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Neuroscience

Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

Abstract

In vitro autoradiographie a pour but de visualiser la répartition anatomique d’une protéine d’intérêt dans les tissus des animaux de laboratoire ainsi que les êtres humains. La méthode est basée sur la liaison spécifique d’un radioligand vers sa cible biologique. C’est pourquoi, coupes de tissus congelés sont incubés avec solution radioligand, et la liaison à la cible est ensuite localisée par la détection de la radioactivité, par exemple, en utilisant le film photosensible ou plaques-images au phosphore. Autoradiogrammes numériques qui en résulte affichent une résolution spatiale remarquable, ce qui permet la quantification et la localisation des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. En outre, quantification permet la caractérisation pharmacologique de l’affinité du ligand au moyen des constantes de dissociation (Kd), les constantes d’inhibition (Kj’ai) ainsi que la densité des sites de fixation (Bmax) dans les tissus choisis. Ainsi, la méthode fournit des informations sur la localisation de la cible tant de sélectivité de ligand. Ici, la technique est illustrée avec caractérisation autoradiographique de l’acide de haute affinité gamma-hydroxybutyrique (GHB) accepteurs dans le tissu de cerveau des mammifères, avec un accent particulier sur les considérations d’ordre méthodologiques concernant l’essai de liaison paramètres, le choix de la méthode de détection et de radioligand.

Introduction

Autoradiographie est une méthode qui fournit des images de désintégration radioactive. La technique est couramment utilisée pour étudier la distribution tissulaire d’une protéine d’intérêt en vitro basée sur une interaction pharmacologique spécifique entre un composé radiomarqué et sa cible. Ceci fournit des informations directes sur la sélectivité du ligand pour la cible. In vitro autoradiographie peut également être utilisé pour la détermination quantitative des paramètres de liaison pharmacologique des radioligands, tels que la constante de dissociation (Kd) et la densité des sites de fixation (Bmax), ainsi que pour déterminer la constante d’inhibition (Ki) concurrentes des ligands1,2. Par rapport aux traditionnels homogénat radioligands, autoradiographie a l’avantage d’être en mesure de visualiser l’anatomie du spatial et donnant des détails succincts sur expression régionale modèles3. La méthode d’autoradiographie est donc une alternative pertinente à l’immunocytochimie, surtout en l’absence d’un anticorps validé. Autoradiographie est facilement mis en œuvre dans un laboratoire de radio-isotope standard compte tenu de la disponibilité d’un radioligand adapté avec la spécificité pharmacologique requise, l’accès à un cryostat microtome servant à préparer des sections de tissu et une imagerie adaptée appareil qui est capable d’analyser la répartition de la radioactivité dans les sections respectives de tissu. Notamment, un critère de sélection important pour radioligand est une quantité limitée de liaison aux sites non ciblés. Ceci peut être à d’autres protéines, les membranes ou les matériaux comme le plastique ou les filtres et est collectivement dénommé non-spécifiques. Habituellement, non-spécifiques est non saturable mais peut être saturable si il s’agit d’une protéine spécifique de la cible. Le meilleur moyen de validation véritable fixation spécifique est à comparer aux tissus manque la cible, par exemple, génétiquement machiné des tissus (knock-out)4.

Ici, la méthode est illustrée par la caractérisation autoradiographique du site de liaison de haute affinité pour l’acide gamma-hydroxybutyrique (GHB) dans le cerveau des mammifères. Comprendre l’interaction pharmacologique du GHB et son site de liaison est pertinent que le GHB est une drogue tant cliniquement utile dans le traitement de la narcolepsie et l’alcoolisme5, mais aussi un constituant naturel du cerveau mammifère et un loisir 6de drogue. Sites de liaison de haute affinité GHB ont été les premiers décrits à l’aide de la [3H] liant de GHB au cerveau de rat homogénat7. Au cours des années, poursuivre des études d’autoradiographie [3H] GHB et l’analogue de la [3H] NCS-382 a montré une forte densité de sites dans les régions du cerveau de rat8,9,10, souris9 de liaison ,11et singe/homme cerveau12de porc. Cependant, l’identité moléculaire et la pertinence fonctionnelle exact de ces sites de liaison sont restés insaisissables.

Avec l’intention de mieux caractériser les sites de liaison et à faciliter les études sur le rôle physiologique du GHB, multiples radioligands incorporant différents isotopes dotés d’affinités différentes ont été développés ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA et [125j’ai] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revu en17) (Figure 1). La combinaison des radioligands de haute affinité sélective et une densité de tissu très élevée de la liaison de sites ont permis pour la production d’images de haute qualité en utilisant la technique9,11-images au phosphore. Ainsi qu’un aperçu des points pratiques à mettre en place une expérience autoradiographique et une illustration pour illustrer les détails, la section discussion mettra l’accent sur i) le choix du radionucléide, ii) le choix des conditions expérimentales et iii) l’utilisation de phosphore plaques d’imagerie contre le film radiographique. L’objectif général de ce document est de fournir des détails techniques, méthodologiques et scientifiques sur la technique d’autoradiographie pour informer la distribution tissulaire et analyse pharmacologique des protéines cibles.

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Protocol

Tous les animaux de manutention a été réalisée en conformité avec les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois.

Remarque : Le protocole décrit ici couvre la préparation du tissu (c.-à-d., tissu de cerveau de souris), l’essai in vitro autoradiographique avec suffisamment de détails pour mettre en place la méthode dans un nouveau laboratoire, l’exposition aux images de plaques au phosphore ainsi que analyse densitométrique subséquente d’autoradiogrammes (Figure 2) dans le but de localiser et quantifier des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. Pour comparaison histologique, un protocole pour une coloration violet de crésyle est inclus. En outre, la détermination de la liaison non spécifique avec un ligand concurrent est incluse dans le protocole. Pour une description détaillée sur la façon de déterminer Kd, Bmax ou Kj’ai, voir précédente publication4.

1. tissu préparation par Cryosectioning

  1. Euthanasier la souris par dislocation cervicale et disséquer immédiatement sur le cerveau à l’aide de ciseaux et pinces. Passez directement à l’étape suivante pour éviter d’endommager les tissus.
  2. Clin d’oeil-gel le tissu par immersion dans la glace sèche en poudre, gaz CO2 ou isopentane. Transférer directement les tissus congelés sur un cryostat avec la température réglée à-20 ° C. Vous pouvez également stocker les tissus à-80 ° C jusqu’au traitement.
    Remarque : Évitez de dégel/gel répété pour réduire les lésions tissulaires.
  3. Laisser le tissu s’acclimater à-20 ° C dans le cryostat pendant 20 min avant la poursuite de la procédure afin d’éviter l’éclatement du tissu.
  4. Couvrir le support papier avec le milieu d’inclusion hors du cryostat et rapidement placer l’échantillon de tissus congelés dans l’orientation désirée tandis que le milieu d’enrobage est encore liquid. Par exemple, placer le cerveau de souris verticalement sur le cervelet afin d’atteindre les sections coronales rostrales. Transférer le porte-papier hygiénique à cryostat et exposer le milieu d’enrobage aux températures inférieures à-10 ° C pour la trempe.
    NOTE : Spécimen de tissu Fragile devrait être enduit en enrobage moyen dans les moules de tissu avant le montage.
  5. Positionner le support de tissu dans le microtome du cryostat. Ajustez l’orientation du tissu pour éviter les sections inclinées.
  6. Couper le tissu avec les conseils d’un atlas stéréotaxiques18 dans les sections de l’épaisseur désirée (12 µm recommandé pour la [3H] étiqueté ligands). Redresser et dépliez soigneusement la section avec une brosse de petite taille si nécessaire et dégel-Mont la section sur une lame de microscope. Séquentiellement, recueillir les sections de la région d’intérêt pour la réplication technique souhaitée (par exemple, 4 sections par lame).
  7. Laisser les sections sur les diapositives pour sécher à l’air pendant 1 h avant la manipulation de la friteuse.
    NOTE : Ajout de dessiccant à glissière boîtes minimise l’accumulation d’humidité sur les coupes de tissus. Protocole peut être suspendue ici en stockant des sections à long terme dans des boîtes de diapositive à-80 ° C.

2. in vitro autoradiographie

Attention : la radioactivité. Travailler dans un laboratoire certifié conformément aux réglementations locales. Portez des vêtements protecteurs. Éliminer conformément à la désintégration radioactive ou sous-traiter à une entreprise certifiée.

  1. Décongeler les sections pendant au moins 30 min à température ambiante (RT). Étiqueter les lames avec des conditions expérimentales. Utiliser un crayon car les diapositives seront être baignées dans l’éthanol pendant la coloration ultérieure.
  2. Déposer les lames horizontalement dans des plateaux en plastique.
    NOTE : Positionnement des diapositives sur une plate-forme surélevée dans des plateaux en plastique facilite leur manipulation.
  3. Pré incubate les sections montées sur les diapositives de tampon ajusté à cible en question (pour le protocole de GHB, 50 mM KHPO4 tampon pH 6.0 est utilisé) en appliquant soigneusement un volume approprié sur le toboggan (700 µL pour sections coronales rongeurs 3-4).
    Remarque : S’assurer que chaque article est complètement recouverte de liquide.
    1. Couvrir les bacs en plastique avec un couvercle pour éviter l’évaporation et pré incuber à une température correspondante (pour le protocole GHB pré incubate pendant 30 min à ta) sous la douce constante (20 tr/min), agiter dans un agitateur de plaque.
    2. Pour la détermination de non-spécifiques, supplément du tampon avec la concentration pertinente d’un composé non étiqueté (pour le protocole GHB, 1 mM GHB).
      NOTE : Pré-incubation n’est peut-être pas nécessaire.
  4. Décanter la pré-incubation liquide de chaque diapositive et transférer les lames vers le plateau en plastique.
  5. Pour éviter la déshydratation, immédiatement incuber les sections avec concentration pertinente du radioligand dans du tampon dans conditions souhaitées (protocole de GHB, 1 nM [3H] HOCPCA pendant 1 h à RT) en couvrant les sections complètement avec le radioligand solution (700 µL pour sections coronales rongeurs 3-4).
    1. Incuber en vertu douce constante (20 tr/min) secouant des plateaux en plastique avec couvercle fermé.
      Remarque : La concentration de radioligand peut être validée en comptant une partie aliquote dans un compteur à scintillation liquide.
  6. Enlever la solution de l’incubation de décanter le liquide et transférer les lames dans un rack de lames de microscope. Procéder immédiatement à l’étape suivante pour éviter la déshydratation de la section.
  7. Laver les diapositives. Pour le protocole GHB, laver avec tampon glacee deux fois pour 20 s et puis rincez deux fois en plongeant la grille coulissante dans les bacs remplis avec de l’eau distillée glacée pour enlever les sels. Placez les diapositives verticalement dans les racks pour séchage à l’air pendant au moins 1 h à RT ou sécher les lames pendant 5 min avec un souffleur à température froide.
    Remarque : Le lavage doit être optimisé, par exemple, un lavage peut être utile pour diminuer les liaisons non spécifiques.
  8. Transférer les lames d’un fixateur contenant de la poudre de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation au jour le jour avec des vapeurs de PFA à RT afin de protéger l’intégrité du complexe ligand-cible.
    Attention : PFA est toxique. Fixateur de la position de hotte des fumées et évitez tout contact de la peau/visuel avec IFP.
  9. Le lendemain, transférer les lames dans une boîte de dessiccateur contenant du gel de silice pendant 3 h à RT pour éliminer l’humidité.

3. exposition au phosphore plaques d’imagerie et analyse

  1. Placez les sections dans une cassette blindé radiation de plaque d’imagerie avec le tissu vers le haut. Pour la quantification ultérieure des radioligands, inclure une microéchelle [3H] dans chaque cassette. Organiser les sections au hasard et exposer les sections pour comparaison directe dans la même cassette.
  2. Effacer l’images plaque immédiatement avant son utilisation afin d’éliminer les signaux accumulés de stockage et d’éliminer les signaux de fond au phosphore sensibles au tritium. Par conséquent, charger la plaque dans la machine d’imagerie de phosphore et exposez-le au visible/infrarouge lumière selon les instructions du fabricant.
  3. Retirez la plaque de la machine d’imagerie de phosphore et placer immédiatement sur les sections de la cassette. Assurez-vous que la cassette est complètement fermée. Exposer les sections à la plaque d’imagerie de phosphore pendant 3 jours à ta protégée de la lumière.
  4. Parce que la lumière efface le signal de la plaque d’imagerie, soigneusement ouvrir la cassette dans l’obscurité et immédiatement transférer la plaque d’imagerie dans la boîte noire d’un imageur de phosphore ou placez l’imageur de phosphore dans une pièce sombre.
    Remarque : Veillez à noter l’arrangement spatial des lames pendant l’exposition afin d’identifier le spécimen individuel sur l’image numérique après analyse. Par conséquent, les plaques d’imagerie de phosphore également affichent un coin coupé dans un angle distinct afin d’identifier la bonne orientation de la plaque sur la photo numérique.
  5. Scannez la plaque avec la meilleure résolution possible d’obtenir une image numérique.

4. facultatif : Cresyl Violet la coloration des coupes de tissus

  1. Préparer la solution de violet de crésyle de 1 % par le mélange de 5 g d’acétate violet de crésyle dans 500 mL d’eau désionisée (dH2O) jusqu'à la dissolution (environ 2 h). Filtrer sur un filtre en papier à l’aide d’un entonnoir dans un nouveau flacon de 500 mL. Ajuster le pH de 3,5 à 3,8.
  2. La coloration de la diapositive positionné sous hotte aspirante. Préparer les plateaux avec les solutions suivantes dans des plateaux en polypropylène blancs (à l’exception de xylène) :
    a. 50 % ethanol/50% dH2O
    b. 70 % ethanol/30% dH2O
    c. 100 % éthanol
    d. 100 % éthanol
    e. 100 % dH2O
    f. violet de crésyle 1 %
    g. 0,07 % d’acide acétique (ajouter 175 µL d’acide acétique dans 250 mL de dH2O).
    h. 100 % xylène dans des plateaux résistant aux solvants verts
    i. 100 % xylène dans des plateaux résistant aux solvants verts
  3. Transférer les lames à la hotte et les placer dans une grille coulissante.
  4. Dissoudre les lipides à travers une série graduée croissante d’éthanol en dH2O en 100 % éthanol (plateau a à d) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  5. Réhydrater les echantillons dH2O à décroissant des concentrations d’éthanol (plateau a-d dans l’ordre inverse, suivi de plateau e) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  6. Immerger les échantillons en solution de violet de crésyle pendant 10 min.
  7. Rincer les spécimens dans l’acide acétique 0,07 % en soulevant la glisse de haut en bas doucement pendant 4-8 s. lavage les diapositives en plongeant en dH2O pendant 1 min.
  8. Déshydrater les spécimens par immersion des diapositives pour 30 s en croissant des concentrations d’éthanol (plateau a à d).
  9. Transférer les échantillons par le biais de deux plateaux de 100 % de xylène (plateau h et i) pour étancher l’éthanol.
  10. Réhydrater les echantillons dH2O à décroissant des concentrations d’éthanol (plateau a-d dans l’ordre inverse, suivi de plateau e) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  11. Supprimer les diapositives de sérum physiologique avec une pince. Ajouter quelques gouttes de solvant organique médias par lame de montage et ajouter une lamelle de 24 x 60 mm sur le dessus pour protéger les spécimens. Enlever les bulles d’air entre l’échantillon et la lamelle couvre-objet en appuyant doucement sur la lamelle couvre-objet.
    Remarque : Conservez les diapositives restants dans le xylène lors du montage pour éviter le dessèchement.
  12. Les diapositives sèche durant la nuit dans une hotte de laboratoire à température ambiante.
  13. Obtenir une image de l’échantillon avec un microscope et 1,25 X objectif.

5. densitométrie de l’Image numérique

  1. Mesurer les densités optiques relatives (tiges) de chaque solution étalon de la micro-échelle [3H] avec une analyse d’images.
    1. Sélectionnez une zone de taille égale pour chaque point de la [3H] microscale utilisant un outil de création de la région de l’élément de menu détermination de la région. Attribuer un numéro à chaque zone sélectionnée en cliquant sur le numéro dans la rubrique Label.
    2. Exporter des valeurs de do pour chaque point de la solution étalon en cliquant sur fichier | E xport | rapport 2D région. Transfert des valeurs ROD dans une feuille de calcul et normaliser par la taille de la zone sélectionnée. Effectuer une régression linéaire pour obtenir une courbe d’étalonnage pour analyse densitométrique.
      Remarque : Assurez-vous que les zones sélectionnées sont étiquetés afin d’identifier les valeurs ROD et échantillons correspondants.
  2. Effectuer la quantification des autoradiogrammes à l’aide de l’auteur de logiciels d’imagerie en sélectionnant la zone d’intérêt (ROI) à l’aide d’un outil de création de la région dans toutes les sections et en mesurant son ODs. Sélectionner la même région dans toutes les sections en créant un modèle pour la région d’intérêt, ce qui est copié et réglé manuellement à des variations mineures dans l’anatomie du cerveau pour chaque autoradiogram. Identifier l’anatomie du ROI en comparaison des autoradiogrammes avec un cerveau atlas18. Lorsqu’on compare plusieurs traitements, effectuer l’analyse aveuglé et randomisées afin d’éviter la sélection biaisée des ROIs.
  3. Exporter des valeurs de tige et les tailles des zones sélectionnées dans une feuille de calcul en cliquant sur fichier | E xport | rapport 2D région.
  4. Diviser la tige mesurée du ROI sélectionné par sa superficie pour obtenir la densité surfacique spécifiques.
  5. Mesurer la tige du fond de la plaque et les valeurs correspondantes de tige et de la taille de la zone d’exportation dans un tableur. Soustraire le signal de fond moyenne de chaque valeur de la tige de chaque ROI.
  6. Moyenne les tiges de réplicats techniques, par exemple, article reproduit en utilisant des tissus de l’animal même.
  7. Utiliser la courbe d’étalonnage pour convertir tiges en unités de radioligands, i.e., équivalents de tissu nCi/mg (TE).
    NOTE : Le terme T’est utilisé parce que les normes sont générés avec matériaux simulant de tissu.
  8. Exprimer la liaison par conversion de nCi/mg à nmol/mg TE selon l’activité spécifique du radioligand (équation 1).
    Equation(1)
  9. Pour obtenir les valeurs de liaison spécifique, soustraire non-spécifiques de fixation totale.
  10. Moyenne la liaison de chaque réplication biologique à l’aide de la moyenne de la technique réplique de chaque animal (obtenu à l’étape 5,6).

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Representative Results

En utilisant le protocole décrit, la répartition anatomique des sites de liaison de haute affinité GHB a été visualisée avec l’analogue GHB radiomarqué [3H] HOCPCA dans le cerveau de souris, qui a été coupé en sections coronales, sagittales et horizontales (Figure 3 ). Des niveaux élevés de liaison ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, une liaison plus faible dans le striatum et aucune liaison n’a été détectés dans le cervelet, correspondant à des profils d’expression déclarés précédent de la haute affinité GHB sites9,10, 11,12. Tel qu’illustré ici, les structures anatomiques peuvent être visualisées à l’aide de différents plans de coupe et intégrité anatomique peut être pris en charge par coloration au violet de crésyle. Pour les sites de liaison de haute affinité GHB, notamment les régions avec des radioligands faible, comme le cervelet, sont confirmées avec coloration ultérieure des tissus (Figure 3). Coronales sections se trouvent plus souvent dans la littérature9,10. Ils sont pratiques à des fins quantitatives comme un montant plus élevé des sections peut être obtenu d’un cerveau. Sections sagittales et horizontales ont l’avantage de visualiser la liaison pendant la majeure partie du cerveau rongeur dans une section fournissant ainsi l’excellente vue d’ensemble. La figure 4illustre la conservation évolutive des sites de liaison de haute affinité GHB dans le cerveau des mammifères. [3H] Sites de fixation de HOCPCA ont été détectés chez la souris, rat, ainsi que dans tissu de cerveau de porc permettant la comparaison de l’anatomie du cerveau brut entre les espèces. En règle générale, conservation évolutive et des études de répartition régionale pourraient contribuer significativement à la caractérisation d’une protéine d’intérêt, dans ce cas une nouvelle cible et peuvent donc donner des indications sur sa fonction physiologique19.

Les sites de liaison de haute affinité GHB ont été hybridés avec GHB radioligands, qui présentent des affinités différentes pour les sites de liaison mais les activités spécifiques comparables (Figure 5). [3H] HOCPCA a déjà été démontré avoir une Kd 74 nM, ce qui est supérieur au radioligand disponible dans le commerce [3H] NCS-382 avec un Kd 697 nM, tous deux déterminés à pH 6.0 par autoradiographie quantitative9. Ainsi, [3H] HOCPCA est doté d’une sensibilité beaucoup plus élevée, conduisant à un excellent rapport signal-bruit. En raison de la sensibilité plus faible des radioligands NCS-382, supérieur de [3H] concentrations doivent être utilisées afin d’obtenir des niveaux similaires de liaison (comparer les axes des ordonnées dans la Figure 5). Par rapport à la [3H] GHB, même à des concentrations plus élevées de radioligands (30 nM) sont nécessaires pour atteindre des niveaux comparables de liaison. C’est principalement en raison de l’affinité beaucoup plus faible (Kj’ai 4,5 µm) de cette radioligand20. Cependant, concentration plus élevée de radioligand augmente également le niveau de non-spécifiques9,10 , avec un rapport signal-bruit inférieur en conséquence. Cette série d’expériences met en évidence l’importance d’avoir un radioligand de haute affinité pour la production d’images de haute qualité.

Parce que les sites de haute affinité GHB sont exprimés à des niveaux si élevés dans les régions du cerveau (60 pmol/mg17), la détermination des paramètres pharmacologiques des courbes de saturation est intrinsèquement difficile en imagerie standard tritium en phosphore sensibles plaques en raison du risque d’images sursaturées. Par conséquent, les valeurs de Kd pour la [3H] HOCPCA et [3H] NCS-382 ont été obtenus par la première déterminant Kj’ai des valeurs d’homologues courbes, puis calcul de Kd (Figure 6)9. Pour la plupart des radioligands, une alternative serait d’utiliser la dilution isotopique de façon habituelle dans les essais de liaison de l’homogénat. En outre, Kd valeurs ont été déterminées à différents pH. Évidemment, les sites de haute affinité GHB sont étiquetés plus efficacement à un pH de 6.0 (Figure 6 a et Figure 6), depuis le changement de dosage conditions à pH 7,4 substantiellement d’impact affinité du ligand. Ainsi, le Kd pour la [3H] HOCPCA à pH 7,4 est environ 30 fois supérieur numériquement qu’à un pH de 6.0. Élévation du pH plus se traduit par un plus haut degré de liaison non spécifique, qui devient une mise en garde lorsque vous utilisez la [3H] NCS-382, où seules de faibles quantités de liaison spécifique peuvent être obtenues à un pH de 7,4 (Figure 6E). En fait, cela entrave la détermination des paramètres pharmacologiques utilisant cette radioligand à pH physiologique9, illustrant à nouveau la puissance en ayant un radioligand avec comme une affinité élevée que possible.

Figure 1
Figure 1 : Structures de radioligands ciblant les sites de liaison de haute affinité GHB. D’acide carboxylique [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ène ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6.7.8.9 - tétrahydro-5-hydroxy-5H- benzocyclohept-6-ylidène acide acétique (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 et l’acide gamma-hydroxybutyrique [3H] ([3H] GHB)16 comme tritiée radioligands avec activité spécifique comparable (20 à 40 Ci/mmol), ainsi que [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125I] BnOPh-GHB)13 avec une activité molaire estimée de 2000 Ci/mmol21. L’élément structurel de GHB est surlignée en rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu schématique du protocole de in vitro autoradiographie. (1) l’animal est euthanasié, le tissu est disséqué et surgelés clin d’oeil sur la glace sèche. Le tissu est ensuite sectionné sur un cryostat, dégel-monté sur lames de microscope et (2) sections sont incubées avec radioligand jusqu'à l’attache d’équilibre. Pour la détermination de liaisons non spécifiques, des solutions sont complétées par un piston étiqueté d’une structure chimique connexe mais non identique. (3) par la suite, unbound radioligand est éliminé par lavage dans du tampon et sels sont éliminés par rinçage avec distillée H2O. Lorsque les sections sont secs, fixation de paraformaldéhyde (PFA) est effectuée afin d’établir définitivement l’interaction ligand-protéine. Sections sont ensuite exposées à des images de plaques au phosphore. (4) après le temps d’exposition suffisamment, plaques sont analysés pour obtenir autoradiogrammes numériques. (5) en fin de compte, analyse d’image s’effectue à l’aide des définitions des régions d’intérêt (ROIs), et la liaison est quantifiée. Dans l’exemple illustré, des densités optiques (ODs) sont illustrées dans les sections de cortex de souris (à gauche) et l’hippocampe (au milieu). Le dosage est effectué en exposant des sections avec une microéchelle [3H] (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Sections de cerveau autoradiogrammes représentatifs de 1 nM [3H] HOCPCA la liaison à la souris. (A) Radioligand liaison à coronale, des sections de tissu sagittale et horizontale afin d’illustrer l’importance de la découpe de rabot sur la visibilité des structures anatomiques. (B) Cresyl violet à la coloration des coupes de tissus correspondant pour vérifier les régions anatomiques, notamment les régions à faible/absente radioligands. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Autoradiogrammes représentatifs de 1 liaison de HOCPCA nM [3H] chez différentes espèces. Comparaison de rat (A), souris (B) et (C) in vitro autoradiogrammes de porc afin d’illustrer la conservation évolutive des sites de liaison aux régions corticales et hippocampe ainsi que de l’anatomie du cerveau brut. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Quantification de la liaison pour les sites de liaison de haute affinité GHB avec une sensibilité différente aux radioligands GHB par autoradiographie de in vitro dans le cerveau de tranches de cortex de souris et de l’hippocampe. Fixation totale est exprimée en équivalents de tissu fmol/mg (TE) pour le radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) et (B) [3H] NCS-382 (7 nM) et (C) [3H] GHB (30 nM) (activités spécifiques similaires). Liaison non spécifique n’a pas été détecté en présence de 1 mM GHB ou 1 mM HOCPCA pour toutes les radioligands (non illustré). Données sont présentées comme moyenne ± écart-type de quatre réplicats biologiques que chacun effectué en trois répétitions techniques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Résultats représentatifs de détermination autoradiographique de Kd et B valeursmax par homologue déplacement compétitive de la [3H] HOCPCA et [3H] NCS-382 dans les sections corticales souris à pH 6.0 et 7,4 afin de illustrer l’influence du pH sur l’affinité des radioligands. (K,d et Bmax ont été calculés en utilisant le même composé comme radioligand et concurrent, grâce à une détermination initiale de Kj’ai valeurs22). Autoradiogrammes (A) avec rapport signal-bruit optimal pour 1 liaison de HOCPCA nM [3H] à un pH de 6.0. (B) modifier tampon pH 7,4 requiert une concentration plus élevée de HOCPCA [3H] (8 nM) pour atteindre des niveaux significatifs de liaison. (C) les courbes de liaison journal-concentration résultant ; moyenne ± SEM. (D) 5 nM [3H] NCS-382 fixation à pH 6.0 résulte en bas non-spécifiques, considérant que (E), 40 nM [3H] NCS-382 est insuffisant pour obtenir la liaison à un pH de 7,4. Courbes de liaison journal-concentration résultant (F) ; moyenne ± SEM. données ont été obtenues à partir de 3-4 répétitions biologiques que chacun réalisé en 3-5 répétitions techniques, seules expériences de NCS-382 [3H] à pH 7,4 ont été réalisées avec seulement 2 réplicats biologiques. Pour les deux radioligands, 1 mM, que le GHB a été utilisé pour la détermination des liaisons non spécifiques. Pour plus d’informations sur l’analyse et le calcul de Kd et Bmax, voir9. Ce chiffre a été adapté et tiré à part de la précédente publication9 avec la permission de Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La qualité d’un test autoradiographique est le plus souvent déterminée par la sensibilité au radioligand. Un facteur important est le radio-isotope sélectionné, qui est indiqué par la disponibilité de ligands connus ou de la faisabilité des techniques spécifiques de l’étiquetage à céder des ligands avec une activité spécifique appropriée (c'est-à-dire, la quantité de radioactivité par mole d’unité un radioligand)23et avec une quantité limitée de dégradation chimique. Un grand nombre de radioligands de ligands connus est étiqueté avec tritium9,10,24,25,26, qui déduit plusieurs avantages. Tout d’abord, le tritium (3H) se caractérise par une longue demi-vie (12,43 années) favorisant la conservation à long terme de chaque lot. Deuxièmement, l’interaction ligand-cible n’est pas faussée par les radionucléides, comme 3H-ligands sont biologiquement impossible à distinguer de leurs composés de parent. Tritium émet β de faible énergie–-particules qui voyagent uniquement de courtes distances en tissu ayant pour résultat une résolution spatiale élevée et, par la suite, la plus grande distinction entre anatomiques structures4. Néanmoins, tritium étiquetage ne peut être produit pour donner des activités spécifiques modérément élevées. Cela est dû au fait que disponible 3H-sources sont contaminés avec de l’hydrogène non radioactif. Généralement, plus l’activité spécifique, moins radioligand est nécessaire pour produire la détection sensible23. En outre, il convient de considérer que 3H-ligands ont la possibilité de subir l’échange d’hydrogène avec l’eau selon la stabilité de la 3H-étiquette. Afin de compenser la faible expression ou trop faible activité spécifique, iode-125 peut servir le radionucléide13. L’activité spécifique maximale d’iode-125 est environ 100 fois supérieure à celle du tritium. Toutefois, plusieurs considérations supplémentaires doivent être faites lorsque vous travaillez avec l’iode-125. Par exemple, l’ajout d’iode-125 normalement induit des altérations structurales dans la molécule qui peuvent avoir une incidence les interactions ligand-cible. Comme l’iode-125 a une demi-vie de 60 jours, correction pour la désintégration quotidienne devrait bénéficier d’activité spécifique et la quantification d’interactions ligand-cible23. 125 J’ai-ligands émettant des photons γ et malgré une sensibilité beaucoup plus élevée, de produire des images de résolution inférieure. Cela est dû à la relation inverse entre la résolution et l’énergie maximale de l’isotope (tel que discuté ci-dessous). Enfin, par rapport au tritium, plus il faut lors de la manipulation d’iode-125 en raison de l’énergie plus élevé du radionucléide.

Selon le nucléide, épaisseur de coupe de tissus peut influencer la résolution. Le β de faible énergie–-rayonnement du tritium limite sa portée de tissu d’environ 5 µm à cause de l’égoïsme. En conséquence, quantification n’est pas influencée par l’épaisseur de tissus lorsque l’épaisseur de coupe est supérieure à 5 µm27,28. En revanche, la désintégration radioactive des isotopes de haute énergies a une plus grande pénétration tissulaire, résultant en basse résolution de l’image, parce que les ligands avec une plus grande distance au milieu de détection contribuent également à la formation d’images. En conséquence, les sections minces promouvoir une résolution plus élevée pour les radionucléides à haute énergie1.

La mise en place d’un protocole autoradiographique nécessite la connaissance des conditions de fixation optimale (par exemple, tampon, pH et température) et des paramètres pharmacologiques du radioligand en termes d’affinité et de la cinétique. Si le radioligand n’a pas été caractérisé avant, des études exploratoires sont nécessaires29. Choisir une concentration optimale de radioligand est guidé par l’affinité du radioligand et l’abondance des sites de liaison. Normalement, une concentration de 5 - 6 fois Kd sert à s’assurer que tous les sites de liaison sont saturés30. Une autre approche vise à donner le ratio le plus élevé de total-à-non-spécifiques contraignant en sélectionnant radioligand concentrations inférieures Kd31 et en enregistrant des radioligands solution en même temps. Cette approche est particulièrement utile lorsque l’accepteur est très abondante dans les tissus examinés car radioligand haute concentration augmenterait les chances de sursaturer les autoradiogrammes, comme le cas pour la [3H] HOCPCA et le GHB de haute affinité sites de liaison9. En outre, afin efficacement l’ensemble de la population de la protéine ciblée, au radioligand devrait idéalement lier toutes les conformations cible possible. Surtout en autoradiographie des récepteurs, l’utilisation d’agonistes peut révéler seulement partielle plusieurs récepteurs totales puisque certaines peuvent être présents dans les États de faible affinité agoniste. En revanche, antagonistes neutres plus souvent preuve d’affinité pour les récepteurs États26,29.

Par ailleurs, des expériences de liaison sont généralement effectuées dans des conditions de liaison équilibre. Par conséquent, le temps nécessaire pour atteindre l’attache d’équilibre dans les conditions expérimentales souhaitées (concentration fixe radioligand, tampon et température) doit être déterminé dans les expériences d’association afin d’assurer la liaison de l’équilibre dans le cadre de la expérimenter4,23,30. Après incubation de radioligand, radioligand indépendant est lavé par plusieurs incubations avec tampon et généralement suivie de rinçage en distillée H2O. Signal-bruit ratio peut être optimisé en ajustant la température et la durée selon le le taux de dissociation des radioligands26,30,31.

Radioligands peut afficher les liant à des matériaux non biologiques, c'est-à-direnon-spécifiques. Radioligands cellulaire composants autres que la cible est définie comme la liaison non-spécifique. La contribution de liaison non-spécifique au montant total de radioligands est évaluée en présence d’un ligand concurrent étiqueté qui cible le même site de liaison comme au radioligand. Que le composé non radioactif (piston) est alimenté en 10,000-fold excès, il occupe le site de liaison et au radioligand pouvez lier uniquement aux sites26,31,32hors cible. Fondamentalement, le composé non étiqueté devrait être une structure chimique différente que radioligand car cela diminue le risque de déplacer les deux liaison spécifique ainsi que non-spécifiques23. Liaison non spécifique découlant de liaison aux membranes peut être un problème majeur, particulièrement dans le cas des radioligands assez lipophiles. Dans certains cas, un lavage procédures peuvent supprimer non récepteurs radioligand lié et donc améliorer le spécifique liant les ratios29.

Lors du choix d’un tampon, il est crucial d’examiner l’effet du pH et de la force ionique sur l’interaction ligand-cible. Les interactions électrostatiques en particulier entre les ligands polaires et composants hydrophiles des sites de liaison sont influencées par la force ionique du tampon. Par conséquent, une supplémentation en ions monovalentes et bivalents peut-être avoir une incidence l’affinité apparente constante23,33. Si on ne connaît pas la composition du tampon optimale pour l’interaction ligand-cible étudiée, différents tampons communes devraient être examinés dans les expériences pilotes. Tampons peuvent également être complétées par des antioxydants comme l’acide ascorbique et inhibiteurs de dégrader les enzymes29,34. En outre, l’ionisation des groupes spécifiques ou dans le site de liaison sur le ligand elle-même est influencée par le pH et a un effet critique sur la constante de fixation de l’équilibre, les constantes cinétiques et non-spécifiques23,33. Par exemple, sondant le GHB de haute affinité binding site avec différents GHB radioligands joliment illustre l’importance du pH sur cette cible de liaison (Figure 6). Caractérisant le pH optimal pour l’interaction ligand-récepteur peut également donner des indices sur l’importance de l’objectif en ce qui concerne sa pertinence biologique.

Un autre facteur critique dans l’autoradiographie numérique est la durée d’exposition, c'est-à-dire, le temps nécessaire pour atteindre les autoradiogrammes quantifiables en exposant les coupes de tissus radiomarqué à plaques-images au phosphore. Estimations sont basées sur la quantité de radioactivité dans l’échantillon, l’énergie et la demi-vie de l’isotope ainsi que le rapport signal-bruit souhaité. En particulier, prolongé résultats de temps d’exposition en images saturées et signal de fond élevé. Signal de fond élevé peut être réduite en stockant des cassettes dans les environnements de plomb blindé pour éviter les radiations cosmiques1,4. Néanmoins, si autoradiogrammes sous-optimale sont atteints, l’échantillon peut être exposé plusieurs fois, pourvu que le complexe ligand-cible est fixe et la demi-vie du radionucléide lui permet.

Images de plaques au phosphore peuvent être réutilisé et avoir une longue durée de vie lorsque géré correctement, c'est-à-dire, la flexion doit être évitée et les plaques doivent être stockés dans un endroit sec. La manipulation des images de plaques au phosphore est guidée par leur sensibilité à la lumière et les rayons cosmiques. Ainsi, il est important d’effacer la plaque avant chaque utilisation afin de minimiser le signal de fond. Exposition des sections de tissu radiomarqué à des plaques d’imagerie se faite en cassettes blindé rayonnement complètement dépourvu de lumière. Lors du transfert de la plaque au scanner à la fin de la durée d’exposition, toute lumière ambiante devrait également être évitée car même bref contact avec la lumière blanche réduit signal accumulé. En outre, plaques devraient être analysés immédiatement après l’enlèvement de l’échantillon pour éviter l’effacement de signal. Un inconvénient de l’utilisation des images de plaques au phosphore est l’apparition potentielle d’artefacts et résiduelle « images fantômes » après une utilisation répétée des plaques1.

L’utilisation de tritium exige d’imagerie des plaques sans un revêtement protecteur pour permettre le rayonnement de faible énergie atteindre les cristaux de phosphore. Plaques d’imagerie sensibles au tritium phosphore sont donc plus sensibles à la contamination ou de dommages causés par une manipulation incorrecte. Une fois contaminées, les plaques sensibles au tritium ne peut pas être nettoyés et doivent être remplacés. Fixation du complexe ligand-cible avec la vapeur PFA réduit le risque de contamination de la plaque, en allongeant sa durée de vie. En outre, déshydratation des tissus à la suite de la fixation est une étape cruciale puisque les plaques sensibles de tritium sont sensibles à l’humidité. En raison de sa nature délicate, les plaques sensibles au tritium ne devraient pas servir d’autres isotopes1,4. En revanche, les plaques pour des isotopes tels que l’iode-125 sont plus robustes et leur surface peut même être nettoyée en frottant avec l’éthanol à 70 %.

Traditionnellement, film sensible a été utilisé pour l’inscription spatiale de désintégration radioactive. Alors que les images à haute résolution peuvent être obtenues, l’autoradiographie film présente plusieurs limites. Outre la nécessité de produits chimiques dangereux et une chambre noire pour le développement, des films radiographiques se caractérise par une étroite plage dynamique. Par conséquent, il peut être nécessaire d’exposer des sections radiomarquées à plusieurs reprises avec des temps d’exposition différents pour atteindre quantifiables images non saturée35. En outre, radiographie pièces sensibilité limitée, ce qui entraîne des temps d’exposition soutenue pour les spécimens marqués avec des isotopes à faible consommation d’énergie, c’est à dire. désintégration du tritium peut nécessiter plusieurs mois d’exposition. Faible sensibilité combinée avec petite plage linéaire rend la technique extrêmement laborieux, surtout quand les conditions de dosage optimale doivent être déterminée première1,35.

Avec le développement des plaques-images au phosphore, plusieurs de ces limitations ont été adressés35,36,37. Les plaques d’imagerie permettent de stocker temporairement des images de désintégration radioactive, représentant l’arrangement spatial des radioligands dans l’échantillon de tissu. Cristaux de phosphore Photostimulable BaFBr:Eu2+ servent à capter l’énergie radioactive émis par l’échantillon, sous forme de résultats de rayonnement (par exemple, les rayons x, rayons gamma ou particules bêta) de haute énergie dans l’excitation de l’UE2+ UE3+ et piégeage conséquent de l’électron libéré dans le phosphore en treillis4,37. Exposition de la plaque d’imagerie à la lumière visible ou infrarouge renverse la réaction, c'est-à-dire, l’électron piégé est libéré et au cours de la transformation de l’UE3+ Eu2+ luminescence est émis. La lumière émise est proportionnelle à la quantité de radioactivité et sa détection par un photomultiplicateur permet la création d’un autoradiogram numérique37. Ce système permet une augmentation de sensibilité accompagnée d’une réduction sensible du temps d’exposition des mois aux jours3. En plus de cela, la gamme dynamique linéaire est considérablement augmentée, qui réduit les risques d’images sursaturées. Linéarité est donnée dans les quatre ou cinq ordres de grandeur et a été validée à plusieurs reprises3,35,36,37,38. Bien que l’autoradiographie film offre toujours une résolution spatiale supérieure, efforts en technologie de numérisation ont abouti dans l’amélioration de la résolution de 300 à 25 µm (taille des pixels), ce qui permet la différenciation détaillée entre régions anatomiques3. Dans l’ensemble, les plaques d’imagerie de phosphore facilitent l’acquisition de digital autoradiogrammes tant en raison d’une augmentation linéaire et la sensibilité. Durée d’exposition réduite et une technique de développement simplifié considérablement conduisent à une diminution de temps pour l’analyse des données permettant des débits plus élevés.

Par rapport à l’autoradiographie, paramètres pharmacologiques utiles tels que l’affinité et la densité sont aussi couramment caractérisées par l’application de radioligands dans l’homogénat tissulaire, tests de liaison. Cette méthode a l’avantage de produire des résultats en mesurant la radioactivité β-émis avec un détecteur à scintillation liquide dans une manière efficace2. Cours d’exécution dans une approche de puits multiples, par exemple, en microplaques 96 puits, ces tests sont utiles pour le criblage de bibliothèques de composés et pour un plus grand nombre des relations concentration-dépendante. En plus de cela, effectuer une analyse de la saturation avec cette configuration est souvent plus possible par rapport à l’autoradiographie, qui présente un risque d’images saturés avec des concentrations élevés radioligand. Cependant, effectuant des déplacements homologues d’une concentration de radioligand basse fixe avec des ligands non radioactif afin d’obtenir Kd et Bmax contourne le problème des images sursaturé (Figure 6)22. Autoradiographie et la liaison de l’homogénat produisent des estimations semblables pour les constantes d’affinité ligands tandis que la densité des tissus de la protéine d’intérêt peut être sous-estimée dans la liaison de l’homogénat. Ainsi, il a été proposé que rupture de membrane cellulaire concomitante avec homogénéisation des tissus pourrait entraîner la perte de récepteurs ou altéré contraignant conditions3,,33. En outre, erreurs dans la dissection des tissus pourraient produire des homogénats contaminés avec des tissus provenant des régions du cerveau adjacent. En comparaison, les modèles de liaison complexe même dans petits noyaux sont visualisées et dérivable en raison de la résolution spatiale anatomique en autoradiographie3,,33.

Immunohistochemistry visualise également la distribution d’une protéine d’intérêt anatomique. La méthode est capable de produire des images à haute résolution anatomique, comme composants de tissus distincts peuvent être identifiés au niveau cellulaire et subcellulaire même au microscope électronique. Niveaux d’expression sont évalués en fonction de l’intensité de la coloration. Néanmoins, une quantification absolue des niveaux d’expression est difficile en raison de l’absence de normes de référence approprié39. En outre, immunohistochimie dépend de la disponibilité d’un anticorps sélective, bien validée qui est souvent un problème dans la recherche du récepteur.

Avant de décider sur l’exécution en vitro autoradiographie, plusieurs facteurs dont il faut faire. Tout d’abord, préparation de tissus post-mortem dont la section ainsi que le gel et le dégel répétés susceptibles d’influencer la préservation de la liaison de sites2. En outre, la méthode dépend de la disponibilité d’un radioligand adéquate, qui affiche de haute affinité et la sélectivité de la cible en question2. Radioligand ne doit pas afficher importante liaison aux sites hors-cible, et il doit également démontrer un profil cinétique favorable. Ceci est nécessaire car le complexe ligand-cible doit rester intact lors de la portée de l’expérience. En outre, lorsque des composés non-radioactifs adaptés existent, l’introduction du radionucléide pourrait devenir un facteur critique. Ainsi, la molécule d’intérêt devrait être équipée des groupes fonctionnels adaptés pour radiomarquage efficace, qui permet la production de radioligands avec suffisamment de forte activité spécifique et stabilité chimique40. Un autre inconvénient de in vitro autoradiographie, c’est que la méthode ne permet l’utilisation d’un animal une fois. Plus élégamment est l’extension in vivo de l’imagerie des méthodes telles que position émission de positons (TEP), qui permet une numérisation répétées du même animal et détermination du taux d’occupation et les caractéristiques de la liaison dynamique. PET est particulièrement utile pour l’étude de la plus élevée de mammifères41 et d’optimisation de dose dans les études précliniques 42,43,44.

Plusieurs modifications de la technique d’autoradiographie étendent son application tant sur le plan de la caractérisation des cibles pharmacologiques dans les États sains et malades, ainsi qu’au développement et à la découverte de médicaments. Tout d’abord, les progrès récents dans la technologie d’imagerie ont conduit au développement d’autoradiographie en temps réel. Détecteurs de gaz de particules α/β inutile le film ou des plaques d’imagerie par la mesure directe de désintégrations, produisant ainsi des autoradiogrammes numérique rapide45.

En outre, in vitro l’autoradiographie permet aux études des fonctionnalités de récepteurs couplés à la protéine de G (RCPG) au sommet de l’information sur leur distribution anatomique dans les tissus post-mortem. Cette variante de la méthode implique d’incubation des sections de tissu avec un analogique radioactivement marqué de la guanosine triphosphate (GTP), c.-à-d. [35S] guanosine 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), accompagnée d’une agoniste non radioactif de la GRCP. Quand l’agoniste lie et suscite une réaction de la GRCP, l’incorporation de [35S] GTPγS peut être localisée et quantifiés par autoradiographie, qui reflète seulement les récepteurs activés population2,46,47 .

Ex vivo autoradiographie représente une autre version de la technique, qui permet d’évaluer la liaison régionale un radioligand après administration à un animal de laboratoire vivant. Après le sacrifice de l’animal, cryosectioning du tissu en question et résultat exposition autoradiographique dans les autoradiogrammes qui reflètent au radioligand binding in vivo2. Ex vivo autoradiographie est couramment employée dans les programmes de découverte et le développement de médicaments afin d’obtenir des informations sur le profil pharmacocinétique d’un plomb composé, c'est-à-dire son absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) . Autoradiographie du corps entier en particulier donne un aperçu sur la distribution de la drogue à tous les organes et les tissus. Cependant, détermination des non-spécifiques et quantification est plus difficile par rapport à in vitro l’autoradiographie en raison de la possible métabolisme et la dégradation du radioligand et aucun moyen pour emporter non consolidé ligand48.

Autoradiographie est également utilisé pour les essais préliminaires et la caractérisation des ligands de PET4. Les radionucléides haute énergie carbone-11 et le fluor-18 sont plus souvent utilisés pour des ligands de PET. PET est une application proéminent, non invasif pour radioligands parce que les images 3D quantifiables du radioligand contraignantes dans un animal vivant peuvent être obtenus11,40,49.

Autoradiographie d’in vitro à l’aide d’images de plaques au phosphore représente une méthode utile pour la caractérisation pharmacologique des interactions ligand-cible. La méthode produit des résultats reproductibles par l’application d’un protocole relativement simple et rapide une fois que les conditions d’essai optimales ont été établies. Répartition anatomique d’une protéine d’intérêt est déterminée au sein de son microenvironnement native, qui permet l’étude de son rôle physiologique, pharmacologique et pathologique dans les tissus sains et malades post-mortem des animaux d’expérimentation ainsi que les humains2,47.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Le travaux ont été subventionnés par la fondation de Lundbeck (Grant R133-A12270) et le Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Les auteurs remercient Dr Aleš Marek pour la fourniture du radioligand [3H].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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Neurosciences numéro 145 Radioligand radioactif autoradiographie affinité expression imagerie de phosphore HOCPCA Gamma-hydroxybutyrique acide GHB NCS-382 quantitative pharmacologie
Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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