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Neuroscience

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

Abstract

Autoradiography 생체 외에서 인간 뿐만 아니라 실험 동물에서 조직에 관심사의 단백질의 해부학 적 분포를 시각화 하는 것을 목표로. 메서드를 생물 학적 대상 radioligand의 특정 바인딩을 기반으로 합니다. 따라서, 언된 조직 단면도 radioligand 솔루션, 알을 품는 그리고 대상 바인딩 이후 지역화 방사성 붕괴의 탐지에 의해 예를 들어 감광 필름 또는 인광 체 격판덮개를 이미징 사용 하 여. 결과 디지털 autoradiograms 정량화 및 지역화 radioligand 바인딩 다른 해 부 구조에서의 놀라운 공간 해상도 표시 합니다. 또한, 정량화 바인딩 사이트 (B최대) 선택 된 조직에서의 밀도 뿐만 아니라 분리 상수 (Kd), (K나) 저해 상수에 의하여 ligand 선호도 약리 특성에 대 한 수 있습니다. 따라서, 메서드는 대상 지역화 및 리간드 선택에 대 한 정보를 제공합니다. 여기, 기술은 높은 선호도 γ-hydroxybutyric 산 (GHB) 바인딩 바인딩 분석 결과 관한 방법론 고려 사항에 특별 한 강조와 포유류 뇌 조직에서 사이트의 autoradiographic 묘사와 궁 행 매개 변수는 radioligand 및 검출 방법의 선택.

Introduction

Autoradiography는 방사성 붕괴의 이미지를 제공 하는 방법입니다. 기술은은 정기적으로 관심 생체 외에서 기반 radiolabelled 화합물과 그 대상 간의 특정 약물 상호 작용에의 한 단백질의 조직 분포를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 대상에 대 한는 리간드의 선택도 대 한 직접적인 정보를 제공합니다. 생체 외에서 autoradiography도 사용할 수 있습니다 결정 뿐만 아니라 약리 바인딩 매개 변수 분리 상수 (Kd) 및 (B최대), 바인딩 사이트의 밀도 같은 radioligands의 양적 결정 경쟁 ligands1,2의 저해 상수 (Ki). 전통적인 homogenate radioligand 바인딩에 비해 autoradiography 공간 해부학을 시각화 수 있는 그리고 지역 식 패턴3의 간결 상세히의 이점이 있다. Autoradiography 방법 따라서 검증 된 항 체의 부재에 (서) 특히 immunocytochemistry에 관련 대안입니다. Autoradiography 쉽게 필요한 약리학 특이성, 톰 cryostat 준비 조직 단면도, 및 적합 한 이미징에 대 한 액세스와 함께 적합 한 radioligand의 가용성을 주어진 표준 방사성 동위 원소 실험실에서 구현 각 조직 섹션에서 방사능의 분포를 분석할 수 있는 장치. 특히,는 radioligand에 대 한 중요 한 선택 기준이 아닌 대상 사이트에 바인딩 제한 금액입니다. 이 다른 단백질, 세포 막 또는 플라스틱 또는 필터, 등 자료 수 있으며 일반적인 바인딩 통칭. 일반적으로, 비 특정 바인딩 비 있는 하지만 있는 특정 오프 대상 단백질을 포함 될 수 있습니다. 사실 특정 바인딩 유효성을 검사 하는 가장 좋은 방법은 조직 부족 대상, 예를 들면, 유전자를 비교 (녹아웃) 조직4설계 된다.

여기, 방법론은 포유류 두뇌에서 γ-hydroxybutyric acid (GHB)의 높은 친 화력 바인딩 사이트의 autoradiographic 묘사와 그림입니다. GHB는 narcolepsy 및 알코올 중독5, 치료 뿐만 아니라 포유류 두뇌와는 레크리에이션의 자연 구성 모두 임상적으로 유용한 약물 관련성의 이다 GHB와 그것의 바인딩 사이트 간의 약리 상호 작용 이해 약6. 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 처음 쥐 뇌 homogenate7[3H] GHB 바인딩을 사용 하 여 설명 했다. 년 동안, 더 autoradiography 연구 [3H] GHB와 아날로그 [3H] NCS 382 바인딩 사이트 쥐8,,910, 마우스9 개 지역에서의 높은 밀도 보였다는 11와 원숭이/인간 두뇌12돼지. 그러나, 분자 정체성과 이러한 바인딩 사이트의 정확한 기능 관련성은 애매 남아 있다.

의도 바인딩 사이트 추가 하 고 GHB의 생리 적 역할에 대 한 연구를 촉진 하기 위하여, 다른 동위 원소 다른 선호도 부여를 통합 하는 여러 radioligands 개발 되었습니다 ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA와 [125나] BnOPh GHB)13,,1415,16(17에서 검토) (그림 1). 선택적인 높은 선호도 radioligands와 바인딩 사이트 이미징 기술9,11형광체를 사용 하 여 높은-품질 이미지의 생산에 대 한 허용의 매우 높은 조직 밀도의 조합. 세부를 예증 하는 autoradiographic 실험 및 그림 설정에 실용적인 포인트의 개요, 함께 토론 섹션의 방사성 핵 종 i) 선택, ii) 분석 결과 조건, 선택 및 iii) 형광체의 사용을 강조 합니다. x 선 필름 대 이미징 접시입니다. 이 종이의 전반적인 목표는 조직 분포 및 단백질 목표의 약리학 분석에 대 한 알리는 autoradiography 기술에 기술, 방법론 및 과학적인 세부 사항을 제공.

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Protocol

모든 동물 처리 덴마크어 동물 실험 검사자에서 지침에 따라 수행 되었다.

참고: 여기에 설명 된 프로토콜 커버 조직 준비 (즉, 마우스 뇌 조직), 생체 외에서 autoradiographic 분석 결과 새로운 실험실에서 메서드, 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 설정에 대 한 충분 한 세부 사항에서 뿐만 아니라 지역화 및 다른 해 부 구조에 radioligand 바인딩 측정의 목적으로 autoradiograms (그림 2)의 후속 densitometric 분석. 비교를 위해 조직학, cresyl 보라색 얼룩이 지는 프로토콜 포함 되어 있습니다. 또한, 일반적인 경쟁 ligand 바인딩 결정 프로토콜 내에서 포함 되어 있습니다. Kd, B최대 또는 K나확인 하는 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시4를 참조 하십시오.

1. 조직 준비 Cryosectioning

  1. 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사 하 고 즉시가 위와 집게를 사용 하 여 뇌를 해 부. 직접 조직 손상을 방지 하려면 다음 단계를 진행 합니다.
  2. 스냅-동결 조직 침수에 의해 가루 드라이 아이스, 기체 CO2 또는 isopentane. 직접-20 ° c.에 설정 온도와 냉동된 조직 한 cryostat에 전송 또는 처리까지 조직-80 ° C에 저장 합니다.
    참고: 반복된 녹고/동결 조직 손상을 줄이기 위해 피하십시오.
  3. 추가 조직 산 산 조각 방지 하기 처리 하기 전에 20 분 동안 cryostat에-20 ° C에 적응 하는 조직 하자.
  4. 포함 매체는 cryostat 외부 조직 홀더를 커버 하 고 포함 매체는 여전히 액체 동안 신속 하 게 원하는 방향에서 동결된 조직 표본을 장소. 예를 들어, rostral 코로나 섹션을 달성 하기 위하여 수직으로 소 뇌에 쥐의 뇌를 놓습니다. 조직 홀더는 cryostat 다시 전송 하 고 노출 온도 아래에 포함 매체 강화-10 ° C.
    참고: 연약한 조직 표본 장착 전에 조직 금형 내에서 매체를 포함에 코팅 한다.
  5. 조직 홀더는 cryostat의 톰에 위치. 경사 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정 합니다.
  6. 잘라 원하는 두께의 섹션에서 stereotaxic 아틀라스18 의 지도 함께 조직 (12 µ m [3H]에 대 한 권장 ligands를 표시). 신중 하 게 제대로 필요한 경우 작은 크기의 브러시와 섹션을 펼쳐 고 해 동 실장 현미경 슬라이드에 섹션. 순차적으로 원하는 기술 복제 (예를 들어, 슬라이드 당 4 섹션)에 대 한 관심의 영역에서 섹션을 수집 합니다.
  7. 1 시간에 대 한 추가 처리 하기 전에 건조를 슬라이드에 섹션 수 있습니다.
    참고: 슬라이드 상자를 건조 시키는 물자의 추가 습기 직물 단면도에 구축을 최소화합니다. Procotol 일시 중지 할 수 여기 섹션 장기-80 ° c.에 슬라이드 상자에 저장 하 여

2. 생체 외에서 Autoradiography

주의: 방사능. 지역 규정에 따라 인증 된 실험실에서 작동 합니다. 보호복을 착용 하십시오. 되거나 방사성 붕괴에 따라 삭제 인증된 회사에 아웃소싱.

  1. 실 온 (RT)에서 적어도 30 분 동안 섹션 녹여 실험 조건으로 슬라이드를 레이블을 지정 합니다. 연필을 사용 하 여 슬라이드 후속 얼룩 동안 에탄올에 목욕 것입니다 때문에.
  2. 플라스틱 쟁반에 슬라이드를 가로로 놓습니다.
    참고: 슬라이드 플라스틱 트레이 내 상승 된 플랫폼에 위치 그들의 처리를 촉진 한다.
  3. 미리 incubate 섹션 분석 결과 버퍼에서 슬라이드에 조정 문제의 대상 (GHB 프로토콜, 50mm KHPO4 버퍼 pH 6.0 사용)에 대 한 슬라이드 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L)에 적절 한 볼륨을 신중 하 게 적용 하 여.
    참고: 모든 섹션 액체와 완전히 덮여 있는지 확인 합니다.
    1. 증발을 방지 하 고 지속적인 부드러운 (20 rpm) 판 통에 떨고 (GHB 프로토콜 사전 incubate RT에서 30 분)에 대 한 관련 온도에서 미리 품 어 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반을 커버.
    2. 일반적인 바인딩 결정에 대 한 분석 결과 버퍼 (GHB 프로토콜, 1mm GHB)에 대 한 unlabelled 화합물의 관련 농도를 보충.
      참고: 사전 부 화 필요 없을 수 있습니다.
  4. 각 슬라이드에서 사전 부 화 액체를 부 어와 슬라이드를 다시 플라스틱 쟁반에 전송.
  5. 탈수를 피하기 위해, 즉시 원하는 조건에서 분석 결과 버퍼에서 radioligand의 관련 농도 단면도 품 어 (GHB 프로토콜, 1 nM [3H] RT에서 1 h HOCPCA)는 radioligand로 섹션을 취재 하 여 솔루션 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L).
    1. 닫힌된 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반의 지속적인 부드러운 (20 rpm) 떨고 아래에서 품 어.
      참고: radioligand 농도 액체 섬광 카운터에서 약 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다.
  6. 액체를 붓는 의해 부 화 솔루션을 제거 하 고 현미경 슬라이드 랙 슬라이드를 전송. 즉시 섹션 탈수를 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다.
  7. 슬라이드를 씻어. GHB 프로토콜에 대 일 분을 제거 하는 방법에 얼음 처럼 차가운 증류수로 가득 쟁반으로 슬라이드 랙 찍기로 두 번 차가운 분석 결과 버퍼 두 번 20 s와 다음 린스 세척. RT에 적어도 1 시간에 대 한 공기에 대 한 선반에서 슬라이드를 수직으로 위치 또는 차가운 온도를 설정 하는 송풍기와 5 분에 대 한 슬라이드를 건조.
    참고: 세척 최적화 해야 합니다, 예를 들어, 광범위 한 세척 비 특정 바인딩 감소에 도움이 될 수 있습니다.
  8. 슬라이드 fixator paraformaldehyde (PFA) 파우더 PFA RT에서 수증기와 함께 하룻밤 고정을 위한 ligand 대상 단지의 무결성을 보호 하기 위해 포함 된 전송.
    주의: PFA 독성이 있다. 에 위치 fixator 후드를 연기 하 고 PFA와 피부/눈 접촉을 피하기 위해.
  9. 다음 날, desiccator 상자 습기를 제거 하는 RT에 3 h에 대 한 실리 카 젤을 포함 하는 슬라이드를 전송 합니다.

3. 형광 이미징 접시와 검색에 노출

  1. 향하도록 하는 조직으로 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치 합니다. Radioligand 바인딩의 후속 정량화에 대 한 모든 카세트 [3H] 미 포함. 섹션을 무작위로 정렬 하 고 같은 카세트에 직접적인 비교에 대 한 섹션을 노출.
  2. 축적 된 신호 저장에서 제거 배경 신호를 제거 하 고 사용 직전 접시를 이미징 움 민감한 형광체를 지웁니다. 따라서, 형광 이미징 시스템으로 접시를 로드 하 고 표시/적외선 제조업체의 지침에 따라 빛에 노출.
  3. 형광 이미징 시스템에서 접시를 제거 하 고 즉시 카세트에 섹션에 놓습니다. 카세트 완전히 닫혀 있는지 확인 합니다. 빛 으로부터 차폐 된 RT에서 3 일 동안 형광 이미징 접시에 섹션을 노출 합니다.
  4. 빛 지웁니다 이미징 접시에서 신호, 때문에 신중 하 게 카세트 어둠 속에서 및 즉시 이미징 접시 인 영상의 어둠 상자에 전송 열거나 형광체 영상 어두운 공간에 둡니다.
    참고: 분석 후 디지털 이미지에서 개별 견본을 식별 하기 위해 노출 하는 동안 슬라이드의 공간 배열 notate 있는지 확인 합니다. 따라서 형광 이미징 접시는 또한 디지털 사진에 있는 접시의 정확한 방향을 확인 하기 위해 고유한 각도에서 잘라 한 구석에 표시.
  5. 높은 해상도 디지털 이미지를 얻을 수에 접시를 검사 합니다.

4. 선택 사항: Cresyl 조직 단면도의 보라색 얼룩

  1. Cresyl 바이올렛 아세테이트 이온된 수 (dH2O)의 500 ml의 5 g을 혼합 하 여 1 %cresyl 바이올렛 솔루션 준비 (약 2 시간) 녹아 때까지. 새로운 500 mL 병으로 깔때기를 사용 하 여 필터 종이 통해 필터링. PH 3.5-3.8를 조정 합니다.
  2. 위치 슬라이드 얼룩 증기 두건에서 설정합니다. 트레이 (크 실 렌)을 제외 하 고 백색 폴 리 프로필 렌 쟁반에서 다음 솔루션으로 준비:
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% 에탄올
    d. 100% 에탄올
    e. 100% dH2O
    f. 1 %cresyl 바이올렛
    g. 0.07% 초 산 (dH2O의 250 mL에 아세트산의 175 µ L 추가).
    헤 녹색 용 매 저항 트레이 자일 렌 100%
    i. 100% 녹색 용 매 저항 쟁반에 크 실 렌
  3. 증기 두건에 슬라이드를 이동 하 고 슬라이드 선반에 넣어.
  4. 1 분에 대 한 슬라이드를 담거 서 100% 에탄올 (트레이 a-d)로 dH2O에서에서 에탄올의 증가 등급된 시리즈를 통해 지질을 분해.
  5. DH2O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션
  6. Cresyl 보라색 10 분 솔루션에서 표본 담가.
  7. 린스는 표본 0.07% 아세트산에 dH2O 1 분 동안에 담거 서 4-8 미 세척에 대 한 부드럽게 위아래로 슬라이드 슬라이드를 해제 하 여.
  8. 표본 30에 대 한 슬라이드의 침수로 탈수 에탄올 (트레이 a-d)의 농도 오름차순에서 s.
  9. 100% 크 실 렌 (트레이 h와 나) 에탄올을 끄다의 두 쟁반을 통해 표본 전송.
  10. DH2O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션
  11. 집게와 염 분에서 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드 당 미디어를 장착 하는 유기 용 매를 몇 방울을 추가 하 고 24 x 60 m m coverslip 견본을 보호 하기 위해 상단에 추가. coverslip에 부드럽게 눌러 견본 coverslip 사이의 기포를 제거 합니다.
    참고: 크 실 렌 건조 방지 하기 위해 설치 하는 동안 나머지 슬라이드 하십시오.
  12. 건조 슬라이드 실시간에 증기 두건에서 하룻밤
  13. 현미경 및 1.25 X 목표 표본 그림을 가져옵니다.

5. densitometric 디지털 이미지 분석

  1. 각 교정 이미지 분석 소프트웨어와 함께 [3H] 눈금에서 표준의 상대 광학 밀도 (막대)를 측정 합니다.
    1. 메뉴 항목 지역 결정 지역 창조 를 위한 도구를 사용 하 여 [3H] 눈금의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택 합니다. 메뉴 항목 레이블아래 번호 를 클릭 하 여 각 선택된 영역에 번호를 할당 합니다.
    2. 클릭 하 여 표준 교정의 각 지점에 대 한 OD 값을 내보내기 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서. 스프레드시트를 로드 값을 전송 하 고 선택 된 영역의 크기에 의해 정상화. 추가 densitometric 분석에 대 한 표준 곡선을 얻기 위해 선형 회귀를 수행 합니다.
      참고: 선택된 영역 일치 막대 값과 샘플 식별 표시는 다는 것을 확인 하십시오.
  2. 독자적인 영역을 선택 하 여 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 autoradiograms의 정량화를 수행의 (수익 ROI) 모든 섹션 영역 생성 도구를 사용 하 고 그것의 ODs를 측정. 복사 하 고 각 autoradiogram에 대 한 뇌 해부학에서 사소한 변화에 수동으로 조정 관심 영역에 대 한 템플릿을 만들어 모든 섹션에 동일한 영역을 선택 합니다. 뇌 아틀라스18와 autoradiograms의 비교 하 여 투자 수익의 해부학을 식별 합니다. 여러 치료법을 비교 하면 눈을 멀게 하 고 편견된 다양 ROIs 피하기 위하여 무작위로 분석을 수행 합니다.
  3. 수출 막대 값 및 선택 된 영역의 크기를 클릭 하 여 스프레드시트에 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서.
  4. 특정 지역 당 밀도 얻기 위해 그것의 지역에 의해 선택 된 ROI의 측정된 막대를 나눕니다.
  5. 접시의 백그라운드의 로드를 측정 하 고 스프레드시트에 해당 하는 막대 값 영역 크기를 수출. 각 투자 수익의 모든 막대 값에서 평균 배경 신호를 뺍니다.
  6. 평균 기술 복제, 즉, 섹션의 봉 같은 동물에서 직물을 사용 하 여 복제 합니다.
  7. 표준 곡선을 사용 하 여 봉 radioligand 바인딩, 즉의 단위로 변환., nCi/mg 조직 등가물 (테).
    참고: 용어 테 표준 조직 시뮬레이션 자료로 생성 되 있기 때문에 사용 됩니다.
  8. Radioligand (식 1)의 특정 활동에 따라 바인딩 nmol/mg 테 nCi/mg의 변환 하 여 표현 한다.
    Equation(1)
  9. 특정 바인딩 값을 얻기 위해 일반적인 바인딩을 총 바인딩에서 뺍니다.
  10. 평균 기술의 평균을 사용 하 여 모든 생물 복제의 바인딩 (단계 5.6에서 얻은) 각 동물의 복제 합니다.

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Representative Results

설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 해부학 적 분포 radiolabelled GHB 아날로그 [3H] 함께 가시화 했다 코로나, 화살 및 수평 섹션 (그림 3으로 잘 렸는 쥐의 뇌에 HOCPCA ). 높은 수준의 바인딩 해 마와 대뇌 피 질에서 관찰 되었다가 낮은 바인딩 및 바인딩 없음 검색 되었습니다, 소 뇌에 해당 하는 높은 선호도 GHB 사이트9,10의 이전 보고 식 패턴 11,12. 다음과 같이, 해 부 구조 수 있습니다 시각 될 다른 단면 평면을 사용 하 고 해 부 무결성 cresyl 보라색 얼룩에 의해 지원 될 수 있습니다. GHB 높은 친 화력 바인딩 사이트에 대 한 낮은 radioligand 바인딩, 소 뇌, 등으로 특히 지역 조직 (그림 3)의 후속 얼룩과 확인 됩니다. 코로나 섹션 문학9,10에서 가장 많이 발견 된다. 그들은 양적으로 실용적인 한 두뇌에서 섹션의 더 높은 금액을 얻을 수 있습니다. 화살과 수평 섹션 바인딩 훌륭한 개요를 제공 하는 한 섹션 내에서 설치류 두뇌의 대부분에 걸쳐 시각화의 이점이 있다. 그림 4는 포유류 두뇌에서 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 진화 보존을 보여 줍니다. [3시간] HOCPCA 바인딩 사이트 마우스, 쥐도 돼지 뇌 조직 활성화 종 사이 총 뇌 해부학의 비교에서에 발견 되었다. 일반적으로, 진화 보존 및 지역 분포 연구 수 있습니다 크게이 경우에 관심사의 단백질의 특성에 소설 대상 고 도움이 따라서19의 생리 기능 대 한 표시를 줄 수 있습니다.

높은 선호도 GHB 바인딩 사이트는 GHB radioligands 바인딩 사이트 하지만 유사한 특정 활동 (그림 5)에 대 한 다른 선호도 표시와 함께 조사 했다. [3시간] HOCPCA 74의 Kd 를 줬던 이전 nM, 뛰어난 상용 radioligand [3H] NCS-382 Kd 697의 nM, 모두 양적 autoradiography9pH 6.0에서 결정. 따라서, [3H] HOCPCA 부여 훨씬 높은 감도, 뛰어난 신호 대 잡음 비율에 지도. [3H] NCS-382, 높은 radioligand의 낮은 감도 때문에 농도 바인딩의 얻기 위해 사용 해야 합니다 ( 그림 5에 y 축의 비교). [3H]에 비교 될 때 GHB, 높은 radioligand 농도 조차 (30 nM) 비교 바인딩 레벨을 달성 하는 데 필요한. 이것은 주로이 radioligand20의 상당히 낮은 선호도 (K나 4.5 μ M의). 그러나, 높은 radioligand 농도 또한 일반적인 바인딩9,10 결과적으로 낮은 신호 대 잡음 비율의 수준을 증가합니다. 이 일련의 실험 생산 하는 높은-품질의 이미지에 대 한 높은 선호도 radioligand의 중요성을 강조 한다.

있기 때문에 높은 선호도 GHB 사이트 개 지역 (60 pmol/mg17)에서 너무 높은 수준으로 표현 됩니다, 포화 곡선에 의해 약리 매개 변수 결정이 어렵습니다 본질적으로 표준 트리 티 움 민감한 형광 이미징 사용 하 여 위험이 있으므로 포화 이미지의 접시. 따라서, Kd 에 대 한 값 [3H] HOCPCA [3H] NCS 382 동종 변위 곡선, 그리고 Kd (그림 6)9의 계산으로 첫 결정 K나 값에 의해 얻은 되었습니다. 대부분 radioligands에 대 한 대안 동위 원소 희석 homogenate 바인딩 분석 실험에 정기적으로 이루어집니다를 사용 하는 것입니다. 또한, Kd 값 다른 pH 값에 결정 되었습니다. 결국, 높은 선호도 GHB 사이트 pH 6.0 (그림 6A 와 그림 6D)에서 가장 효율적으로 표시는, 실질적으로 pH 7.4에 조건 시험의 변경 이후 ligand 선호도 영향. 따라서, Kd [3H] pH 7.4에서 HOCPCA는 약 30 배 이상의 숫자로 pH 6.0에서. 일반적인 바인딩 [3H]를 사용할 때 주의 해야 되는 더 높은 정도의 결과 더 pH 증가 NCS-382 어디 낮은 양의 특정 바인딩 pH 7.4 (그림 6E)에서 구할 수 있습니다. 이 사실의 생리 적 pH9, 다시 가능한 높은 선호도로 radioligand 하는 데에 힘을 보여주는이 radioligand를 사용 하 여 약리 매개 변수 결정을 방해가 됩니다.

Figure 1
그림 1: 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 타겟팅 radioligands의 구조. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ene carboxylic 산 ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS)-6,7,8,9-테-5-hydroxy-5H-benzocyclohept-6-ylidene 초 산 (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 [3H] γ-hydroxybutyric 산 ([3H] GHB)16 대 등 특정 활동 (20-40 원/mmol), 뿐만 아니라 [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ tritiated radioligands로 125나] BnOPh GHB)13 2000의 추정된 어 금 니 활동 Ci/mmol21. GHB 구조 요소는 빨간색으로 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 체 외에서 autoradiography 프로토콜의 도식 개요. (1) 동물 안락사, 해 부 및 스냅-드라이 아이스에 냉동 조직 이다. 조직은 다음 현미경 슬라이드에 녹여 장착 한 cryostat에 구분 하 고 (2) 섹션은 알을 품을 radioligand와 평형 바인딩까지. 일반적인 바인딩의 결정에 대 한 솔루션 관련 하지만 동일 하지는 않습니다 화학 구조의 unlabelled 제거 하는으로 보충 된다. (3) 그 후, 언바운드 radioligand 분석 결과 버퍼에 세척 하 여 제거 하 고 소금 소 주 H2o.로 헹 궈 서 제거 섹션은 건조, paraformaldehyde (PFA) 고정 ligand 단백질 상호 작용을 설정할 영구적으로 수행 됩니다. 섹션은 다음 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 됩니다. (4) 충분 한 노출 시간 후, 접시 디지털 autoradiograms를 검색 합니다. (5) 궁극적으로, 이미지 분석 관심사 (ROIs)의 영역의 정의 사용 하 여 수행 되 고 바인딩이 계량. 표시 된 예제에서는 광학 밀도 (ODs) 마우스 피 질 (왼쪽)과 마 (가운데)의 섹션에 설명 됩니다. 정량화 섹션 [3H] 미 (오른쪽)와 함께 노출 하 여 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 1 nM [3H] HOCPCA 바인딩 마우스의 대표 autoradiograms 뇌 섹션. (A) Radioligand 해 부 구조의 가시성에 비행기는 구분의 중요성을 설명 하기 위해 화살 및 수평 조직 섹션 혀끝에 바인딩. (B) 해 부 지역, 특히 radioligand 바인딩 결 석/낮은 영역을 확인 하려면 해당 조직 단면도의 얼룩 바이올렛 Cresyl. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 1 nM [3H] HOCPCA에서에서의 바인딩 종 대표 autoradiograms. 쥐 (A), (B) 마우스 및 (C)의 비교 총 뇌 해부학 함께 대뇌 피 질의 hippocampal 지역 사이트 바인딩 진화 보존을 설명 하기 위하여 생체 외에서 autoradiograms 돼지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 마우스 피 질과 해 마에서 GHB radioligands 뇌에서 생체 외에서 autoradiography 하 여 서로 다른 감도와 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트에 바인딩의 정량화 조각. 총 바인딩 fmol/mg 조직 등가물 (TE) (A) [3H] radioligands로 보고 HOCPCA (1 nM) 및 (B) [3H] NCS-382 (7 nM) 및 (C) [3H] GHB (30 nM) (유사한 특정 활동). 비 특정 바인딩 1mm GHB 또는 1 mM radioligands (표시 되지 않음)에 대 한 HOCPCA 존재 하지 감지 되었습니다. 데이터는 각 3 기술 복제에서 수행 하는 4 생물 복제의 ± SD 의미 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: Kd 와 B [3H]의 동종 경쟁 변위에 의해최대 값의 autoradiographic 결정의 대표적인 결과 HOCPCA [3H] pH 6.0에 pH 7.4에서 마우스 대뇌 피 질의 단원의 NCS-382 radioligands의 선호도에 pH의 영향을 보여 줍니다. (Kd 와 B최대 radioligand와 경쟁자로 동일한 화합물을 사용 하 여 계산 했다, K의 초기 결정을 통해내가 22값). PH 6.0에 1 nM [3H] HOCPCA 바인딩을 위해 최적의 신호 대 잡음 비율 (A) Autoradiograms. (B) 높은 [3H] HOCPCA 농도 필요한 버퍼 pH 7.4에 변경 (8 nM) 중요 한 바인딩 수준에 도달. (C) 결과 로그 농도 바인딩 곡선; 의미 ± SEM. (D) 5 pH 6.0에서 nM [3H] NCS 382 바인딩 결과 낮은 비 특정 바인딩, 반면 (E) 40 nM [3H] NCS 382 pH 7.4에 바인딩을 얻을에 충분 하지 않습니다. (F) 결과 로그 농도 바인딩 곡선; ± 3-4 생물 복제 각 3-5만 2 생물 복제와 기술 복제, pH 7.4에만 [3H] NCS 382 실험 수행 수행에서 얻은 SEM. 데이터를 의미 합니다. 대 한 두 radioligands 1mm GHB 비 특정 바인딩의 결심을 위해 사용 되었다. 대 한 자세한 내용은 분석 및 Kd 와 B최대의 계산,9을 참조 하십시오. 이 그림 적응 되어 있으며 이전 게시9 에서 증 쇄 하는 허가 Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Autoradiographic 분석 결과의 품질은 가장 자주는 radioligand의 감도 의해 결정 됩니다. 주요 기여 하는 요소는 적절 한 특정 활동 (즉, 방사능의 양을 ligands를 알려진된 ligands의 가용성에 의해 또는 특정 라벨 기술의 타당성에 의해 주어진 선택 된 방사성 동위 원소 단위는 radioligand의 두더지) 당23와 화학 저하의 제한 금액. 알려진된 ligands의 radioligands의 많은 수는 움9,10,,2425,26, 유추 하는 몇 가지 장점이 있는 이라는. 첫째, 트리 티 움 (3H) 개별 일괄 처리의 장기 저장을 추진 하는 긴 반감기 (12.43 년) 특징 이다. 둘째,는 방사성 핵 종에 의해 리간드-대상 상호 작용 왜곡 하지 3H ligands 생물학 그들의 부모 화합물 구별 하지 않습니다. 트리 티 움에서 낮은 에너지 β--입자, 높은 공간 해상도 결과로 조직에만 짧은 거리를 여행 하 고, 그 후, 큰 구별 해 부 구조4. 그럼에도 불구 하 고, 트리 티 움 라벨만 적당히 높은 특정 활동을 생산 수 있습니다. 이 사실은 수 3H 소스 방사성 비 수소 오염입니다. 일반적으로, 높은 특정 활동, 적은 radioligand 민감한 감지23를 얻이 필요 합니다. 또한, 그것은 고려해 야 합니다 그 3H ligands 3H 라벨의 안정성에 따라 물으로 수소 교환 받을 가능성이 있다. 낮은 식 또는 너무 낮은 특정 활동에 대 한 보상, 요오드-125 방사성 핵 종13으로 사용할 수 있습니다. 요오드-125의 최대한 구체적인 활동은 삼중 수소의 그것 보다 더 높은 약 100 이다. 그러나, 몇 가지 추가 고려 사항 요오드 125와 함께 작업할 때 만들 수 있다. 예를 들어, 요오드-125의 추가 일반적으로 분자 ligand 대상 상호 작용에 영향을 줄 수 있는 구조 변경 유도 합니다. 요오드-125는 60 일의 반감기, 매일 부패에 대 한 보정 특정 활동 및 리간드-대상 상호 작용23의 정량화에 대 한 고려 되어야 한다. 125 Ligands γ-광자를 방출 하 고 훨씬 더 높은 감도도 불구 하 고 낮은 해상도 이미지를 생산. 이것은 해상도 동위 원소 (아래에 설명)으로의 최대 에너지 사이의 역 관계 때문입니다. 마지막으로, 삼중 수소에 비해 증가 한다 주의 요오드-125는 방사성 핵 종의 높은 에너지 때문에 처리 합니다.

핵 종에 따라 해상도 영향을 미칠 수 있는 조직 섹션 두께. 저 에너지 β--방사선 트리 티 움의 자기로 인해 약 5 µ m의 조직 범위 제한. 결과적으로, 조직 두께 의해 정량화 좌우 하지 섹션 두께 5 µ m27,28을 초과 하는 경우. 대조적으로, 높은 에너지 동위 원소의 방사성 붕괴 큰 조직 침투를, 검색 매체에 큰 거리를 가진 ligands는 또한 이미지 형성에 기여 하기 때문에 낮은 이미지 해상도에 결과 있다. 따라서, 얇은 섹션 에너지 방사성1에 대 한 더 높은 해상도 홍보.

Autoradiographic 프로토콜의 설립 최적의 바인딩 조건 (예를 들어, 버퍼, pH 및 온도)의 지식과 선호도 및 속도 론 radioligand의 약리 매개 변수가 필요합니다. 경우는 radioligand 하지 전에, 탐색적 연구는 필요한29특징 되었습니다. 최적의 radioligand 농도 선택은 안내는 radioligand의 선호도 및 바인딩 사이트의 풍부에 의해 둘 다. 일반적으로, 반영 하는 5-6 회 Kd 농도 모든 바인딩 사이트 포화30있는지 확인 하는 데 사용 됩니다. 또 다른 방법은 전체-에-일반적인 Kd31 아래 radioligand 농도 선택 하 고 동시에 radioligand 솔루션을 저장 하 여 바인딩의 가장 높은 비율을 산출 하는 것을 목표로. 이 방식은 특히 유용 때 바인딩 사이트 시험된 조직에 매우 풍부한 높은 radioligand 농도 autoradiograms, 케이스 [3H] HOCPCA 및 높은 선호도 GHB로 밀어붙이는의 기회를 증가 것 때문 바인딩 사이트9. 또한, 효율적으로 레이블이 대상된 단백질의 전체 인구, 순서는 radioligand 한다 이상적으로 바인딩할 모든 가능한 대상 conformations. 특히 수용 체의 autoradiography에에서 촉진제를 사용 하 여 수만 공개 총 수용 체의 부분 수 이후 일부 낮은 선호도 주 작동 근 상태에 있을 수 있습니다. 대조적으로, 중립 길 항 제는 가장 자주 모든 수용 체 상태26,29에 대 한 선호도 표시합니다.

또한, 바인딩 실험 평형 바인딩 조건 하에서 일반적으로 수행 됩니다. 따라서, 원하는 실험 조건 (고정된 radioligand 농도, 버퍼 및 온도)에서 평형 바인딩 도달 하는 데 필요한 시간 결정 되어야 한다 협회 실험에서 평형 바인딩의 범위 내에서 보장 하는 4,,2330실험. Radioligand 부 화 후 언바운드 radioligand 분석 결과 버퍼와 여러 외피에 의해 씻어 이며 일반적으로 증 류 된 H2o. 신호-노이즈 비율에 따라 시간과 온도 조정 하 여 최적화할 수 있습니다 rinsing 하 여 다음에 radioligand26,,3031의 분리 비율.

Radioligands 비 생물 자료, 즉, 바인딩 표시 될 수 있습니다 일반적인 바인딩. 의도 된 대상 이외의 세포 구성 요소에 대 한 Radioligand 바인딩은 난다 바인딩 정의 됩니다. 난다 바인딩 radioligand 바인딩의 총 금액의 기여는 radioligand와 동일한 바인딩 사이트를 대상으로 경쟁 unlabelled ligand의 평가. 비 방사성 화합물 (제거 하는) 10,000-fold 초과에서 제공 바인딩 사이트 차지 하 고는 radioligand에서 대상 사이트26,,3132에 바인딩할 수 있습니다. 결정적으로, unlabelled 화합물이 모두 특정 뿐만 아니라 일반적인 바인딩23displacing의 위험을 낮춘 다 이후는 radioligand 보다는 다른 화학 구조 이어야 합니다. 비 특정 바인딩 막 바인딩에서 발생 하는 상당히 닥터지 radioligands의 경우 특히 주요 문제일 수 있다. 경우에 따라 광범위 한 세척 절차 비 수용 체 바인딩된 radioligand를 제거 하 고 따라서 특정 비율29바인딩 개선 수 있습니다.

분석 결과 버퍼를 선택할 때 그것은 ligand 대상 상호 작용에 이온 강도, pH의 영향을 고려해 야 할 중요 한. 특히 정전기 상호 작용 폴라 ligands와 바인딩 사이트의 친수성 구성 요소 간의 버퍼의 이온 강도 의해 영향을 받습니다. 따라서, 여러차례 또는 divalent 이온을 가진 supplementation는 효과적인 선호도 상수23,33떨어질 수 있습니다. 공부 ligand-대상 상호 작용에 대 한 최적의 버퍼 구성 알 수 없는 경우 다른 일반적인 버퍼 파일럿 실험에서 탐구 한다. 버퍼도 타락 하는 효소29,34의 억제제 의약품 등 안티 oxidants와 보충 수 있습니다. 또한, 특정 그룹 또는 자체 ligand 바인딩 사이트 내에서 이온화 pH에 의해 영향을 하 고 평형 바인딩 상수, 운동 속도 상수 및 일반적인 바인딩23,33에 중요 한 영향. 예를 들어 높은 선호도 GHB를 프로 빙이 바인딩 대상 (그림 6)에 pH의 중요성을 설명 친절 하 게 다른 GHB radioligands 사이트를 바인딩 합니다. Ligand 수용 체 상호 작용에 대 한 최적의 pH를 특성화 또한 그것의 생물학 관련성 관계 대상의 중요성에 대 한 단서를 줄 수 있습니다.

또 다른 중요 한 요인은 디지털 autoradiography 노출 시간, 즉, 인광 체 격판덮개를 이미징 하 radiolabelled 조직 단면도 노출 하 여 정량 autoradiograms를 달성 하는 데 필요한 시간입니다. 견적 샘플, 에너지와 반감기는 동위 원소 뿐만 아니라 원하는 신호 대 잡음 비율의 방사능의 양을 기반으로 합니다. 특히, 노출 시간 결과 포화 이미지와 높은 배경 신호를 연장 한다. 우주 방사선1,4를 피하기 위해 납 차폐 환경에서 카세트를 저장 하 여 상승 된 배경 신호를 줄일 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 차선 autoradiograms를 달성 하는 경우 표본 수 노출 될 여러 번, 리간드-대상 복잡 한 고정 하 고 그것을 허용 하는 방사성 핵 종 반감기.

인광 체 격판덮개를 이미징 다시 사용할 수 있고 긴 수명 즉올바르게 처리, 벤딩 피해 야 한다 고 접시 건조 한 환경에서 저장 되어야 한다. 인광 체 격판덮개를 이미징 처리는 빛과 우주 방사선에 그들의 감도 의해 유도 됩니다. 따라서, 배경 신호를 최소화 하기 위해 모든 사용 전에 접시를 삭제 하는 것이 중요 하다. 영상 판 radiolabelled 조직 단면도의 노출 방사선 차폐 카세트 완전히 빛이 없는 상태에서 이루어집니다. 노출 시간 끝에 스캐너에 접시를 전송할 때 어떤 주변광도 짧은 접촉 하얀 빛을 줄여 축적 된 신호로 또한 피해 야 한다. 번호판을 피하기 위해 신호 페이딩 표본 제거 후 즉시 스캔 해야 하는 또한, 번호판을 이미징 하는 형광체를 사용 하 여 단점은 격판덮개1의 반복된 사용 후 인공 물 및 잔류 '고스트 이미지'의 잠재적인 외관 이다.

트리 티 움 사용 없이 낮은 에너지 방사선 인 결정에 도달 수 있도록 보호 코팅 플레이트 이미징 필요 합니다. 트리 티 움-민감한 형광 이미징 접시는 따라서 더 오염 또는 잘못 된 처리 때문에 손상에 민감합니다. 일단 오염 된, 트리 티 움-민감한 접시 청소 될 수 없습니다 고 대체 될 필요가 있다. PFA 수증기와 리간드-대상 단지의 고정 플레이트, 수명이 길어의 잠재적인 오염을 감소 시킨다. 또한, 고정 후 조직의 탈수 때문에 트리 티 움 민감한 격판덮개는 습기에 민감한 중요 한 단계입니다. 그것의 섬세 한 성격 때문에 다른 동위 원소1,4하지 트리 티 움-민감한 접시를 사용 해야 합니다. 대조적으로, 요오드 125와 같은 높은 에너지 동위 원소에 대 한 접시는 더 강력 하 고 그들의 표면도 70% 에탄올으로 닦아 의해 청소 될 수 있다.

전통적으로, radiosensitive 영화는 방사능 감쇄의 공간 녹화를 위해 사용 되었습니다. 높은 해상도 이미지를 얻을 수 있다, 하는 동안 영화 autoradiography는 몇 가지 제한이 있습니다. 개발에 대 한 유해 화학 물질 및 암실의 필요성, 게다가 x 선 필름 좁은 다이나믹 레인지를 특징 이다. 따라서, 그것은 다른 노출 시간 반복 radiolabelled 섹션 같지는 비 포화 이미지35를 달성 하기 위해 노출 하는 데 필요한 수 있습니다. 또한, x 선 필름 견본 낮은 에너지 동위 원소, 즉와 분류에 대 한 지속적인된 노출 시간에서 발생 하는 제한 된 감도 전시 한다. 트리 티 움 감퇴 노출의 몇 개월을 요구할 수 있습니다. 낮은 감도 작은 선형 범위와 함께 최적의 분석 조건이 결정된 첫1,35해야 하는 경우에 특히 기법을 매우 시간이 소모, 하 게.

번호판을 이미징 하는 형광체의 개발, 이러한 제한 중 일부 지정된35,,3637되었습니다. 이미징 접시 일시적으로 조직 표본에서 radioligand의 공간 배치를 대표 하는 방사성 붕괴의 이미지 저장을 제공 합니다. Photostimulable BaFBr:Eu2+ 형광체 결정 Eu2의 여기에서 높은 에너지 방사선 (예를 들면, 엑스레이, 감마선 또는 베타 입자) 결과, 샘플에서 방출 되는 방사성 에너지를 캡처하는 데 사용 됩니다 + 유럽 연합3+ 와 인광 체에서 나온된 전자의 필연적인 트래핑 격자4,37. 반응 반전 표시 또는 적외선 빛을 이미징 플레이트 노출, 즉, 덫을 놓은 전자 출시을 Eu3+ Eu2+ 로 변환 하는 동안 발광 이다. 내보낸된 빛이 방사능의 양을에 비례 하 고는 광 전 증폭 관에 의해 그것의 탐지는 디지털 autoradiogram37의 만들 수 있습니다. 두이 일3달에서 노출 시간에 현저한 감소를 동반 하는 감도 있는 증가 제공 합니다. 그 꼭대기에, 선형 동적 범위는 상당히 증가, 포화 이미지의 기회를 감소 시키는. 선형성은 4 ~ 5 배나 내 고 반복 검증 되었습니다3,35,36,,3738. 영화 autoradiography 여전히 우수한 공간 해상도 제공 하며, 검색 기술에 노력 해 부 지역3사이 상세한 차별화 수 있도록 25 µ m (픽셀 크기), 300에서 해상도의 향상에 결과. 전반적으로, 형광체 이미징 접시는 디지털 autoradiograms 모두는 증가 선형 범위와 감도의 취득을 촉진 하 고 있다. 감소 된 노출 시간 및 높은 처리량을 허용 하는 데이터 분석에 대 한 감소에 크게 리드 간단한 개발 기술.

Autoradiography에 비해, 선호도 및 밀도 등 유용 약리 매개 변수는 또한 일반적으로 특징 radioligands 조직 homogenate 바인딩 분석에에서의 응용 프로그램. 이 메서드는 효율적인 방식으로2액체 섬광 검출기 β 방출 방사성 감쇠를 측정 하 여 결과 생성의 이점이 있다. 다 잘 접근을, 예를 들어, 96-잘 결정 접시에서 수행 되 고 이러한 분석은 화합물의 라이브러리의 고 농도 의존 관계의 많은 수에 대 한 유용 합니다. 그 위에,이 채도 분석은 종종 더 높은 radioligand 농도와 포화 이미지의 위험 표시 autoradiography에 가능한 비해. 그러나, 동종 변위 비 방사성 ligands와 고정된 낮은 radioligand 농도의 Kd 와 B최대 를 얻기 위하여 수행 포화 이미지 (그림 6)22문제 circumvents. Homogenate 바인딩 및 autoradiography 관심사의 단백질의 조직 밀도 homogenate 바인딩에 과소 평가 될 수 있습니다 반면 ligand 선호도 상수에 대 한 비슷한 견적을 생성 합니다. 따라서, 그것은 제안 되었습니다 조직 이동할을 수 반하는 세포 막 중단 수용 체 손실 될 수 있습니다 또는 조건3,33바인딩 변경. 또한, 오류 조직 해 부에 인접 한 뇌 영역에서 조직으로 오염 하는 homogenates를 생성할 수 있습니다. 비교에서는, 작은 핵에도 복잡 한 바인딩 패턴은 시각 및 구별할 autoradiography3,33해부학 해상도 때문.

Immunohistochemistry 또한 해부학 관심사의 단백질의 분포를 시각화. 방법은 해부학 고해상도 이미지를 생성 가능로 세포 수준 및 심지어 subcellular 수준의 전자 현미경을 사용 하 여 개별 조직 구성 요소를 확인할 수 있습니다. 식 수준에서 얼룩의 강도에 따라 평가 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 절대 부 량 식 레벨의 적절 한 참조 표준39의 부족으로 인해 어렵습니다. 또한, immunohistochemistry 선택적, 잘 검증 된 항 체 수용 체 연구에 문제가 자주는의 가용성에 따라 달라 집니다.

Autoradiography 시험관에서 수행에 결정 하기 전에 몇 가지 고려 사항 만들어질 필요가 있다. 우선, 사후 조직 준비 반복 중지 및 재개 뿐만 아니라 단면을 포함 하 여 바인딩 사이트2의 보존 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 메서드는 질문2에 높은 선호도 대상에 대 한 선택도 표시 하는 적절 한 radioligand의 가용성에 따라 달라 집니다. radioligand 대상 오프 사이트에 중요 한 바인딩 표시 되지 않아야 하 고 그것은 또한 유리한 운동 프로필을 입증 해야한다. 이 ligand-대상 복잡 한 실험의 범위 중 그대로 유지 해야 하기 때문에. 또한, 적당 한 비 방사성 화합물이 존재 하는 경우는 방사성 핵 종 도입 중요 한 요인이 될 수도 있습니다. 따라서, 관심의 분자 갖추어야 효율적인 radiolabelling에 대 한 적당 한 기능 그룹으로 충분히 높은 특정 활동 및 화학 안정성40radioligands의 생산을 가능 하 게 합니다. 또 다른 autoradiography 생체 외에서 의 단점은 그 방법만 사용할 수 있습니다 동물의 한번. 더 우아하게 vivo에서 이미징 위치 방출 단층 촬영 (PET), 같은 동물 인 및 동적 바인딩 특성의 반복 스캔 수 있는 같은 확장 이다. 애완 동물은 높은 포유류41 의 연구 및 전 임상 연구 42,,4344복용량 최적화를 위해 특히 중요 합니다.

Autoradiographic 기술의 몇 가지 수정을 약리 대상 약물 발견 및 개발 뿐만 아니라 건강 하 고 병에 걸린 상태에서의 특성 측면 모두에서 응용 프로그램을 확장합니다. 우선, 이미징 기술에서의 최근 발전은 실시간 autoradiography의 개발에 이르렀다. Α/β-입자의 가스 탐지기 그로 인하여 생산 빠른 디지털 autoradiograms45번의 직접 측정 하 여 영상 또는 필름에 대 한 필요성을 제거.

또한, 생체 외에서 autoradiography G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 사후 조직에 그들의 해부학 적 분포에 대 한 내용은 위에 기능 연구를 수 있습니다. 방법의이 변종 guanosine 3 인산 염 (GTP), 즉, [35S] guanosine 5'-γ-thiotriphosphate의 방사성 이라는 아날로그와 조직 단면도의 부 화 포함 됩니다 ([35S] GTPγS)와 함께 한 GPCR의 길 하 항 비 방사능 제 때에 주 작동 근 바인딩하고 GPCR, [35S]의 설립의 응답을 elicits GTPγS 지역화 되 고 반영만 활성화 된 수용 체 인구2,46,47 autoradiography 통해 정량 될 수 .

Ex vivo autoradiography 라이브 실험 동물에 관리 후는 radioligand의 지역 바인딩을 평가 기법의 또 다른 버전을 나타냅니다. 동물의 희생, cryosectioning 조직, 및 autoradiograms에서 autoradiographic 노출 결과의 다음을 vivo에서2바인딩 radioligand를 반영 합니다. Ex vivo autoradiography 일반적으로 그것의 흡수, 분포, 대사 및 배설 (ADME)는 리드 화합물, 즉, 의 pharmacokinetic 프로필에 대 한 정보를 얻기 위하여 약물 발견과 개발 프로그램 내에서 고용 . 특히 전신 autoradiography 모든 장기와 조직에 약물 분포에 대 한 통찰력을 제공합니다. 그러나, 일반적인 바인딩 및 정량화 가능한 물질 대사와는 radioligand의 생체 외에서 autoradiography에 비해 더 어렵습니다 그리고 멀리 세척을 위한 아무 방법도 언바운드 ligand48.

예비 테스트 및 애완 동물 ligands4의 autoradiography 또한 사용 됩니다. 고 에너지 방사성 탄소-11 및 불 소 18 애완 동물 ligands 가장 자주 사용 됩니다. 애완 동물 때문에 살아있는 동물에 바인딩 radioligand의 정량 3D 이미지11,,4049얻어질 수 있다 radioligands는 저명한, 비-침략 적 응용 프로그램입니다.

생체 외에서 autoradiography 번호판을 이미징 하는 형광체를 사용 하 여 대상 ligand 상호 작용의 약리 특성에 대 한 가치 있는 분석 결과 메서드를 나타냅니다. 방법은 최적의 분석 조건 설정 된 후 비교적 신속 하 고 간단한 프로토콜의 고용에 의해 재현성 결과 생성 합니다. 관심사의 단백질의 해부학 적 분포 실험 동물의 건강 하 고 질병 사후 조직에서의 생리, 약리, 병 적인 역할의 연구를 허용 하는 네이티브 microenvironment 내에서 결정 됩니다 뿐만 아니라 인간2,47

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Disclosures

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

Acknowledgments

작품은 Lundbeck 재단 (그랜트 R133-A12270), Novo Nordisk 기초 (그랜트 NNF0C0028664)에 의해 지원 되었다. 저자 [3H] radioligand의 공급에 대 한 박사 Aleš 마렉을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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신경 과학 문제 145 Radioligand 방사성 autoradiography 선호도 표현 형광 이미징 HOCPCA γ-hydroxybutyric acid GHB NCS-382 양적 약리학
시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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