator Karton mit Silica-Gel für 3 h bei RT, Feuchtigkeit zu beseitigen.

3. Belastung durch Phosphor-Imaging-Platten und Scannen

  1. Legen Sie die Abschnitte in einer Strahlung abgeschirmt bildgebenden Platte Kassette mit dem Gewebe nach oben. Gehören Sie für nachfolgende Quantifizierung von Radioligand Bindung eine [3H] Microscale in jede Kassette. Ordnen Sie die Abschnitte nach dem Zufallsprinzip und setzen Sie in den Abschnitten zum direkten Vergleich in der gleichen Kassette.
  2. Löschen Sie die Tritium-Sensitive Phosphor imaging Platte unmittelbar vor Gebrauch, um angesammelte Signale aus dem Speicher zu entfernen und Hintergrund Signale zu beseitigen. Daher laden Sie die Platte in Phosphor bildgebenden Gerät und setzen Sie es sichtbar/Infrarot Licht entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  3. Entfernen Sie die Platte aus Phosphor bildgebenden Gerät und legen Sie es sofort auf die Abschnitte in der Kassette. Stellen Sie sicher, dass die Kassette komplett geschlossen ist. Setzen Sie in den Abschnitten, die Phosphor-Bildplatte für 3 Tage bei RT vor Licht geschützt.
  4. Da Licht Signal die Speicherfolie löscht, sorgfältig öffnen der Kassette im Dunkeln und sofort übertragen die Bildplatte in den dunklen Kasten von einem Phosphor Imager oder Phosphor Imager in einem dunklen Raum zu platzieren.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, die räumliche Anordnung der Folien während der Belichtung um einzelne Probe auf das digitale Bild nach Analyse identifizieren zu notieren. Phosphor Bildplatten zeigen daher auch eine Ecke in einem deutlichen Winkel zu senken, um die korrekte Ausrichtung der Platte auf dem digitalen Bild zu identifizieren.
  5. Scannen Sie die Platte mit der höchsten Auflösung möglich, ein digitales Bild zu erhalten.

4. optional: Cresyl violette Färbung der Gewebeschnitte

  1. Bereiten Sie 1 % Cresyl violette Lösung durch Mischen von 5 g Cresyl violett-Acetat in 500 mL entionisiertem Wasser (dH2O) bis (ca. 2 h) aufgelöst. Filtern Sie durch ein Filterpapier mit einem Trichter in eine neue 500 mL Flasche. Stellen Sie ein pH-Wert 3,5-3,8.
  2. Positionieren Sie die Folie Färbung Satz unter Abzug. Bereiten Sie Tabletts mit den folgenden Lösungen in weißen Polypropylen Schalen (mit Ausnahme von Xylol):
    a. 50 % ethanol/50% dH2O
    b. 70 % ethanol/30% dH2O
    c. 100 % ethanol
    d. 100 % ethanol
    e. 100 % dH2O
    f. 1 % Cresyl violett
    g. 0,07 % Essigsäure (250 mL dH2O 175 µL Essigsäure hinzufügen).
    h. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts
    i. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts
  3. Übertragen Sie die Folien auf der Dunstabzugshaube und legen Sie sie in einem Dia-Rack.
  4. Lösen Sie die Lipide durch zunehmende abgestuften Reihe von Ethanol in dH2O durch Eintauchen der Folien für 1 min in 100 % igem Ethanol (Fach a-d auf).
  5. Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.
  6. Tauchen Sie die Exemplare in Cresyl violette Lösung für 10 Minuten.
  7. Spülen Sie die Exemplare mit 0,07 % Essigsäure durch Anheben der Folien oben und unten für 4-8 s. Waschen sanft die Folien durch Eintauchen in dH2O für 1 min.
  8. Austrocknen der Proben durch Eintauchen der Folien für 30 s in aufsteigender Konzentration von Ethanol (Fach a-d).
  9. Übertragen Sie die Proben durch zwei Schalen mit 100 % Xylol (Fach h und ich) das Ethanol zu stillen.
  10. Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.
  11. Entfernen Sie die Folien aus Kochsalzlösung mit der Pinzette. Tropfen Sie ein paar der organischen Lösungsmittel Montage Medien pro Folie und fügen Sie ein Deckglas 24 x 60 mm nach oben, um Proben zu schützen. Entfernen Sie durch leichtes Drücken auf das Deckglas Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas.
    Hinweis: Halten Sie die verbleibenden Folien in Xylol bei der Montage um Austrocknen zu verhindern.
  12. Trocknen über Nacht die Folien in einer Dampfhaube bei RT
  13. Ein Bild der Probe mit einem Mikroskop und 1,25 X Objektiv zu erhalten.

5. densitometrische Analyse des digitalen Bildes

  1. Messen Sie die relative optische dichten (Stangen) von jedem Kalibrierstandard von [3H] Microscale mit einer Bildanalyse-Software.
    1. Wählen Sie einen Bereich von gleicher Größe für jeden Punkt der [3H] Microscale mithilfe eines Tools für die Erstellung der Region über den Menüpunkt Region Entschlossenheit. Weisen Sie eine Nummer zu jedem ausgewählten Bereich durch Klicken auf Nummer unter dem Menüpunkt Etikett.
    2. OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierstandards zu exportieren, indem Sie auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht. ROD-Werte in eine Tabelle übertragen und durch die Größe des ausgewählten Bereichs zu normalisieren. Führen Sie die lineare Regression um eine Standardkurve für weitere densitometrische Analysen zu erhalten.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Bereiche gekennzeichnet sind, um passende Rute Werte und Muster zu identifizieren.
  2. Quantifizierung der Autoradiograms mit der eigenen imaging-Software durch Auswahl der Region durchführen von Interesse (ROI) verwenden ein Tool zur Erstellung der Region in jedem Abschnitt und Messung der ODs. Wählen Sie aus derselben Region in jedem Abschnitt durch Erstellen einer Vorlage für die Region von Interesse, die kopiert und manuell eingestellt, geringfügige Abweichungen in der Gehirn-Anatomie für jedes Autoradiogram. Identifizieren Sie die Anatomie des ROI durch Vergleich der Autoradiograms mit einem Gehirn-Atlas-18. Wenn mehrere Behandlungen verglichen werden, führen Sie die Analyse blind und randomisiert um einseitige Auswahl des ROIs zu vermeiden.
  3. Exportieren ROD Werte und Größen der ausgewählten Bereiche in einer Tabelle durch Klicken auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht.
  4. Teilen Sie die gemessene Rute des ausgewählten ROI durch seine Fläche um die Dichte pro bestimmte Fläche zu erhalten.
  5. Den Stab des Hintergrunds der Platte zu messen und entsprechende ROD Werte und Flächengröße in eine Tabellenkalkulation exportieren. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrundsignal aus jeder Stab Wert jedes ROI.
  6. Durchschnitt der Stäbe der technischen Wiederholungen, d.h., Abschnitt repliziert mit Gewebe vom selben Tier.
  7. Verwenden die Standardkurve Stäbe in Einheiten von Radioligand Bindung, d.h.umwandeln., nCi/mg Gewebe Äquivalente (TE).
    Hinweis: Der Begriff TE wird verwendet, da Normen mit Materialien simulieren Gewebe erzeugt werden.
  8. Drücken Sie Bindung durch Umwandlung des nCi/mg und Nmol/mg TE entsprechend der spezifischen Aktivität von Radioligand (Gleichung 1).
    Equation(1)
  9. Um bestimmte verbindliche Werte zu erhalten, subtrahieren Sie unspezifischen Bindung aus insgesamt Bindung.
  10. Durchschnittliche repliziert die Bindung von jedem biologischen replizieren mithilfe des Durchschnitts der technischen jedes Tieres (erhältlich im Schritt 5.6).

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Representative Results

Mit der beschriebenen Protokoll, die anatomische Verteilung der hohen Affinität GHB verbindliche Aufstellungsorte wurde visualisiert mit radioaktiv GHB analog [3H] HOCPCA im Gehirn der Maus, die in koronalen, sagittalen und horizontalen Abschnitte (Abbildung 3 geschnitten wurde ). Hohes Maß an Bindung im Hippocampus und Cortex beobachtet wurden, geringere Bindung im Striatum und keine Bindung war im Kleinhirn, entspricht früheren gemeldeten Expressionsmuster der hohen Affinität GHB Seiten9,10, 11,12. Wie hier dargestellt, die anatomischen Strukturen können visualisiert werden mit verschiedenen speziellen Flugzeuge und anatomische Integrität kann Cresyl violette Färbung gestützt werden. Für GHB hohe Affinität Bindungsstellen sind vor allem Regionen mit niedrigen Radioligand Bindung, wie z. B. Kleinhirn, bestätigt mit nachfolgenden Färbung des Gewebes (Abbildung 3). Koronalen Abschnitte sind am häufigsten in der Literatur9,10gefunden. Sie sind praktisch für quantitative Zwecke, wie ein Gehirn ein höherer Betrag von Abschnitten entnommen werden kann. Sagittale und horizontale Abschnitte haben den Vorteil der Bindung in den meisten Teilen des Gehirns innerhalb eines Abschnitts, wodurch große Übersicht Nagetier zu visualisieren. Abbildung 4illustriert die evolutionäre Erhaltung der hohen Affinität GHB Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren. [3H] HOCPCA-Bindungsstellen wurden bei Maus, Ratte, ebenso wie Schwein Hirngewebe ermöglicht Vergleich der Brutto Gehirn Anatomie zwischen den Arten festgestellt. Im allgemeinen evolutionären Erhaltung regionaler Reichweitenstudien können Beihilfen deutlich in der Charakterisierung eines Proteins des Interesses, in diesem Fall ein neues Ziel und können somit geben Hinweise über die physiologische Funktion19.

Die hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden mit GHB Radioligands sondiert, die unterschiedliche Affinitäten für die Bindungsstellen aber vergleichbare spezifische Aktivitäten (Abbildung 5) angezeigt. [3H] HOCPCA war zuvor gezeigt, ein K-d von 74 nM, was besser ist als die im Handel erhältlichen Radioligand [3H] NCS-382 mit einem K-d von 697 nM, beide entschlossen bei pH 6.0 durch quantitative Autoradiographie9. So [3H] HOCPCA ist ausgestattet mit viel höhere Empfindlichkeit, führt zu ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis. Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit der [3H] NCS-382, höhere Radioligand Konzentrationen müssen genutzt werden, um ähnliche Niveaus der Bindung zu erhalten (vgl. y-Achsen in Abbildung 5). Im Vergleich zu [3H] GHB, sogar höhere Radioligand Konzentration (30 nM) sind notwendig, um vergleichbare Bindung zu erreichen. Dies ist vor allem aufgrund der deutlich geringeren Affinität (Kich 4,5 µm) von diesem Radioligand-20. Höherer Radioligand Konzentration erhöht aber auch das Niveau der unspezifischen Bindung9,10 mit einem daher geringeren Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Serie von Experimenten unterstreicht die Bedeutung, die eine hohe Affinität Radioligand für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bildern.

Denn die hohe Affinität GHB Standorte zu einem so hohen im Vorderhirn Regionen (60 Pmol/mg17) ausgedrückt werden, ist die Bestimmung der pharmakologischen Parameter durch Sättigung Kurven von Natur aus schwer mit standard Tritium sensible Phosphor Bildgebung Platten wegen des Risikos einer übersättigten Bilder. Daher Kd Werte für [3H] HOCPCA und [3H] NCS-382 durch erste entscheidende Kich Werte von homologen Weg-Kurven und Berechnung der Kd (Abbildung 6)9gewonnen wurden. Für die meisten Radioligands wäre eine Alternative Isotop-Verdünnung wie in Homogenat verbindliche Tests routinemäßig durchgeführt wird. Darüber hinaus wurden K-d -Werte bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Offenbar, die hohe Affinität GHB Standorte sind am effizientesten bei pH 6.0 (Abb. 6A und Abbildung 6) gekennzeichnet, da wechselnde Bedingungen auf pH 7.4 wesentlich assay Auswirkungen Liganden Affinität. So die Kd [3H] HOCPCA bei pH 7,4 beträgt ca. 30-Mal höher als die bei pH 6,0 numerisch. Erhöhung des pH-Wertes weiter ergibt sich ein höheres Maß an unspezifischen Bindung, die eine Einschränkung wird bei der Verwendung [3H] NCS-382, wo nur geringe Mengen an spezifische Bindung bei pH 7.4 (Abb. 6E) erzielt werden. Dies behindert in der Tat die Bestimmung der pharmakologischen Parameter mit diesem Radioligand bei physiologischen pH9, zur Veranschaulichung wieder der Macht in einem Radioligand mit als affin wie möglich mit.

Figure 1
Abbildung 1: Strukturen der Radioligands Ausrichtung auf die hohe Affinität GHB Bindungsstellen. [3H] 3-Hydroxycyclopent-1-ene Carbonsäure ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - Tetrahydro-5-hydroxy-5H- Benzocyclohept-6-Ylidene Essigsäure (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 und [3H] γ-Hydroxybutyric Säure ([3H] GHB)16 als tritiumhaltigem Radioligands mit vergleichbaren spezifische Aktivität (20-40 Ci/Mmol) sowie [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125ich] BnOPh GHB)13 mit einer geschätzten molare Aktivität 2000 Ci/Mmol21. Die GHB Strukturelement ist rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Übersicht über das Protokoll von in-vitro- Autoradiographie. (1) das Tier eingeschläfert, Gewebe seziert und Snap auf Trockeneis eingefroren. Gewebe wird dann auf einem Kryostaten, Tauwetter-montiert auf Objektträger geschnitten und (2) Sektionen sind mit Radioligand inkubiert, bis Gleichgewicht Bindung. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung werden Lösungen mit einer Verwandten, aber nicht identischen chemischen Struktur eine ungekennzeichnete Verdränger ergänzt. (3) anschließend ungebundenen Radioligand wird durch Waschen in Testpuffer entfernt und Salze entfallen durch das Ausspülen mit destilliertem H2O. Wenn Teile trocken sind, ist Paraformaldehyd (PFA) Fixierung durchgeführt, um die Liganden-Protein-Interaktion dauerhaft zu etablieren. Abschnitte sind dann Phosphor imaging Platten ausgesetzt. (4) nach ausreichender Einwirkzeit werden Platten gescannt, um digitale Autoradiograms zu erhalten. (5) letztlich Bildanalyse erfolgt mit Definitionen der Regionen von Interesse (ROIs), und die Bindung wird quantifiziert. Im gezeigten Beispiel werden optische dichten (ODs) in Abschnitten der Maus Kortex (links) und Hippocampus (Mitte) dargestellt. Quantifizierung erfolgt durch die Aufdeckung Abschnitte zusammen mit einem [3H] Microscale (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Autoradiograms von 1 nM [3H] HOCPCA Bindung an Maus Gehirn Abschnitte. (A) Radioligand Bindung an koronalen, sagittalen und horizontalen Gewebeschnitten zu zeigen, wie wichtig es ist, den Schnitt Flugzeug auf die Sichtbarkeit der anatomischen Strukturen. (B) Cresyl violette Färbung des entsprechenden Gewebeschnitte anatomischen Regionen, vor allem mit niedrigen/abwesend Radioligand Bindung zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Autoradiograms 1 nM [3H] HOCPCA Bindung in verschiedenen Arten. Vergleich von (A) Ratte, Maus (B) und (C) Schwein in-vitro- Autoradiograms um evolutionäre Erhaltung der Bindungsstellen auf kortikale und hippocampal Regionen zusammen mit groben Gehirn Anatomie zu verdeutlichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Quantifizierung der Bindung an die hohe Affinität GHB Bindungsstellen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit zu GHB Radioligands durch in-vitro- Autoradiographie im Gehirn Scheiben aus Maus Kortex und Hippocampus. Total Bindung wird berichtet, wie Fmol/mg Gewebe Entsprechungen (TE) für die Radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) und (B) [3H] NCS-382 (7 nM) und (C) [3H] GHB (30 nM) (ähnlich wie bestimmte Tätigkeiten). Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von GHB 1 mM oder 1 mM HOCPCA für eines der Radioligands (nicht gezeigt) nicht erkannt. Daten werden dargestellt als ± SD von vier biologischen Wiederholungen bedeuten, die jeweils in drei technischen Wiederholungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der autoradiographischen Bestimmung der Kd und B-max -Werte durch homologe wettbewerbsfähige Verschiebung von [3H] HOCPCA und [3H] NCS-382 in Maus kortikale Abschnitte bei pH 6,0 und pH 7.4 zur den Einfluss des pH-Wertes auf Affinität des Radioligands zu illustrieren. (Kd und Bmax wurden berechnet unter Verwendung der gleichen Verbindung als Radioligand und Wettbewerber, durch anfängliche Bestimmung von K Werteich 22). (A) Autoradiograms mit optimalen Signal-Rausch-Verhältnis für 1 nM [3H] HOCPCA Bindung bei pH 6.0. (B) ändern Puffer pH auf 7,4 erfordert eine höhere Konzentration der [3H]-HOCPCA (8 nM), erhebliche Bindung Ebenen zu erreichen. (C) resultierende Protokoll-Konzentration Bindung Kurven; meine ± SEM (D) 5 nM [3H]-NCS-382-Bindung bei pH 6.0 führt zu niedrigen unspezifischen Bindung während (E) 40 nM [3H] NCS-382 ausreicht, um die Bindung bei pH 7.4 zu erhalten. (F) resultierende Protokoll-Konzentration Bindung Kurven; meine ± SEM Daten aus 3-4 biologischer Replikate erhalten wurde, die jeweils in 3-5 durchgeführt, die technische Wiederholungen, nur [3H] NCS-382 Experimente bei pH 7.4 mit nur 2 biologische Wiederholungen durchgeführt wurden. Für beide Radioligands, 1 mM, die GHB zur Bestimmung der unspezifischen Bindung verwendet wurde. Einzelheiten zur Analyse und Berechnung von K-d und Bmaxsiehe9. Diese Zahl wurde angepasst und Nachdruck von vorherigen Veröffentlichung9 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Qualität einer autoradiographischen Assay wird am häufigsten durch die Empfindlichkeit der Radioligand bestimmt. Ein wichtiger Faktor ist die ausgewählte Radioisotop, die durch die Verfügbarkeit von bekannten Liganden oder durch die Machbarkeit von spezifischen Kennzeichnung Techniken Liganden mit entsprechenden spezifischen Aktivität (d. h., die Menge an Radioaktivität Ausbeute gegeben ist pro Einheit Mol ein Radioligand)23und mit begrenzten Mengen an chemischen Abbau. Eine große Anzahl von Radioligands der bekannten Liganden sind mit Tritium9,10,24,25,26, gekennzeichnet, die mehrere Vorteile folgert. Erstens, Tritium (3H) ist gekennzeichnet durch eine lange Halbwertszeit (12,43 Jahre) langfristige Lagerung der einzelnen Chargen zu fördern. Zweitens ist die Wechselwirkung von Liganden-Ziel nicht durch das Radionuklid verzerrt, wie 3H-Liganden sind biologisch von ihren Stammverbindungen nisht zu unterscheidend. Tritium emittiert Niedrigenergie β–-Teilchen, die nur kurze Anfahrtswege in Gewebe in hoher räumlicher Auflösung und anschließend stärkere Differenzierung zwischen anatomischen Strukturen4. Dennoch kann Tritium Kennzeichnung nur produziert, um mäßig hohen spezifischen Aktivitäten ergeben. Dies ist da verfügbar 3H-Quellen mit nicht-radioaktiven Wasserstoff verunreinigt sind. In der Regel, je höher die spezifische Aktivität, die weniger Radioligand muss empfindliche Detektion23Ausbeute. Darüber hinaus gilt es, dass 3H-Liganden haben die Möglichkeit, Wasserstoff-Austausch mit Wasser abhängig von der Stabilität der 3H-Label zu unterziehen. Um geringe Expression oder zu niedrige spezifische Aktivität zu kompensieren, kann Jod-125 als Radionuklid-13verwendet werden. Die maximale spezifische Aktivität von Jod-125 ist höher als die von Tritium ca. 100-fold. Jedoch haben einige weitere Überlegungen gemacht werden, bei der Arbeit mit Jod-125. Die Zugabe von Jod-125 induziert z. B. normalerweise bauliche Veränderungen im Molekül, das Liganden-Ziel Interaktionen auswirken können. Jod-125 hat eine Halbwertszeit von 60 Tagen, sollte Korrektur für tägliche Zerfall für spezifische Aktivität und Quantifizierung der Liganden-Ziel Interaktionen23anzusehen. 125 Liganden γ-Photonen emittieren und trotz viel höhere Empfindlichkeit, niedriger aufgelöste Bilder zu erzeugen. Dies ist auf die inverse Beziehung zwischen Auflösung und die maximale Energie des Isotops (wie weiter unten erläutert). Schließlich, im Vergleich zu Tritium, erhöhte darauf achten beim Umgang mit Jod-125 aufgrund der höheren Energie des Radionuklids.

Je nach Nuklid kann Gewebe Schnittdicke Auflösung beeinflussen. Die niedrig-Energie-β-–-Strahlung von Tritium schränkt seine Gewebe-Reichweite bis ca. 5 µm durch Selbstabsorption. Infolgedessen ist Quantifizierung Gewebe Dicke nicht beeinflusst, überschreitet die Schnittdicke 5 µm27,28. Radioaktiven Zerfall energiereiche Isotope hat dagegen eine größere Gewebe eindringen, was zu niedriger Bildauflösung, weil Liganden mit einem größeren Abstand zum Nachweis Medium auch zur Imagebildung beitragen. Infolgedessen zu dünneren Bereiche höheren Auflösung für hochenergetischer Radionuklide1fördern.

Die Einrichtung eines autoradiographischen Protokolls erfordert Kenntnis der optimalen verbindliche Bedingungen (z.B., Puffer, pH-Wert und Temperatur) und pharmakologischen Parameter von Radioligand in Bezug auf die Affinität und Kinetik. Wenn der Radioligand nicht charakterisiert worden ist, bevor explorative Studien erforderlich29sind. Auswahl einer optimalen Radioligand Konzentration orientiert sich sowohl durch die Affinität der Radioligand und die Fülle der Bindungsstellen. Normalerweise wird eine Konzentration spiegelt 5-6mal Kd verwendet, um sicherzustellen, dass alle Bindungsstellen gesättigten30sind. Ein weiterer Ansatz zielt darauf ab, das höchste Verhältnis von Gesamt-zu-unspezifische Bindung von Radioligand Konzentrationen unter Kd31 auswählen und speichern Radioligand Lösung zur gleichen Zeit zu liefern. Dieser Ansatz ist besonders nützlich, wenn die Bindungsstelle sehr reichlich im untersuchten Gewebe, ist da hohe Radioligand Konzentration die Chance erhöht würde des Autoradiograms, als der Fall [3H] HOCPCA und der hohen Affinität GHB Übersättigung Seiten9verbindlich. Darüber hinaus sollten der Radioligand um effizient die gesamte Bevölkerung des gezielten Proteins beschriften, ideal an alle möglichen Ziel Konformationen binden. Vor allem in Rezeptor Autoradiographie kann die Verwendung von Agonisten nur teilweise verschiedener total Rezeptoren offenbaren, da einige in niedrig-Affinität Agonist Staaten anwesend sein könnte. Im Gegensatz dazu zeigen neutrale Antagonisten am häufigsten Affinität für alle Rezeptor Staaten26,29.

Darüber hinaus werden verbindliche Experimente in der Regel unter Gleichgewichtsbedingungen Bindung durchgeführt. Daher sollte der Zeitaufwand zum Gleichgewicht Bindung unter den gewünschten experimentellen Bedingungen (feste Radioligand Konzentration, Puffer und Temperatur) zu erreichen im Verein Experimente bestimmt werden, Gleichgewicht Bindung im Rahmen der Gewährleistung der 4,23,30experimentieren. Nach der Inkubation Radioligand ungebundenen Radioligand durch mehrere Inkubationen mit Testpuffer abgewaschen und in der Regel gefolgt von Spülen in destilliertem H2O. Signal-Rausch-Verhältnis optimiert werden, durch die Einstellung von Temperatur und Zeit je nach der Dissoziation-Rate von Radioligand26,30,31.

Radioligands kann nicht-biologischen Materialien, d.h.Bindung anzeigen unspezifischen Bindung. Radioligand Bindung an zellulären Komponenten als das beabsichtigte Ziel ist definiert als unspezifische Bindung. Der Beitrag der unspezifischen Bindung auf den Gesamtbetrag der Radioligand Bindung ist im Beisein eines konkurrierenden ungekennzeichnete Liganden bewertet, die die gleiche Bindungsstelle wie der Radioligand richtet sich an. Wie die nicht-radioaktive Substanz (Verdränger) 10.000-Fach zuviel zugeführt wird, nimmt es die Bindungsstelle und der Radioligand kann nur an Standorten26,31,32Ziel binden. Entscheidend ist, sollte die ungekennzeichnete Verbindung von eine andere chemische Struktur als die Radioligand sein, da dies das Risiko senkt von verdrängen sowohl spezifische sowie unspezifische Bindung23. Unspezifische kann Bindung zu Membranen aus ein großes Problem vor allem bei ziemlich lipophilen Radioligands verbindlich. In einigen Fällen können umfangreiche Waschverfahren entfernen nicht-Rezeptor gebundene Radioligand und verbessern daher die spezifische verbindliche Verhältnisse29.

Wenn ein Testpuffer wählt, ist es entscheidend für die Wirkung der Ionenstärke und der pH-Wert auf die Liganden-Ziel-Interaktion zu betrachten. Vor allem elektrostatische Wechselwirkungen zwischen polaren Liganden und hydrophilen Komponenten Bindungsstellen sind beeinflusst von der Ionenstärke des Puffers. Daher kann eine Supplementierung mit monovalenten oder zweiwertigen Ionen effektive Affinität Konstante23,33auswirken. Wenn die optimale Puffer Zusammensetzung für die Interaktion untersuchten Liganden-Ziel unbekannt ist, sollten verschiedene gemeinsame Puffer in Pilotversuchen erkundet werden. Puffer können auch mit Anti-Oxidantien wie Ascorbinsäure und Inhibitoren der entwürdigende Enzyme29,34ergänzt werden. Darüber hinaus die Ionisation bestimmter Gruppen innerhalb der Bindungsstelle oder auf die Liganden selbst wird durch den pH-Wert beeinflusst und hat kritische Auswirkungen auf das Gleichgewicht verbindliche Konstante, die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten und unspezifischen Bindung23,33. Zum Beispiel veranschaulicht sondieren die hohe Affinität GHB verbindliche Site mit verschiedenen GHB Radioligands schön die Bedeutung des pH-Wertes auf diesem Bindungsziel (Abbildung 6). Charakterisierung den optimale pH-Wert für die Ligand-Rezeptor-Interaktion geben auch Aufschluss über die Bedeutung des Ziels in Bezug auf seine biologische Relevanz.

Ein weiterer kritischer Faktor in digitale Autoradiographie ist die Belichtungszeit, d. h., der Zeitaufwand für die quantifizierbaren Autoradiograms erreichen durch die Aufdeckung möglicher Gewebeschnitte an Phosphor imaging-Platten. Schätzungen beruhen auf die Menge an Radioaktivität in der Probe, die Energie und die Halbwertszeit des Isotops sowie das gewünschte Signal-Rausch-Verhältnis. Insbesondere längere Zeit Aufnahmeergebnisse in gesättigten Bildern und hohen Hintergrundsignal. Erhöhtes Hintergrundsignal kann reduziert werden, indem Sie speichern Kassetten in Blei abgeschirmt Umgebungen, kosmische Strahlung1,4zu vermeiden. Dennoch suboptimalen Autoradiograms erreicht, kann die Probe mehrmals, ausgesetzt werden vorausgesetzt, dass der Liganden-Ziel-Komplex fixiert wird und die Halbwertszeit des Radionuklids es ermöglicht.

Phosphor-imaging-Platten sind wiederverwendbar und haben eine lange Lebensdauer wenn korrekt, d. h.behandelt, biegen sollte vermieden werden und Platten sollten in einer trockenen Umgebung gelagert werden. Die Handhabung von Phosphor imaging Platten orientiert sich an ihrer Empfindlichkeit gegenüber Licht und kosmische Strahlung. Daher ist es wichtig, löschen Sie die Platte vor jedem Gebrauch um Hintergrundsignal zu minimieren. Belichtung von radioaktiv Gewebeschnitte, die Bildplatten erfolgt in Strahlung abgeschirmt Kassetten völlig frei von Licht. Bei der Übertragung von der Platte an den Scanner am Ende der Belichtungszeit sollte jedem Umgebungslicht auch vermieden werden, da auch kurzer Kontakt mit weißem Licht angesammelten Signal reduziert. Darüber hinaus sollten Platten sofort nach dem Entfernen der Probe zu vermeiden Signal verblassen gescannt werden. Ein Nachteil der Verwendung von Phosphor imaging-Platten ist das mögliche Auftreten von Artefakten und Restmüll "Geisterbilder" nach wiederholte Verwendung der Platten1.

Arbeiten mit Tritium erfordert imaging Platten ohne schützende Beschichtung erlauben die Niedrigenergie-Strahlung, die Phosphor-Kristalle zu erreichen. Tritium-Sensitive Phosphor Bildplatten sind daher empfindlicher auf Verunreinigung oder Beschädigung durch unsachgemäße Behandlung. Sobald verunreinigt, Tritium-empfindlichen Platten können nicht gereinigt werden und müssen ersetzt werden. Fixierung des Liganden-Ziel-Komplexes mit PFA Dampf reduziert mögliche Kontamination der Platte, Verlängerung der Lebensdauer. Austrocknung des Gewebes nach Fixierung ist übrigens ein entscheidender Schritt, da Tritium empfindlichen Platten empfindlich gegen Feuchtigkeit sind. Wegen seiner zarten Natur sollte Tritium-empfindlichen Platten nicht für andere Isotope1,4verwendet werden. Im Gegensatz dazu die Platten für hochenergetische Isotopen wie Jod-125 sind robuster und ihre Oberfläche kann auch durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol gereinigt werden.

Traditionell wird strahlenempfindlichen Film seit die räumliche Aufnahme des radioaktiven Zerfalls. Während Bilder mit hoher Auflösung erreicht werden können, hat der Film Autoradiographie mehrere Einschränkungen. Neben der Notwendigkeit von gefährlichen Chemikalien und eine Dunkelkammer für die Entwicklung zeichnet sich durch einen engen Dynamikbereich Röntgenfilm. Daher kann es notwendig, radioaktiv Abschnitte mehrfach mit verschiedenen Belichtungszeiten aussetzen, um quantifizierbare ungesättigten Bilder35zu erreichen sein. Darüber hinaus zeigt Röntgenfilm begrenzte Empfindlichkeit was nachhaltige Belichtungszeiten für Probe mit Niedrigenergie-Isotope, d.h.gekennzeichnet. Tritium Verfall erfordern mehrere Monate der Exposition. Geringer Empfindlichkeit in Kombination mit kleinen linearen Bereich macht die Technik extrem zeitaufwendig, vor allem, wenn optimale Assay-Bedingungen entschlossen erste1,35sein müssen.

Mit der Entwicklung von Phosphor imaging Platten wurden einige dieser Einschränkungen adressierten35,36,37. Die Bildplatten dienen zum temporären Speichern von Bildern des radioaktiven Zerfalls, repräsentieren die räumliche Anordnung der Radioligand in der Gewebeprobe. Photostimulable BaFBr:Eu2+ Phosphor Kristalle werden verwendet, um den radioaktiven Strahlungswerten von der Probe als hochenergetische Strahlung (z.B. Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder Beta-Teilchen) Ergebnisse bei der Anregung der Eu2erfassen + EU3+ und konsequente Überfüllen des freigegebenen Elektrons in den Phosphor Gitter4,37. Die Speicherfolie sichtbar oder Infrarot-Licht aussetzen kehrt die Reaktion, d. h. die eingeschlossenen Elektrons wird freigegeben und während der Transformation der Eu3+ Eu2+ Lumineszenz wird ausgegeben. Das emittierte Licht ist proportional zu der Menge an Radioaktivität und seine Erkennung durch einen Photomultiplier ermöglicht die Erstellung eines digitalen Autoradiogram37. Dieses System bietet eine Erhöhung der Empfindlichkeit, begleitet von einer deutlichen Rückgangs der Belichtungszeit von Monat bis Tage3. Darüber hinaus wird der linearen Dynamikbereich deutlich erhöht, das verringert die Wahrscheinlichkeit von übersättigten Bilder. Linearität ist innerhalb von vier bis fünf Größenordnungen gegeben und wiederholt validiert wurde3,35,36,37,38. Obwohl Film Autoradiographie noch besseren räumlichen Auflösung, führte Bemühungen im scanning-Technologie zur Verbesserung der Auflösung von 300 bis 25 µm (Pixelgröße), so dass die genaue Unterscheidung zwischen anatomischen Regionen3. Insgesamt sind Phosphor Bildplatten der Erwerb eines digitalen Autoradiograms sowohl durch eine erhöhte lineare Reichweite und Empfindlichkeit erleichtern. Reduzierte Belichtungszeit und eine vereinfachte Entwicklungstechnik führen deutlich weniger Zeit für die Datenanalyse ermöglicht höheren Durchsatz.

Im Vergleich zu Autoradiographie, zeichnen sich nützliche pharmakologischen Parameter wie Affinität und Dichte auch häufig durch den Einsatz von Radioligands im Gewebe Homogenat verbindlich Assays. Diese Methode hat den Vorteil der Resultate durch β-emittierten radioaktiven Zerfall mit einem flüssigen funkeln-Detektor in einer effizienten Weise2messen. Durchgeführt in einem Multi-gut Ansatz, z. B. in 96-Well-Mikrotiterplatten, eignen sich solche Tests für das Screening der Bibliotheken von Verbindungen und für eine größere Anzahl von Konzentration-abhängigen Beziehung. Hinzu kommt, dass, Analysen der Sättigung mit diesem Setup ist oft mehr möglich im Vergleich zu Autoradiographie, die Gefahr einer übersättigten Bilder mit hohen Radioligand Konzentration anzeigt. Durchführung von homologen Verschiebung einer festen niedrigen Radioligand Konzentration mit nichtradioaktiven Liganden Erlangung Kd und Bmax umgeht jedoch das Problem der übersättigten Bilder (Abbildung 6)22. Homogenat Bindung und Autoradiographie produzieren ähnliche Schätzungen für Ligand Affinität konstanten, wobei Gewebe Dichte des Proteins des Interesses in Homogenat Bindung unterschätzt werden kann. So wurde vorgeschlagen, dass Zellmembran Störung mit Gewebe Homogenisierung Rezeptor Verlust führen könnte oder verändert, verbindliche Bedingungen3,33. Darüber hinaus können Fehler im Gewebe Dissektion Homogenates kontaminiert mit Gewebe aus angrenzenden Gehirnregionen produzieren. Im Vergleich dazu sind auch komplexe verbindliche Muster in kleine Kerne visualisiert und differenzierbare aufgrund der anatomischen Ortsauflösung Autoradiographie3,33.

Immunohistochemistry visualisiert die Verteilung eines Proteins des Interesses auch anatomisch. Die Methode ist in der Lage, Bilder mit hochauflösenden anatomischen, diskrete Gewebeanteile auf zellulärer Ebene und sogar subzellulärer Ebene mit Elektronenmikroskopie identifiziert werden können. Ausdruck Niveaus werden bewertet anhand der Intensität der Färbung. Absolute Quantifizierung der Ausdruck Ebenen ist jedoch schwierig, da der Mangel an entsprechenden Verweis Normen39. Immunohistochemistry ist darüber hinaus abhängig von der Verfügbarkeit eines selektiven, gut validierte Antikörpers ist oft ein Problem in der Rezeptor Forschung.

Vor der Entscheidung über die Durchführung von in-vitro- Autoradiographie, müssen verschiedene Überlegungen gemacht werden. Zu aller erst könnten Post Mortem Gewebe Vorbereitung einschließlich Schneiden sowie wiederholtes Einfrieren und Auftauen den Erhalt der verbindlichen Seiten2beeinflussen. Darüber hinaus hängt die Methode über die Verfügbarkeit einer ausreichenden Radioligand, die hohe Affinität und Selektivität für das Ziel in Frage2zeigt. Die Radioligand sollte nicht signifikante Bindung an Standorten Ziel angezeigt, und es sollte auch eine günstige kinetische Profil zeigen. Dies ist notwendig, weil der Liganden-Ziel-Komplex im Laufe des Experiments intakt bleiben muss. Darüber hinaus wenn geeignete nicht-radioaktive Verbindungen vorhanden sind, könnte die Einführung des Radionuklids ein kritischer Faktor geworden. So sollte das Molekül des Interesses mit geeigneten Funktionsgruppen für effiziente radioaktive ausgestattet werden, ermöglicht die Herstellung von Radioligands mit ausreichend hohe spezifische Aktivität und chemische Stabilität40. Ein weiterer Nachteil von in-vitro- Autoradiographie ist, dass die Methode nur die Verwendung eines Tieres einmal. erlaubt Mehr elegant ist die Erweiterung in Vivo bildgebende Verfahren wie Position-Emissions-Tomographie (PET), wiederholte Scannen des gleichen Tier und Bestimmung der Belegung und dynamische Bindungseigenschaften ermöglicht. PET ist besonders wertvoll für das Studium der höheren Säugetiere41 und zur Optimierung der Dosis in präklinischen Studien 42,43,44.

Mehrere Änderungen der autoradiographischen Technik erweitern seine Anwendung sowohl in Bezug auf die Charakterisierung der pharmakologischen Ziele in gesunden und Kranken Staaten sowie in der Wirkstoffforschung und -Entwicklung. Zunächst führten die jüngsten Fortschritte in der imaging-Technologie zur Entwicklung von Echtzeit-Autoradiographie. Gaswarngeräte von α/β-Teilchen umgehen die Notwendigkeit einer bildgebenden Platten oder Film durch die direkte Messung der Zerfall, wodurch schnelle digitale Autoradiograms45.

Darüber hinaus kann in-vitro- Autoradiographie Studien über die Funktionalität von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) auf Informationen über ihre anatomische Verteilung in Post-Mortem-Geweben. Diese Variante der Methode beinhaltet Inkubation der Gewebeschnitte mit einem radioaktiv markierten analogen Guanosin Triphosphat (GTP), d. h. [35S] Guanosin 5'-γ-Thiotriphosphate ([35S] GTPγS), zusammen mit einer nicht radioaktiv der GPCR-Agonist. Wenn der Agonist bindet und löst eine Reaktion von GPCR, die Einbeziehung der [35S] GTPγS können lokalisiert und quantifiziert durch Autoradiographie, widerspiegelt nur die aktivierten Rezeptor Bevölkerung2,46,47 .

Ex-Vivo Autoradiographie repräsentiert eine andere Version von der Technik, die die regionale Bindung eine Radioligand nach der Verabreichung zu einem lebenden Tier experimentelle bewertet. Im Anschluss an die Opfer des Tieres, Kryoschneiden der Gewebe in Frage und autoradiographischen Exposition führen zu Autoradiograms nachzudenken, die die Radioligand in Vivo2verbindlich. Ex-Vivo Autoradiographie wird häufig in Drug Discovery und Entwicklungsprogramme eingesetzt, um Informationen über das pharmakokinetische Profil von einer Blei Verbindung, d. h. seine Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) zu gewinnen . Besonders Ganzkörper-Autoradiographie gibt einen Einblick über die Verteilung von Medikamenten zu allen Organen und Geweben. Allerdings Bestimmung der unspezifischen Bindung und Quantifizierung ist schwieriger im Vergleich zu in-vitro- Autoradiographie wegen möglichen Stoffwechsel und Abbau von der Radioligand und keine Mittel für Waschen entfernt ungebundenen Liganden48.

Autoradiographie wird auch für die vorläufige Prüfung und Charakterisierung von PET Liganden4verwendet. Hochenergetischer Radionuklide Kohlenstoff-11 und Fluor-18 werden am häufigsten für PET Liganden. PET ist eine prominente, nicht-invasive Anwendung für Radioligands, da quantifizierbare 3D-Bilder von der Radioligand Bindung in ein lebendes Tier11,40,49abgerufen werden können.

In-vitro- Autoradiographie mit Phosphor imaging Platten stellt eine wertvolle Assay-Methode für die pharmakologische Charakterisierung von Ziel-Ligand-Interaktionen. Die Methode liefert reproduzierbare Ergebnisse durch den Einsatz eines relativ schnellen und einfachen Protokolls sobald optimale Assay-Bedingungen festgelegt wurden. Anatomische Verteilung eines Proteins des Interesses richtet sich in seiner nativen Mikroumgebung, wodurch die Untersuchung seiner pharmakologischen, physiologische und pathologische Rolle in Post-Mortem-gesundem und krankem Gewebe der Versuchstiere sowie Menschen2,47.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde von Lundbeck Stiftung (Grant R133-A12270) und der Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Aleš Marek für die Lieferung von [3H] Radioligand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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Neurowissenschaften Ausgabe 145 Radioligand radioaktiv Autoradiographie Affinität Ausdruck Phosphor Bildgebung HOCPCA γ-Hydroxybutyric Säure GHB NCS-382 quantitative Pharmakologie
Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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