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Neuroscience

Autorradiografía como un método sencillo y potente para la visualización y caracterización de dianas farmacológicas

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

El método de autorradiografía se utiliza habitualmente para estudiar atascamiento de radioligands para las secciones de tejido para la determinación de la farmacología cuantitativa o cualitativa.

Abstract

Autorradiografía in vitro tiene como objetivo visualizar la distribución anatómica de una proteína de interés en tejidos de animales experimentales como en seres humanos. El método se basa en la unión específica de un radioligando a su destino biológico. Por lo tanto, las secciones de tejido congelado se incuban con la solución así, y el atascamiento al objetivo posteriormente se localiza por la detección de radiactividad, por ejemplo, mediante el uso de película fotosensible o las placas de la proyección de imagen de fósforo. Autoradiograms digitales resultantes muestran notable resolución espacial, que permite la cuantificación y localización de unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Por otra parte, la cuantificación permite la caracterización farmacológica de la afinidad del ligando por medio de constantes de disociación (Kd), constantes de inhibición (K), así como la densidad de sitios de unión (Bmax) en los tejidos seleccionados. Así, el método proporciona información sobre la localización del objetivo y la selectividad del ligando. Aquí se ejemplifica la técnica autorradiográfica caracterización del ácido alta afinidad γ-hidroxibutírico (GHB) sitios en tejido fino del cerebro mamífero, con especial énfasis en consideraciones metodológicas sobre el análisis de enlace de Unión parámetros, la elección de la radioligand y el método de detección.

Introduction

Autorradiografía es un método que proporciona imágenes de decaimiento radiactivo. La técnica se utiliza habitualmente para el estudio de la distribución en los tejidos de una proteína de interés en vitro basada en una interacción farmacológica específica entre un compuesto radiomarcado y su objetivo. Esto proporciona información directa acerca de la selectividad del ligando el destino. Autorradiografía in vitro también se puede utilizar para la determinación cuantitativa de parámetros de enlace farmacológico de radioligands, tales como la constante de disociación (Kd) y la densidad de sitios de unión (Bmax), así como para determinar la constante de inhibición (Ki) de competencia ligandos1,2. Comparado con el tradicional homogeneizado así vinculante, autorradiografía tiene la ventaja de ser capaces de visualizar la anatomía espacial y sucintos datos de patrones de expresión regional3. El método de autorradiografía es por lo tanto una alternativa relevante para inmunocitoquímica, especialmente en la ausencia de un anticuerpo validado. Autorradiografía se implementa fácilmente en un laboratorio de radioisótopos estándar dado la disponibilidad de un radioligando apropiado con la especificidad farmacológica necesaria, acceso a un criostato para Microtomo para preparación de tejido y una adecuada proyección de imagen dispositivo que es capaz de analizar la distribución de la radioactividad en las secciones de tejido respectivo. En particular, un criterio de selección importante para el así es una cantidad limitada de enlace a sitios de destino no. Esto puede ser a otras proteínas, las membranas o materiales como plástico o filtros y colectivamente se conoce como fijación no específica. Generalmente, fijación no específica es no saturable, pero puede ser saturable si se trata de una proteína específica del objetivo. La mejor manera de validar la verdadera unión específica es comparar a tejidos que carecen el objetivo, por ejemplo, genéticamente diseñados (knock-out) tejido4.

Aquí, la metodología se ilustra con la caracterización autorradiográfica del sitio de unión de alta afinidad para el ácido γ-hidroxibutírico (GHB) en el cerebro mamífero. Comprensión de la interacción farmacológica entre el GHB y su sitio de Unión es de relevancia como el GHB es una droga tanto clínicamente útil en el tratamiento de la narcolepsia y alcoholismo5, pero también un componente natural del cerebro mamífero y un recreo drogas6. Sitios de unión de alta afinidad GHB primero fueron descritos usando Unión de GHB de [3H] a de homogeneizado de cerebro de rata7. Con los años, nuevos estudios de autorradiografía con [3H] GHB y el análogo [3H] NCS-382 ha demostrado una alta densidad de sitios en regiones del cerebro anterior de rata8,9,10, ratón9 de Unión ,11y mono humano cerebro12del cerdo. Sin embargo, la identidad molecular y relevancia funcional exacta de estos sitios de Unión se han mantenido esquivos.

Con la intención de caracterizar los sitios de Unión y facilitar los estudios sobre el papel fisiológico de GHB, se han desarrollado múltiples radioligands incorporando diferentes isótopos con afinidades diferentes ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA y [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revisado en17) (figura 1). La combinación de radioligands selectivo de alta afinidad y una densidad muy alta del tejido del enlace sitios han permitido la producción de imágenes de alta calidad usando el fósforo imagen técnica9,11. Junto con un resumen de los puntos prácticos en establecer un experimento autorradiográfica y una ilustración para ejemplificar detalles, hará hincapié en la sección discusión i) la elección de los radionucleidos, ii) la elección de las condiciones analíticas y iii) el uso de fósforo placas de imagen frente a la película de radiografía. El objetivo general de este trabajo es aportar detalles técnicos, metodológicos y científicos en la técnica de autorradiografía para informar sobre la distribución del tejido y análisis farmacológico de dianas de la proteína.

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Protocol

Manejo de los animales fue realizado cumpliendo con las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés.

Nota: El protocolo descrito aquí cubre preparación de tejido (es decir, tejido de cerebro de ratón), el ensayo autorradiográfica en vitro en suficiente detalle para configurar el método en un nuevo laboratorio, la exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo así como posterior análisis densitométrico de autoradiograms (figura 2) con el objetivo de localizar y cuantificar la Unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Comparación histológica, se incluye un protocolo para la tinción violeta de cresilo. Por otra parte, la determinación de la fijación no específica con un ligando que compiten está incluida en el protocolo. Para una descripción detallada sobre cómo determinar Kd, Bmáximo o K, ver publicación anterior4.

1. tejido preparación por Cryosectioning

  1. Eutanasia el ratón por dislocación cervical y diseccionar inmediatamente hacia fuera el cerebro usando tijeras y pinzas. Proceder directamente al paso siguiente para evitar daño a los tejidos.
  2. Rápido-congele el tejido por inmersión en hielo seco en polvo, gases CO2 o isopentano. Transferir directamente el tejido congelado a un criostato con la temperatura a-20 ° C. Alternativamente, guarde el tejido a-80 ° C hasta el procesamiento.
    Nota: Evite congelación descongelación repetida para reducir el daño tisular.
  3. Que el tejido aclimatar a-20 ° C en el criostato para 20 minutos antes de proseguir para evitar el destruyendo tejido.
  4. Cubrir el soporte de tejido con incrustación medio fuera el criostato y rápidamente Coloque al espécimen de tejido congelado en la orientación deseada, mientras que el medio de inclusión es líquido inmóvil. Por ejemplo, coloque el cerebro de ratón verticalmente sobre el cerebelo para lograr secciones coronales rostrales. Transferir el portapapel higiénico a criostato y exponer el medio de inclusión a temperaturas abajo de-10 ° C para endurecer.
    Nota: Muestra de tejido frágil debe ser cubierto en la encajadura medio dentro de los moldes de tejido antes del montaje.
  5. Posición el portapapel higiénico en el microtomo de criostato. Ajustar la orientación del tejido para evitar secciones inclinadas.
  6. Cortar el tejido con la dirección de un atlas estereotáxicas18 en secciones de espesor deseado (μm 12 recomendado para [3H] con ligandos). Cuidadosamente enderezar y desplegar la sección con un cepillo de tamaño pequeño si es necesario y deshielo-Monte la sección sobre un portaobjetos de microscopio. Recoger secuencialmente las secciones de la región de interés para la replicación técnica deseada (por ejemplo, 4 secciones por diapositiva).
  7. Permiten que las secciones de los portaobjetos se seque al aire durante 1 hora antes de manipular otros.
    Nota: Además de material desecante para deslizamiento de cajas reduce al mínimo la acumulación de humedad en las secciones de tejido. Procotol puede hacer una pausa aquí por almacenar secciones a largo plazo en las cajas de diapositivas a-80 ° C.

2. autorradiografía in vitro

PRECAUCIÓN: radiactividad. Trabajo en un laboratorio certificado según las normas locales. Usar ropa protectora. Deséchelo conforme a decaimiento radiactivo o subcontratar a una empresa certificada.

  1. Descongele las secciones por lo menos 30 min a temperatura ambiente (RT). Etiquete los portaobjetos con las condiciones experimentales. Utilice un lápiz porque las diapositivas serán bañadas en etanol durante la coloración posterior.
  2. Coloque las correderas horizontalmente en bandejas de plástico.
    Nota: Diapositivas sobre una plataforma elevada en bandejas plásticas de posicionamiento facilita su manejo.
  3. Incubate previamente las secciones montadas en las diapositivas en tampon de ensayo ajustan al objetivo en cuestión (se utiliza el protocolo de GHB, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0) aplicando cuidadosamente a un volumen adecuado en la diapositiva (700 μL para roedores secciones coronales de 3-4).
    Nota: Asegúrese de que cada sección se cubre totalmente con el líquido.
    1. Cubrir las bandejas de plástico con tapa para evitar evaporación y Pre-incubar a temperatura relevante (para protocolo GHB previamente incubate por 30 min a temperatura ambiente) bajo constante suave (20 rpm) agitación en un agitador de placa.
    2. Para la determinación de la Unión no-específica, suplemento tampón de ensayo con concentración relevante de compuesto sin etiqueta (para protocolo GHB, 1 mM GHB).
      Nota: Pre incubación puede no ser necesario.
  4. Vierta el líquido de preincubación de cada diapositiva y transfiera los portaobjetos a la bandeja de plástico.
  5. Para evitar la deshidratación, inmediatamente incubar las secciones con concentración relevante de radioligando en tampon de ensayo bajo condiciones deseadas (Protocolo de GHB, 1 nM [3H] HOCPCA por 1 h a temperatura ambiente) cubriendo las secciones completamente con el radioligando solución (700 μL para roedores secciones coronales de 3-4).
    1. Incubar bajo bajo agitación suave constante (20 rpm) de bandejas de plástico con tapa cerrada.
      Nota: La concentración radioligand puede validarse contando una alícuota en un contador de centelleo líquido.
  6. Retirar la solución de incubación vertiendo el líquido y transfiera los portaobjetos a un rack de portaobjetos de microscopio. Inmediatamente proceder con el siguiente paso para evitar la deshidratación de la sección.
  7. Lave los portaobjetos. Para el protocolo GHB, lavado con tampón de ensayo helado dos veces para 20 s y luego enjuague dos veces por inmersión de la parrilla en las bandejas lleno de agua destilada helada para eliminar las sales. Ponga las diapositivas verticalmente en racks de secado al aire durante al menos 1 h a temperatura ambiente o secar los portaobjetos durante 5 minutos con un soplador a baja temperatura.
    Nota: El lavado debe optimizarse, p. ej., lavado extenso puede ser útil para disminuir la fijación no específica.
  8. Transfiera los portaobjetos a un fijador que contiene polvo paraformaldehido (PFA) para la fijación con vapores de PFA en RT para proteger la integridad del complejo ligando-objetivo.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Fixator positionthe en campana de humo y evitar el contacto de la piel, ojo con PFA.
  9. Al día siguiente, transfiera los portaobjetos a un cuadro de desecador con gel de sílice durante 3 horas a temperatura ambiente para eliminar la humedad.

3. exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo y exploración

  1. Coloque las secciones en un cassette de placa de blindaje de radiación con el tejido hacia arriba. Para la cuantificación posterior de unión de radioligando, incluyen una microescala de [3H] en cada cassette. Organizar las secciones al azar y exponer las secciones de comparación directa en el mismo cartucho.
  2. Borrar el fósforo de tritio-sensible a la placa inmediatamente antes de su uso para la proyección de imagen para quitar señales acumuladas desde almacenamiento de información y eliminar señales de fondo. Por lo tanto, la placa de carga en la máquina de proyección de imagen de fósforo y exponerlo a la visible/infrarrojo de luz según las instrucciones del fabricante.
  3. Retire la placa de la máquina de proyección de imagen de fósforo y colóquelo inmediatamente en las secciones en el cassette. Asegúrese de que el cartucho está completamente cerrado. Exponga las secciones a la placa de la proyección de imagen de fósforo por 3 días a temperatura ambiente protegido de la luz.
  4. Porque la luz borra la señal de la placa de imagen, cuidadosamente abrir el casete en la oscuridad e inmediatamente transferir la placa de imagen en la caja oscura de un sensor de fósforo o colocar al toner de fósforo en un cuarto oscuro.
    Nota: Asegúrese de anotar el arreglo espacial de las diapositivas durante la exposición para identificar a cada muestra en la imagen digital después de análisis. Por lo tanto, las placas de fósforo también mostrarán una de las esquinas cortada en un ángulo distinto para identificar la orientación correcta de la placa en la fotografía digital.
  5. Escanear la placa a la máxima resolución posible obtener una imagen digital.

4. opcional: Cresil violeta tinción de secciones de tejido

  1. Preparar solución de violeta de cresilo 1% mezclando 5 g de acetato violeta de cresilo en 500 mL de agua desionizada (dH2O) hasta que se disuelva (aproximadamente 2 h). Filtrar con un papel de filtro con un embudo en una nueva botella de 500 mL. Ajustar el pH a 3.5-3.8.
  2. La tinción de la diapositiva en la posición bajo campana. Preparar las bandejas con las siguientes soluciones en bandejas de polipropileno blanco (excepto xileno):
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. el 100% de etanol
    d. 100% etanol
    e. 100% dH2O
    f. violeta de cresilo 1%
    g. 0.07% de ácido acético (Añadir 175 μl de ácido acético a 250 mL de dH2O).
    h. 100% xileno en bandejas resistentes a los disolventes verdes
    i. 100% de xileno en bandejas resistentes a los disolventes verdes
  3. Transfiera los portaobjetos a la campana y colocarlos en un estante de la diapositiva.
  4. Se disuelven los lípidos a través de la creciente serie gradual de etanol en dH2O en etanol al 100% (bandeja a-d) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
  5. Rehidratar a las muestras dH2O al bajar las concentraciones de etanol (bandeja a-d en orden inverso, seguido de bandeja e) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
  6. Sumergir a los especímenes en la solución de violeta de cresilo en 10 minutos.
  7. Enjuagar a los especímenes en 0.07% de ácido acético levantando las diapositivas las diapositivas hacia arriba y hacia abajo suavemente para 4-8 s. lavado por inmersión en dH2O por 1 minuto.
  8. Deshidratar los especímenes por inmersión de los portaobjetos durante 30 s en ascendente concentraciones de etanol (bandeja a-d).
  9. Transferir a las muestras a través de dos bandejas de 100% xileno (bandeja h e i) para calmar el etanol.
  10. Rehidratar a las muestras dH2O al bajar las concentraciones de etanol (bandeja a-d en orden inverso, seguido de bandeja e) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
  11. Quite las diapositivas de solución salina con el fórceps. Añadir unas gotas de solvente orgánico montaje medios por diapositiva y agregar un cubreobjetos de 24 x 60 mm en la parte superior para proteger a los especímenes. Eliminar burbujas de aire entre la muestra y cubreobjetos presionando suavemente sobre el cubreobjetos.
    Nota: Mantenga las diapositivas restantes en xileno durante el montaje para prevenir la resequedad.
  12. Seco el portaobjetos durante la noche en una capilla del humo a TA.
  13. Obtener una imagen de muestra con un microscopio y 1.25 X objetivo.

5. densitométricos análisis de imagen Digital

  1. Medir densidades ópticas relativa (barras) de cada calibración estándar de la microescala de [3H] con un software de análisis de imagen.
    1. Seleccione un área de igual tamaño para cada punto de la microescala de [3H] usando una herramienta para la creación de la región desde el menú de determinación de la región. Asignar a un número a cada área seleccionada haciendo clic en número en el menú etiqueta.
    2. Valores de OD para cada punto de la calibración estándar de la exportación haciendo clic en archivo | E xport | Informe región 2D. Valores de barra de transferencia a una hoja de cálculo y normalizar por el tamaño del área seleccionada. Realice regresión lineal para obtener una curva estándar para su posterior análisis densitométrico.
      Nota: Asegúrese de que las áreas seleccionadas están etiquetadas para la identificación de muestras y valores de la barra.
  2. Realizar cuantificación de autoradiograms usando el propietario software de imágenes mediante la selección de la región de interés (ROI) mediante una herramienta de creación de la región en cada sección y medición de la Sao. Seleccione la misma región en cada sección mediante la creación de una plantilla para la región de interés, que se copia y se ajustan manualmente a pequeñas variaciones en la anatomía del cerebro para cada autoradiogram. Identificar la anatomía del ROI por comparación de autoradiograms con un cerebro atlas18. Cuando se comparan tratamientos múltiples, realizar el análisis aleatorios para evitar selección sesgada de ROIs y cegado.
  3. Exportar valores de barra y los tamaños de las áreas seleccionadas en una hoja de cálculo haciendo clic en archivo | E xport | Informe región 2D.
  4. Dividir la varilla de medición del ROI seleccionada por su área para obtener la densidad por área específica.
  5. Medir la barra del fondo de la placa y los valores correspondientes de la barra y el tamaño del área de exportación en una hoja de cálculo. Restar la señal de fondo promedio de cada valor de la barra de cada retorno de la inversión.
  6. Medio de las barras de repeticiones técnicas, es decir, sección Replica utilizando tejido del mismo animal.
  7. Utilizar la curva estándar para convertir las barras en unidades de atascamiento radioligand, es decir., equivalentes de tejido nCi/mg (TE).
    Nota: Se utiliza el TE de término porque las normas son generadas con materiales que simulan tejido.
  8. Expreso vinculante por la conversión de nCi/mg nmol/mg TE según la actividad específica de radioligando (ecuación 1).
    Equation(1)
  9. Para obtener los valores de unión específica, reste el atascamiento no específico de Unión total.
  10. Media la Unión de cada repetición biológica utilizando el medio de la técnica replica de cada animal (obtenido en paso 5.6).

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Representative Results

Utilizando el protocolo descrito, la distribución anatómica de los sitios de unión de alta afinidad GHB se visualizó con el análogo radiolabelled de GHB [3H] HOCPCA en cerebro de ratón, que fue cortado en secciones coronales, sagitales y horizontales (figura 3 ). Se observaron altos niveles de enlace en el hipocampo y la corteza, enlace inferior en striatum y no vinculante fue detectados en cerebelo, correspondiente a los patrones de expresión divulgado anterior de alta afinidad GHB sitios9,10, 11,12. Como se muestra aquí, las estructuras anatómicas pueden visualizarse con distintos planos de seccionamiento e integridad anatómica puede ser apoyado por tinción violeta de cresilo. Por sitios de unión de alta afinidad GHB, especialmente las regiones con el atascamiento radioligand baja, tales como cerebelo, se confirman con la coloración posterior de los tejidos (figura 3). Secciones coronales se encuentran más a menudo en la literatura9,10. Son prácticas para fines cuantitativos como puede obtenerse una mayor cantidad de secciones de un cerebro. Secciones sagitales y horizontales tienen la ventaja de visualizar el enlace durante la mayor parte del cerebro roedor dentro de una sección proporcionando gran Resumen. Figura 4ilustra la conservación evolutiva de los sitios de unión de alta afinidad GHB en el cerebro mamífero. [3H] Sitios de unión de HOCPCA fueron detectados en ratón, rata, así como en tejido de cerebro de cerdo lo que permite la comparación de la anatomía del cerebro bruto entre especies. Generalmente, conservación evolutiva y estudios de distribución regional pueden ayudar significativamente en la caracterización de una proteína de interés, en este caso un nuevo objetivo y así pueden dar indicaciones acerca de su función fisiológica19.

Los sitios de unión de alta afinidad GHB se sondeaba con GHB radioligands, que muestran diferentes afinidades de los sitios de Unión pero comparables actividades específicas (figura 5). [3H] HOCPCA fue demostrado previamente tener una Kd 74 nM, que es superior a la disponible comercialmente radioligando [3H] NCS-382 con Kd de 697 nM, ambos determinan en pH 6.0 por autorradiografía cuantitativa9. Por lo tanto, [3H] HOCPCA está dotado de mucho mayor sensibilidad, llevando a una excelente relación señal a ruido. Debido a la menor sensibilidad de [3H] NCS-382, mayor así concentraciones deben utilizarse para obtener niveles similares de enlace (Comparar con ejes en la figura 5). En comparación con [3H] GHB, incluso concentraciones más altas de radioligando (30 nM) son necesarias para alcanzar niveles comparables de la Unión. Esto es predominante debido a la menor afinidad (Kyo de 4.5 μm) de este radioligando20. Sin embargo, mayor concentración radioligand también aumenta el nivel de fijación no específica9,10 con un cociente signal-to-noise por lo tanto inferior. Esta serie de experimentos pone de relieve la importancia de tener una así de alta afinidad para la producción de imágenes de alta calidad.

Porque los sitios de alta afinidad GHB se expresan a niveles tan altos en regiones del cerebro anterior (60 pmol/mg17), la determinación de parámetros farmacológicos de las curvas de saturación es inherentemente difícil usando proyección de imagen de fósforo sensible tritio estándar placas debido al riesgo de imágenes sobresaturados. Por lo tanto, Kd valores para [3H] HOCPCA y [3H] NCS-382 se han obtenido por el primer determinante valores de K por curvas de desplazamiento homólogas y entonces el cálculo de Kd (figura 6)9. Para radioligands mayoría, una alternativa sería utilizar la dilusión del isótopo como se hace habitualmente en los ensayos de Unión homogeneizado. Por otra parte, se han determinado valores ded K a valores de pH diferentes. Evidentemente, los sitios de alta afinidad GHB más eficientemente se etiquetan a pH 6.0 (figura 6A y figura 6), ya que el cambio de ensayo condiciones de pH 7.4 substancialmente impacto afinidad ligando. Por lo tanto, la Kd para [3H] HOCPCA a pH 7,4 es de aprox. 30 veces superiores numéricamente a pH 6.0. Aumento del pH más resulta en un mayor grado de fijación no específica, que se convierte en una advertencia al usar la [3H] NCS-382 donde sólo pequeñas cantidades de unión específica pueden obtenerse en pH 7,4 (figura 6E). Esto en realidad dificulta la determinación de los parámetros farmacológicos usar este radioligando en pH fisiológico9, ilustrando una vez más el poder tener un radioligando con como alta afinidad como sea posible.

Figure 1
Figura 1: estructuras de radioligands dirigidos a los sitios de unión de alta afinidad GHB. Ácido carboxílico de [3H] 3-hydroxycyclopent-1-eno ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahidro-5-hidroxi-5H- benzocyclohept-6-iliden acético (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 y el ácido γ-hidroxibutírico [3H] ([3H] GHB)16 como Origanum radioligands con actividad específica comparable (20-40 Ci/mmol), así como [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125I] BnOPh-GHB)13 con una actividad molar estimada de 2000 Ci/mmol21. El elemento estructural de GHB está resaltado en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema Resumen del Protocolo de autorradiografía en vitro . (1) el animal es eutanasia, el tejido es disecada y snap-congelado en hielo seco. Luego se secciona tejido en un criostato, deshielo-montados en portaobjetos de microscopio y secciones (2) se incuban con así hasta Unión de equilibrio. Para la determinación de la Unión no-específica, soluciones se complementan con un desplazador sin etiquetar de una estructura química relacionada pero no idéntica. (3) posteriormente, así se elimina por lavado en tampon de ensayo y sales se eliminan por lavado con agua destilada H2O. Cuando los tramos estén secos, fijación de paraformaldehido (PFA) se realiza para establecer permanentemente la interacción ligando-proteína. Las secciones se exponen a las placas de la proyección de imagen de fósforo. (4) después de suficiente tiempo de exposición, las placas se escanean para obtener autoradiograms digitales. (5) finalmente, análisis de imagen se realizaron utilizando las definiciones de las regiones de interés (ROIs), y se cuantifica la Unión. En el ejemplo mostrado, densidades ópticas (ODs) se ilustran en las secciones de la corteza de ratón (izquierda) y el hipocampo (medio). La cuantificación se realiza exponiendo las secciones con una microescala de [3H] (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Autoradiograms representante de unión de HOCPCA de 1 nM [3H] ratón cerebro secciones. (A) así atar a coronal, plano de secciones de tejido horizontal y sagital para ilustrar la importancia de la sección en la visibilidad de las estructuras anatómicas. (B) cresil violeta tinción de secciones de tejido correspondientes para verificar regiones anatómicas, particularmente las regiones con baja o ausencia de unión de radioligando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Autoradiograms representante de unión de HOCPCA de 1 nM [3H] en las diferentes especies. Comparación de (A) rata, ratón (B) y (C) del cerdo autoradiograms en vitro con el fin de ilustrar la conservación evolutiva de los sitios de unión a las regiones corticales y del hipocampales junto con la anatomía del cerebro bruto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Rebanadas de cuantificación de la Unión a los sitios de unión de alta afinidad GHB con diferente sensibilidad a GHB radioligands por autorradiografía en vitro en cerebro de ratón corteza y el hipocampo. Enlace total se expresa en equivalentes de tejido fmol/mg (TE) para la radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) y (B) [3H] NCS-382 (7 nM) y (C) [3H] GHB (30 nM) (actividades específicas similares). Unión no-específica no fue detectado en la presencia de GHB de 1 mM o 1 mM HOCPCA para cualquiera de los radioligands (no mostrado). Datos se presentan como media ± SD de cuatro repeticiones biológicas que cada uno realizado en tres repeticiones técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos de autorradiográfica determinación de Kd y valoresmáximos B homólogo desplazamiento competitivo de [3H] HOCPCA y [3H] NCS-382 en secciones corticales de ratón a pH 6.0 y pH 7.4 a fin de ilustrar la influencia del pH sobre la afinidad de radioligands. (Kd y Bmáximo se calcularon utilizando el mismo compuesto como radioligando y competidor, a través de la determinación inicial de K valoresi 22). (A) Autoradiograms con óptima relación señal a ruido para el atascamiento de HOCPCA de 1 nM [3H] a pH 6.0. (B) cambio de tampón pH 7,4 requiere una mayor concentración de [3H] HOCPCA (8 nM) para alcanzar niveles de enlace significativo. Curvas de enlace de registro-concentración resultante (C); promedio ± SEM (D) 5. atascamiento de NCS-382 nM [3H] en pH 6.0 resulta en baja fijación no específica, mientras que (E) 40 nM [3H] NCS-382 es insuficiente para obtener Unión a pH 7.4. Curvas de enlace de registro-concentración resultante (F); promedio ± SEM. datos se obtuvieron de 3-4 repeticiones biológicas que cada uno realizado en 3-5 repeticiones técnicas, sólo de [3H] NCS-382 experimentos a pH 7.4 se realizaron con sólo 2 repeticiones biológicas. Para ambos radioligands, 1 mM que GHB fue utilizado para la determinación de la fijación no específica. Véanse detalles en el análisis y cálculo de Kd y Bmáximo9. Esta figura ha sido adaptada y reproducido de la publicación anterior9 con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La calidad de un ensayo autorradiográfica más a menudo se determina por la sensibilidad del radioligando. Un factor que contribuye es el radioisótopo seleccionado, que es dado por la disponibilidad de los ligandos conocidos o por la viabilidad de técnicas específicas de etiquetado para ligandos con actividad específica adecuada(es decir, la cantidad de radiactividad por la mole de la unidad de un radioligando)23y con cantidades limitadas de degradación química. Un gran número de radioligands de ligandos conocidos es etiquetado con tritio9,10,24,25,26, que deduce varias ventajas. En primer lugar, tritio (3H) se caracteriza por una larga vida media (años 12,43) promover el almacenamiento a largo plazo de los lotes individuales. En segundo lugar, la interacción ligando-objetivo no está distorsionada por el radionúclido como 3H-ligandos son biológicamente indistinguibles de sus compuestos de la matriz. El tritio emite baja energía β–-partículas, que viajan solamente distancias cortas en el tejido, resultando en alta resolución espacial y, posteriormente, la mayor distinción entre anatómico estructuras4. Sin embargo, el tritio etiquetado puede producir solamente para actividades específicas moderadamente altas. Esto es debido a que hay disponibles 3H-fuentes están contaminadas con hidrógeno no radiactivo. Generalmente, cuanto mayor sea la actividad específica, al menos así se necesita ceder detección sensible23. Por otra parte, se deben considerar que 3H-ligandos tienen la posibilidad de experimentar el intercambio de hidrógeno con agua dependiendo de la estabilidad de la 3H-etiqueta. Para compensar la baja expresión o actividad específica muy baja, puede utilizarse yodo-125 como el radionúclido13. La actividad específica máxima de yodo-125 es aprox. 100-fold superior de tritio. Sin embargo, varias consideraciones adicionales deben hacerse cuando se trabaja con yodo-125. Por ejemplo, la adición de yodo-125 normalmente induce alteraciones estructurales en la molécula que pueden afectar las interacciones ligando-objetivo. Como yodo-125 tiene una vida media de 60 días, se debe considerar corrección por deterioro diario para actividad específica y cuantificación de las interacciones ligando-destino23. 125 Ligandos emiten fotones γ y a pesar de mucho mayor sensibilidad, producen imágenes de baja resolución. Esto es debido a la relación inversa entre la resolución y la máxima energía del isótopo (como se explica a continuación). Finalmente, en comparación con tritio, aumento debe tener cuidado al manipular el yodo-125, debido a la mayor energía del radionúclido.

Según el nuclide, espesor de sección de tejido puede influir en resolución. La baja energía β–-radiación de tritio limita su alcance tejido a aprox. 5 μm debido al ensimismamiento. Como consecuencia, la cuantificación no es influenciada por espesor de tejido cuando el espesor de sección superior a 5 μm27,28. Por el contrario, la desintegración radioactiva de isótopos de alta energía tiene una mayor penetración del tejido, resultando en baja resolución de la imagen porque ligandos con una mayor distancia en el medio de detección también contribuyen a la formación de la imagen. En consecuencia, las secciones más delgadas promoción mayor resolución para radionucleidos alta energía1.

El establecimiento de un protocolo autorradiográfica requiere conocimiento de las condiciones de Unión óptima (p. ej., buffer, pH y temperatura) y parámetros farmacológicos del radioligando en términos de afinidad y cinética. Si el así no se ha caracterizado antes, los estudios exploratorios son necesarios29. Elegir una concentración radioligand óptimo está guiado por la afinidad del radioligando y la abundancia de sitios de Unión. Normalmente, se utiliza una concentración de 5 - 6 veces Kd para asegurarse de que todos los sitios de Unión están saturados de30. Otro enfoque tiene como objetivo producir el cociente más alto del total-a-no específica vinculante seleccionando así concentraciones por debajo de Kd31 y ahorrar así solución al mismo tiempo. Este enfoque es particularmente útil cuando el sitio de Unión es muy abundante en el tejido examinado, puesto que así altas concentraciones aumentaría las posibilidades de oversaturating autoradiograms, como el caso de [3H] HOCPCA y el GHB alta afinidad enlace sitios9. Además, para etiquetar eficazmente toda la población de la proteína específica, el radioligando idealmente debe enlazar a todos los conformations posible objetivo. Especialmente en la autorradiografía de receptores, el uso de agonistas sólo puede revelar un número parcial de receptores totales ya que algunos pueden estar presentes en Estados de agonista de baja afinidad. Por el contrario, antagonistas neutros suelen mostrar afinidad por los receptores Estados26,29.

Por otra parte, experimentos de enlace generalmente se realizan bajo condiciones obligatorias de equilibrio. Por lo tanto, el tiempo necesario para llegar a Unión de equilibrio bajo las condiciones experimentales deseadas (concentración radioligand fijo, buffer y temperatura) debe determinarse en experimentos de Asociación para enlace de equilibrio en el ámbito de la experimento4,23,30. Después de la incubación así, así es lavada por varias incubaciones con tampón de ensayo y típicamente seguido por enjuague en agua destilada H2O. Signal-to-noise ratios pueden ser optimizados mediante el ajuste de temperatura y el tiempo depende de la tasa de disociación del radioligando26,30,31.

Radioligands puede mostrar enlace a materiales no biológicos, es decir, fijación no específica. Unión de radioligando a componentes celulares que no sean el objetivo se define como Unión inespecífica. Se evalúa la contribución de la Unión inespecífica a la cantidad total de unión de radioligando en presencia de un ligando sin etiquetar competidora que se enfoca en el mismo sitio de Unión como el radioligando. Como el compuesto no radiactivo (displacer) se suministra en exceso de 10.000, que ocupa el sitio de Unión y el radioligando sólo puede enlazar a sitios26,31,32objetivo. Crucial, el compuesto sin etiqueta debe ser de una estructura química diferente que el radioligando ya que esto disminuye el riesgo de desplazar tanto específicos como no específicos vinculantes23. Unión no-específica derivadas de unión a las membranas puede ser un problema importante especialmente en el caso de radioligands bastante lipofílico. En algunos casos, procedimientos de lavado amplia pueden quitar así encuadernado no receptores y por lo tanto mejorar la específica vinculante relación29.

Al elegir un tampón de ensayo, es crucial considerar el efecto de fuerza iónica y pH en la interacción ligando-objetivo. Especialmente electrostáticas interacciones entre ligandos polares y componentes de sitios de Unión están influenciadas por la fuerza iónica del buffer. Por lo tanto, la suplementación con iones monovalentes o divalentes puede afectar la afinidad efectiva constante23,33. Si se desconoce la composición del buffer óptimo para la interacción ligando-destino estudiado, se deben explorar diferentes buffers común en experiencias piloto. Almacenadores intermediarios también podrán completarse con los antioxidantes como ácido ascórbico y los inhibidores de degradar enzimas29,34. Además, la ionización de grupos específicos en el sitio de unión o en el ligand sí mismo es influenciada por el pH y tiene efectos críticos sobre la constante de unión de equilibrio, las constantes de tipo cinético y fijación no específica23,33. Por ejemplo, sondeando el GHB alta afinidad vinculante sitio con diferentes GHB radioligands bien ilustra la importancia del pH en este destino de enlace (figura 6). Caracterizar el pH óptimo para la interacción ligando-receptor también puede dar pistas sobre la importancia del objetivo en relación con su importancia biológica.

Otro factor crítico en la autorradiografía digital es el tiempo de exposición, es decir, el tiempo necesario para lograr autoradiograms cuantificables exponiendo las secciones de tejido radiactivamente a las placas de la proyección de imagen de fósforo. Las estimaciones se basan en la cantidad de radiactividad de la muestra, la energía y la vida media del isótopo así como el deseado cociente signal-to-noise. En particular, prolongados resultados de tiempo de exposición en imágenes saturadas y señal de alto de fondo. Señal de fondo elevado puede reducirse mediante el almacenamiento de cintas en entornos de blindaje de plomo para evitar radiación cósmica1,4. Sin embargo, si se logran autoradiograms subóptimas, la muestra puede estar expuesta en múltiples ocasiones, siempre que el complejo ligando-destino es fijo y la vida media del radionúclido permite.

Las placas de la proyección de imagen de fósforo pueden ser reutilizado y tienen una vida útil larga cuando se maneja correctamente, es decir, de flexión debe ser evitada y placas deben guardarse en un ambiente seco. El manejo de las placas de la proyección de imagen de fósforo es guiado por su sensibilidad a la radiación cósmica y luz. Por lo tanto, es importante borrar la placa antes de cada uso para minimizar la señal de fondo. Exposición de secciones de tejidos marcados radiactivamente a las placas de imagen se realiza en cintas de blindaje de radiación completamente desprovista de luz. Al transferir la placa al lector al final del tiempo de exposición, cualquier luz ambiental también se debe evitar como incluso corto contacto con la luz blanca reduce la señal acumulada. Además, las placas deben analizarse inmediatamente después de la extracción de la muestra para evitar la atenuación de la señal. Una desventaja del uso de las placas de la proyección de imagen de fósforo es la potencial aparición de artefactos y residual "imágenes fantasma" después de uso repetido de las placas de1.

Trabajar con tritio requiere proyección de imagen las placas sin una capa protectora para permitir la radiación de baja energía llegar a los cristales de fósforo. Placas de fósforo de tritio-sensible por lo tanto son más sensibles a contaminación o deterioro por manipulación incorrecta. Una vez contaminado, placas sensibles a tritio no pueden limpiarse y necesitan ser reemplazados. Fijación del complejo ligando-blanco con vapor de PFA reduce la posible contaminación de la placa, alargando su vida útil. Por otra parte, la deshidratación de los tejidos después de la fijación es un paso crucial ya que las placas sensibles de tritio son sensibles a la humedad. Debido a su naturaleza delicada, sensible al tritio placas no deberían utilizarse para otros isótopos1,4. Por el contrario, las placas para alta energía isótopos como el yodo-125 son más robustas y su superficie puede incluso limpiar con etanol al 70%.

Película sensible a la radiación se ha utilizado tradicionalmente, para el registro espacial de decaimiento radiactivo. Mientras que se pueden obtener imágenes de alta resolución, autorradiografía de la película tiene varias limitaciones. Además de la necesidad de productos químicos peligrosos y un cuarto oscuro para el desarrollo, la película de rayos x se caracteriza por un rango dinámico estrecho. Por lo tanto, puede ser necesario exponer radiomarcadas secciones repetidas veces con tiempos de exposición diferentes para lograr imágenes no saturados cuantificables35. Por otra parte, la película de radiografía exhibe sensibilidad limitada en tiempos de la exposición sostenida para muestra marcada con isótopos de baja energía, es decir. decaimiento del tritio puede requerir varios meses de exposición. Baja sensibilidad, combinada con gama lineal pequeña hace la técnica extremadamente desperdiciador de tiempo, especialmente cuando las condiciones analíticas óptimas tienen que ser determinada primero1,35.

Con el desarrollo de las placas de la proyección de imagen de fósforo, varias de estas limitaciones han sido tratados35,36,37. Las placas de imagen sirven para almacenar temporalmente las imágenes de decaimiento radiactivo, que representa el arreglo espacial de radioligando en la muestra de tejido. Cristales de fósforo de Photostimulable BaFBr:Eu2+ se utilizan para captar la energía radiactiva emitida por la muestra, como resultado de radiación (p. ej., rayos x, rayos gamma o partículas beta) de alta energía en la excitación de la UE2+ a UE3+ y la consecuente captura del electrón liberado en el fósforo del enrejado4,37. Exponer la placa de imagen a la luz visible o infrarrojo invierte la reacción, es decir, el electrón atrapado se libera y en la transformación de la Unión Europea3+ a UE2+ se emite luminiscencia. La luz emitida es proporcional a la cantidad de radiactividad y su detección por un fotomultiplicador permite la creación de la autoradiogram digital de37. Este sistema proporciona un aumento en la sensibilidad acompañada de una reducción marcada en el tiempo de exposición de meses a días3. Además de eso, el rango dinámico lineal se incrementa considerablemente, que reduce la posibilidad de imágenes sobresaturados. Linealidad se da dentro de cuatro a cinco órdenes de magnitud y se ha validado varias veces3,35,36,37,38. Aunque autorradiografía de la película todavía proporciona resolución espacial superior, los esfuerzos en tecnología de análisis resultaron en la mejora de la resolución de 300 a 25 μm (tamaño de píxel), permitiendo la diferenciación detallada entre regiones anatómicas3. En general, las placas de fósforo están facilitando la adquisición de la autoradiograms digitales tanto debido a un mayor rango lineal y la sensibilidad. Tiempo de exposición reducido y una técnica de desarrollo simplificado significativamente conducen a menor tiempo de análisis de datos que permite un mayor rendimiento.

En comparación con autorradiografía, parámetros farmacológicos útiles tales como afinidad y densidad también comúnmente se caracterizan por la aplicación de radioligands en tejido homogeneizado vinculante ensayos. Este método tiene la ventaja de producir resultados mediante la medición de radiactividad β emitida con un detector de centelleo líquido de una manera eficiente2. En un enfoque multi-así, por ejemplo, en placas de microtitulación de 96 pocillos, tales ensayos son útiles para la detección de las bibliotecas de compuestos y para un mayor número de relaciones dependiente de la concentración. Además, realizar análisis de saturación con esta configuración es más factible en comparación con autorradiografía, que muestra un riesgo de imágenes sobresaturados con concentraciones alta así. Sin embargo, realizar desplazamiento homóloga de concentración radioligand baja fija con ligandos no radiactivo para obtener Kd y Bmax evita el problema de la cantante imágenes (figura 6)22. Autorradiografía y homogeneizado enlace producen estimaciones similares para las constantes de afinidad ligando Considerando que la densidad del tejido de la proteína de interés se puede subestimar en el enlace de homogeneizado. Así, se ha propuesto que membrana celular alteración concomitante a la homogeneización del tejido puede resultar en la pérdida del receptor o alterado vinculante condiciones3,33. Por otra parte, errores en la disección del tejido pueden producir homogenados contaminada con tejido de regiones adyacentes del cerebro. En comparación, enlace complejos patrones en pequeños núcleos son visualizados y diferenciables debido a la resolución anatómica espacial en autorradiografía3,33.

Inmunohistoquímica visualiza también la distribución de una proteína de interés anatómico. El método es capaz de producir imágenes de alta resolución anatómica, como componentes de tejidos diferenciados pueden identificarse a nivel celular y subcelulares incluso niveles usando microscopia electrónica. Se evalúan los niveles de expresión basada en la intensidad de la tinción. Sin embargo, la cuantificación absoluta de niveles de expresión es difícil debido a la falta de estándares de referencia39. Por otra parte, immunohistochemistry depende de la disponibilidad de un anticuerpo selectivo, validado, que suele ser un problema en la investigación del receptor.

Antes de decidir realizar la autorradiografía en vitro , deben hacerse varias consideraciones. En primer lugar, preparación de tejido post mortem como seccionamiento así como la congelación y descongelación repetida puede influir en la preservación de enlace sitios2. Además, el método depende de la disponibilidad de un radioligando adecuado, que muestra gran afinidad y selectividad para el destino en cuestión2. El radioligando no debe mostrar la importante Unión a sitios fuera del objetivo, y también debe demostrar un perfil cinético favorable. Esto es necesario porque el complejo ligando-target debe permanecer intacto durante el alcance del experimento. Por otra parte, cuando existen compuestos no radiactivos adecuados, la introducción del radionúclido podría convertirse en un factor crítico. Así, la molécula de interés debe estar equipada con adecuada grupos funcionales para el marcado radiactivo eficiente, que permite la producción de radioligands con actividad específica suficientemente alta y estabilidad química40. Otra desventaja de autorradiografía en vitro es que el método sólo permite el uso de un animal una vez. Más elegante es el en vivo de métodos como la tomografía por emisión de posición (PET), que permite la exploración repetida del mismo animal y determinación de la ocupación y las características de enlace dinámico. El PET es especialmente valioso para el estudio de los mamíferos más altos41 y de optimización de dosis en los estudios preclínicos 42,43,44.

Varias modificaciones de la técnica autorradiográfica extienden su aplicación tanto en la caracterización de objetivos farmacológicos en Estados sanos y enfermos, así como en el desarrollo y descubrimiento de fármacos. En primer lugar, los avances recientes en tecnología de imagen han llevado al desarrollo de la autorradiografía en tiempo real. Detectores de gas α/β-partículas de obvian la necesidad para placas o películas, proyección de imagen por la medida directa de desintegraciones, produciendo rápida digital autoradiograms45.

Por otra parte, en vitro autorradiografía permite estudios de la funcionalidad de G proteína-juntó los receptores (GPCRs) además de información sobre su distribución anatómica en tejidos post-mortem. Esta variante del método consiste en la incubación de las secciones de tejido con un radiactivo con análogo de la guanosina trifosfato (GTP), es decir, [35S] guanosina 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), junto con un agonista no radiactivo de lo GPCR. Cuando el agonista se une y provoca una respuesta de lo GPCR, la incorporación de [35S] GTPγS puede ser localizada y cuantificada mediante autorradiografía, que refleja solamente el receptor activado población2,46,47 .

Ex vivo autorradiografía representa otra versión de la técnica, que evalúa la Unión regional de un radioligando después de la administración a un animal experimental directo. Tras el sacrificio del animal, cryosectioning del tejido en cuestión y resultado de la exposición autorradiográfica en autoradiograms que reflejan la radioligand binding en vivo2. Ex vivo autorradiografía es empleado comúnmente en los programas de descubrimiento y desarrollo de drogas para obtener información sobre el perfil farmacocinético de un cable compuesto, es decir, su absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) . Autoradiografía particular todo el cuerpo proporciona una idea sobre la distribución de los fármacos a todos los órganos y tejidos. Sin embargo, determinación de la Unión no específica y cuantificación es más difícil comparado con autorradiografía en vitro debido a posible metabolismo y degradación de lo así y no hay medios para lavar lejos desatado ligando48.

Autoradiografía también se utiliza para la prueba preliminar y caracterización de ligandos de mascotas4. Los radionúclidos alta energía carbono-11 y flúor-18 más a menudo se utilizan para ligandos de PET. PET resulta un prominente, no invasivo para radioligands ya cuantificables imágenes 3D de la radioligand binding en un animal vivo pueden obtenerse11,40,49.

In vitro autorradiografía usando las placas de la proyección de imagen de fósforo representa un método de análisis valiosos para la caracterización farmacológica de las interacciones ligando-objetivo. El método produce resultados reproducibles por el empleo de un protocolo relativamente simple y rápido una vez establecidas las condiciones analíticas óptimas. Distribución anatómica de una proteína de interés se determina dentro de su microambiente nativo, que permite el estudio de su función fisiológica, farmacológico y patológico en el tejido sano y enfermo post-mortem de animales de experimentación así como los seres humanos2,47.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de interés.

Acknowledgments

El trabajo fue financiado por la Fundación Lundbeck (Grant R133-A12270) y el Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Los autores agradecen a Dr. Aleš Marek para el suministro de radioligando [3H].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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