Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Abstract

במבחנה autoradiography נועד להמחיש את התפלגות האנטומי של חלבון עניין ברקמות חיות ניסוי, כמו גם בני אדם. השיטה מבוססת על הכריכה ספציפי של radioligand למטרה הביולוגי שלו. לכן, מקטעי רקמת קפוא מודגרת עם פתרון radioligand, האיגוד אל המטרה הוא לאחר מכן מקומי על ידי הגילוי של דעיכה רדיואקטיבית, לדוגמה, באמצעות סרט פוטוסנסיטיבית או זרחן הדמיה צלחות. Autoradiograms דיגיטלי שנוצר להציג רזולוציה מרחבית יוצא דופן, אשר מאפשרת כימות ולוקליזציה של איגוד radioligand במבנים אנטומיים ברורים. יתר על כן, כימות מאפשרת אפיון ליגנד זיקה תרופתי באמצעות קבועי דיסוציאציה (דK), עיכוב קבועים (Kאני), כמו גם הצפיפות של אתרי קישור (Bmax) ברקמות שנבחרו. לכן, השיטה מספקת מידע אודות המטרה לוקליזציה והן ליגנד סלקטיביות. כאן, הטכניקה היא ביטוי עם אפיון autoradiographic של החומצה גבוה-זיקה γ-hydroxybutyric (אסיד) מחייב אתרי ברקמת המוח יונקים, תוך שימת דגש מיוחד על שיקולים מתודולוגי בנוגע וזמינותו מחייבת פרמטרים, הבחירה של radioligand ואת שיטת זיהוי.

Introduction

Autoradiography היא שיטה אשר מספק תמונות של דעיכה רדיואקטיבית. הטכניקה משמשת באופן שגרתי ללמוד התפלגות רקמת חלבון של עניין במבחנה המבוססת על אינטראקציה עם תרופתי ספציפי בין תרכובת radiolabelled המטרה שלו. זה מספק מידע ישיר על סלקטיביות ליגנד המטרה. במבחנה autoradiography עשוי לשמש גם קביעה כמותית של איגוד תרופתי הפרמטרים של radioligands, כגון קבוע דיסוציאציה (דK), צפיפות של אתרי קישור (Bmax), כמו גם לקביעת עיכוב הקבוע (Ki) של ליגנדים מתחרות1,2. בהשוואה לאיגוד radioligand homogenate מסורתיים, autoradiography יש את היתרון של מסוגל לדמיין אנטומיה המרחבי ולתת פרטים תמציתי של דפוסי ביטוי אזוריים3. השיטה של autoradiography לכן חלופה רלוונטי immunocytochemistry, במיוחד בהעדר נוגדן המאומת. Autoradiography מיושם בקלות בתוך מעבדה סטנדרטיים radioisotope קיבלו את הזמינות של radioligand מתאים עם יחודיות תרופתי הנדרש, גישה cryostat מיקרוטום עבור הכנת רקמות, ומקטעים של הדמיה מתאימים המכשיר כי הוא מסוגל לנתח את ההפצה של רדיואקטיביות בסעיפים המתאימים רקמות. ראוי לציין, קריטריון הבחירה חשובה עבור radioligand הוא כמות מוגבלת של איגוד לאתרים שאינם-יעד. זה יכול להיות חלבונים, ריריות או חומרים כגון פלסטיק או מסננים אחרים, הוא המכונות במקובץ מחייב שאינם ספציפיים. בדרך כלל, לא ספציפית מחייבת היא אי-saturable אבל יכול להיות saturable אם זה קשור חלבון חופש-יעד ספציפי. הדרך הטובה ביותר של אימות נכון מחייב ספציפית היא להשוות בין רקמות חסר המטרה, למשל, גנטית מהונדסים רקמות (הנוק-אאוט)4.

. הנה, המתודולוגיה מודגם עם אפיון האתר גבוהה-זיקה מחייב עבור חומצה γ-hydroxybutyric (אסיד) במוח של יונקים autoradiographic. הבנת האינטראקציה תרופתי בין אסיד לבין אתר איגוד שלו הוא מידת הרלוונטיות וכן אסיד שני תרופה שימושי קלינית לטיפול narcolepsy אלכוהוליזם5, אלא גם נתין הטבעי של המוח יונקים ו של פנאי סמים6. אתרי קישור אסיד גבוה-זיקה תוארו לראשונה באמצעות קשירה אסיד [3H] rat-המוח-homogenate-7. במהלך השנים, לקדם מחקרים autoradiography עם [3H] אסיד ופניות של [3H] רכיבי NC-382, הראה צפיפות גבוהה של איגוד אתרי באזורים הקדמי של עכברוש8,9,10, עכבר9 , חזיר המוח של11וקוף אדם-12. עם זאת, זהות מולקולרית והרלוונטיות המדויק פונקציונלי של אתרים אלה מחייב נשארו חמקמק.

עם כוונה לאפיין נוספת של אתרי קשירה, וכדי להקל על מחקרים על תפקיד פיזיולוגי של אסיד, פותחו מרובים radioligands שילוב איזוטופים שונים ניחן הזיקות השונות ([3H] GHB, [3 H] רכיבי NC-382 [3H] HOCPCA, [125אני] BnOPh-GHB)13,14,15,16(נבדקה17) (איור 1). השילוב של radioligands גבוהה-זיקה סלקטיבית, צפיפות רקמת גבוהה מאוד של האיגוד אתרי אפשרו לייצור של תמונות באיכות גבוהה באמצעות הזרחן הדמיה טכניקה9,11. יחד עם חלוקה לרמות של נקודות מעשיות בהגדרת ניסוי autoradiographic ואיור לצורך המחשה פרטים, המקטע לדיון ידגיש i) הבחירה של רדיונוקלידים ii) בחירה וזמינותו תנאי, iii) השימוש פוספור הדמיה צלחות לעומת לסרטי רנטגן. המטרה הכוללת של מאמר זה נועד לספק פרטים טכניים, מתודולוגי ומדעיים על טכניקת autoradiography בשביל לידע על רקמות הפצה וניתוח תרופתי של חלבון מטרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה בהתאם להנחיות של Inspectorate ניסויים בבעלי חיים דנית.

הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מכסה רקמות הכנה (קרי, רקמת מוח העכבר), במבחנה autoradiographic וזמינותו בפירוט מספיק עבור הגדרת השיטה במעבדה החדשה, את החשיפה פוספור הדמיה הצלחות כמו גם לאחר מכן ניתוח densitometric של autoradiograms (איור 2) עם המטרה של לוקליזציה וכימות radioligand מחייב במבנים אנטומיים ברורים. לשם השוואה היסטולוגית, עבור cresyl, ויולט מכתים פרוטוקול הינה כלולה. יתר על כן, הקביעה של איגוד שאינם ספציפיים עם ליגנד מתחרות נכלל בתוך הפרוטוקול. לקבלת תיאור מפורט אודות אופן קביעת Kd, Bמקס או קייאני, ראה הפרסום הקודם4.

1. רקמות הכנה על ידי Cryosectioning

  1. המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומנתחים באופן מיידי את המוח באמצעות מלקחיים ומספריים. ישירות להמשיך לשלב הבא כדי למנוע נזק לרקמות.
  2. Snap-הקפאת הרקמה על ידי צלילה אבקת קרח יבש, גז CO2 או איזופנטאן. ישירות להעביר הרקמה קפוא cryostat עם הטמפרטורה מוגדר כ-20 ° C. לחלופין, לאחסן את הרקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.
    הערה: להימנע חוזרות מפשיר הקפאה כדי להפחית נזק לרקמות.
  3. תן את הרקמה להתאקלם-20 ° C ב- cryostat למשך 20 דקות לפני עיבוד נוסף כדי למנוע ניפוץ רקמות.
  4. לכסות את קופסת הטישיו בינונית ההטבעה בחוץ cryostat ולמקם במהירות את הדגימה רקמות קפוא הכיוון הרצוי אמנם המדיום ההטבעה עדיין נוזלי. למשל, מקום במוח העכבר אנכית אל המוח על מנת להשיג חלקים הילתית rostral. להעביר את קופסת הטישיו בחזרה cryostat ולחשוף את המדיום ההטבעה לטמפרטורות מתחת-10 ° C עבור טרשת.
    הערה: דגימות רקמה שברירית צריך להיות מצופה הטבעה בינוני בתוך התבניות רקמות לפני הרכבה.
  5. בעמדה בעל רקמת האזמל הקטן cryostat. התאם את הכיוון של הרקמה כדי להימנע מקטעים משופע.
  6. לחתוך את הרקמה בעזרת הדרכתו של אטלס stereotaxic18 בסעיפים של עובי הרצוי (12 מיקרומטר מומלצת [3H] מתויג ליגנדים). בזהירות ליישר לגולל את המקטע עם מברשת בגודל קטן במידת הצורך, הפשרה-הר המקטע לשקופית מיקרוסקופ. ברצף לאסוף את הסעיפים מאזור עניין לשכפול טכני הרצוי (למשל, 4 סעיפים לכל שקופית).
  7. לאפשר את המקטעים של השקופיות כדי מילה נהדרת עבור 1 h לפני טיפול נוסף.
    הערה: תוספת של חומר? סופג לחות לתיבות שקופית ממזער הצטברות לחות על הסעיפים רקמות. Procotol יכול להיות עצר כאן על-ידי אחסון לטווח ארוך מקטעים בתיבות שקופיות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. במבחנה Autoradiography

זהירות: רדיואקטיביות. עובד מעבדה מוסמכת על פי תקנות מקומיות. ללבוש ביגוד מגן. . היפטר בהתאם דעיכה רדיואקטיבית או מיקור חוץ לחברה מוסמך.

  1. להפשיר את המקטעים במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תווית של השקופיות עם תנאים ניסיוני. השתמשי בעיפרון כי השקופיות שאתה רוחץ אתנול במהלך צביעת עוקבות.
  2. מקם את השקופיות אופקית מגשי פלסטיק.
    הערה: מיקום השקופיות על פלטפורמה מוגבהת בתוך מגשי פלסטיק מקלה על הטיפול שלהם.
  3. Incubate מראש הסעיפים רכוב על השקופיות במאגר assay מותאם למטרה המדובר (עבור פרוטוקול אסיד, 50 מ מ KHPO4 מאגר pH 6.0 משמש) על-ידי החלת בקפידה אמצעי אחסון המתאים על גבי השקופית (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4).
    הערה: ודא כי כל קטע מכוסה לגמרי נוזלי.
    1. מכסים את מגשי פלסטיק עם מכסה על מנת למנוע אידוי, דגירה מראש בטמפרטורה הרלוונטיים (עבור פרוטוקול אסיד incubate מראש למשך 30 דקות ב- RT) תחת עדין קבוע (20 סל ד) לוחץ על צלחת מטרף.
    2. מצפני מחייב שאינם ספציפיים, תוספת assay מאגר עם ריכוז הרלוונטיים של המתחם unlabelled (עבור פרוטוקול אסיד, 1 מ"מ אסיד).
      הערה: ייתכן הדגירה מראש שלא יהיה צורך.
  4. יוצקים את נוזל טרום דגירה מכל שקופית ולאחר להעביר את השקופיות חזרה אל מגש פלסטיק.
  5. כדי למנוע התייבשות, מיד דגירה הסעיפים הרלוונטיים ריכוז של radioligand במאגר assay בתנאים הרצויים (עבור פרוטוקול אסיד, 1 ננומטר [3H] HOCPCA עבור 1 h RT) על ידי כיסוי הסעיפים לחלוטין עם radioligand פתרון (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4).
    1. דגירה תחת תחת עדין קבוע (20 סל ד) רעד של מגשי פלסטיק עם מכסה סגור.
      הערה: ריכוז radioligand הניתנים לאימות על ידי ספירת של aliquot ב מונה נצנוץ נוזלי.
  6. להסיר את הפתרון דגירה על ידי לשפוך את הנוזל, להעביר את השקופיות לתוך ארון שקופיות מיקרוסקופ. מיד להמשיך לשלב הבא כדי למנוע התייבשות סעיף.
  7. לשטוף את השקופיות. עבור פרוטוקול אסיד, לשטוף עם מאגר assay כקרח פעמיים עבור 20 s ולאחר מכן לשטוף ואז פעמיים בטבילת המדף שקופית במגשים מלאים קרח מים מזוקקים להסרת מלחים. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת עבור air-drying לפחות שעה-RT או יבש השקופיות עבור 5 דקות עם מפוח להגדיר טמפרטורה קר.
    הערה: כביסה חייב להיות מותאם במיוחד, למשל, כביסה נרחב עשויה להיות שימושית עבור הפחתת מחייב שאינם ספציפיים.
  8. להעביר את השקופיות fixator המכילה אבקת paraformaldehyde (PFA) עבור קיבוע לילה עם כדורגלן האדים ב RT כדי להגן על היושר של המתחם ליגנד-יעד.
    התראה: PFA רעיל. למקם את fixator בתוך מנדף, להימנע ממגע עור/עיניים עם כדורגלן.
  9. למחרת, להעביר את השקופיות תיבת desiccator המכילה סיליקה ג'ל עבור h 3 RT לסלק לחות.

3. חשיפה פוספור הדמיה צלחות וסריקה

  1. מקום הסעיפים קלטת ממוגן קרינה צלחת הדמיה עם רקמת פונה כלפי מעלה. על כימות עוקבות של איגוד radioligand, לכלול microscale [3H] של כל קלטת. לארגן את הסעיפים באופן אקראי ולחשוף את הסעיפים להשוואה ישירה במגרה אותו.
  2. למחוק את הזרחן טריטיום רגיש הדמיה צלחת מיד לפני השימוש כדי להסיר שהצטברו. אותות אחסון וכדי לחסל את הרקע אותות. לכן, לטעון את הצלחת לתוך מכונת הדמיה פוספור, לחשוף אותם בפני גלוי/אינפרא אדום בהיר על פי ההוראות של היצרן.
  3. הסר את הלוחית של מכונת הדמיה פוספור והכנס אותו מיד בסעיפים בקלטת. ודא כי בקלטת סגורה לחלוטין. חושפים את הסעיפים לצלחת הדמיה פוספור במשך 3 ימים ב- RT מפני אור.
  4. כי אור מוחק אות מהצלחת הדמיה, בזהירות לפתוח את הקלטת בחושך מיד להעביר את הצלחת ההדמיה לתוך התיבה כהה imager פוספור או למקם םלצה פוספור בחדר חשוך.
    הערה: הקפד notate הסידור המרחבי של השקופיות במהלך החשיפה כדי לזהות הדגימה בודדים על התמונה הדיגיטלי לאחר ניתוח. לכן, צלחות הדמיה פוספור להציג גם פינה אחת חיתוך זווית ברורים על מנת לזהות את הכיוון הנכון של הצלחת על התמונה הדיגיטלית.
  5. סרוק את הצלחת לרזולוציה הגבוהה ביותר ניתן לקבל תמונות דיגיטליות.

4. אופציונלי: Cresyl מכתים סגול סעיפים רקמות

  1. להכין 1% cresyl, ויולט פתרון על ידי ערבוב 5 g אצטט cresyl סגול ב- 500 מ"ל מים יונים (dH2O) עד התפרקה (כ ח 2). לסנן באמצעות נייר סינון באמצעות משפך לתוך בקבוק 500 מ"ל חדש. להתאים את ה-pH ל 3.5-3.8.
  2. מיקום ההכתמה שקופית להגדיר תחת fume המנוע. להכין מגשים עם הפתרונות הבאים לפי לבן מגשי פוליפרופילן (למעט קסילן):
    א 50% ethanol/50% dH2O
    נולד ב 70% ethanol/30% dH2O
    ג. 100% אתנול
    ד 100% אתנול
    אי 100% dH2O
    פ 1% cresyl סגול
    ג 0.07% חומצה אצטית (להוסיף µL 175 של חומצה אצטית 250 מ של dH2O).
    ה 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק
    אני 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק
  3. להעביר את השקופיות למכסה fume ומניחים בארון תקשורת שקופית.
  4. יתמוסס ליפידים באמצעות הגדלת סדרת מדורגת של אתנול dH2O 100% אתנול (מגש-ד) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  5. נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  6. לטבול את דגימות בפתרון cresyl, ויולט למשך 10 דקות.
  7. יש לשטוף את דגימות ב- 0.07% חומצה אצטית ע י הרמת את השקופיות מעלה מטה בעדינות על ס' 4-8 לשטוף את השקופיות בטבילת dH2O עבור 1 דקות.
  8. מייבשים את דגימות ע י השריית השקופיות ב-30 s בסדר עולה ריכוזי אתנול (מגש-ד).
  9. העברת דגימות דרך שני מגשים של קסילן 100% (מגש h ואני) כדי להרוות האתנול.
  10. נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  11. הסר את השקופיות תמיסת מלח עם מלקחיים. הוסף מספר טיפות של הממס האורגני הרכבה מדיה לכל שקופית ולהוסיף coverslip 24 x 60 מ מ על גבי כדי להגן על דגימות. להסיר בועות אוויר בין הדגימה coverslip בהקשת בעדינות על גבי coverslip.
    הערה: שמור את השקופיות הנותרים קסילן במהלך ההרכבה כדי למנוע התייבשות.
  12. השקופיות יבש לילה בשכונה fume-RT.
  13. להשיג תמונה של הדגימה עם מיקרוסקופ, המטרה X 1.25.

5. densitometric ניתוח של תמונה דיגיטלית

  1. למדוד צפיפות אופטית היחסי (מוטות) של כל כיול סטנדרטי מ microscale [3H] עם תוכנת ניתוח התמונה.
    1. בחר אזור בגודל זהה עבור כל נקודה של microscale [3H] בעזרת כלי ליצירת אזור של פריט התפריט אזור נחישות. להקצות מספר בכל אזור שנבחר על ידי לחיצה על מספר תחת פריט התפריט תווית.
    2. ייצוא OD ערכים עבור כל נקודת הכיול סטנדרטי על ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח. להעביר ערכים רוד גיליון אלקטרוני, לנרמל לפי גודל האזור שנבחר. לבצע רגרסיה ליניארית כדי לקבל עיקול רגיל לצורך ניתוח densitometric נוסף.
      הערה: ודא כי האזורים שנבחרו לוחיות ההסבר על מנת לזהות התאמת ערכי רוד ודוגמאות.
  2. לבצע כימות של autoradiograms באמצעות קניינית imaging התוכנה על-ידי בחירת האזור עניין (ROI) באמצעות כלי יצירת אזור בכל מקטע ומדידת שלה מקרי מוות ממנת יתר. בחר באותו האזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור האזור של עניין, אשר הועתקו, שמותאם ידנית כדי הבדלים קלים באנטומיה המוח על כל autoradiogram. לזהות את האנטומיה של רועי על ידי השוואה של autoradiograms עם אטלס18המוח. כאשר טיפולים מרובים מושווים, לבצע את הניתוח עיוור ולא אקראי כדי להימנע משוחד מבחר ROIs.
  3. ייצוא ערכים רוד והגדלים של אזורים שנבחרו לתוך גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח.
  4. לחלק את המוט מדודה של רועי שנבחרו על ידי אזור שלו כדי להשיג הצפיפות לכל אזור מסוים.
  5. למדוד את המוט של הרקע של הצלחת ולייצא ערכים רוד מתאימים וגודל האזור לתוך גיליון אלקטרוני. להחסיר את האות רקע הממוצע של כל ערך רוד של כל רועי.
  6. ממוצע המוטות של משכפל טכניים, קרי, סעיף משכפל השימוש ברקמה מן אותה חיה.
  7. השתמש העקומה סטנדרטי כדי להמיר מוטות ליחידות של איגוד radioligand, כלומר., nCi/mg רקמות מקבילות (TE).
    הערה: TE המונח משמש כי הסטנדרטים נוצרים עם חומרים להדמיית רקמת.
  8. לבטא הכריכה על ידי המרה של nCi/mg nmol/mg טה בהתאם לפעילות ספציפית radioligand (משוואה 1).
    Equation(1)
  9. כדי לקבל ערכים ספציפיים מחייב, להחסיר שאינם ספציפיים איגוד מ מחייב הכולל.
  10. משכפל הכריכה של כל שכפול ביולוגי באמצעות הממוצע של הצד הטכני הממוצע של כל בעל חיים (להשיג ב- 5.6 שלב).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התפלגות האנטומי של האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה באמצעות פרוטוקול המתואר, היה דמיינו את אנלוגי אסיד radiolabelled [3H] HOCPCA במוח העכבר, אשר נקטעה למקטעים הילתית, הווריד, אופקי (איור 3 ). רמות גבוהות של איגוד נצפתה היפוקמפוס, קליפת המוח, איגוד נמוך ב סטריאטום ואיגוד לא זוהה המוח הקטן, המתאים ביטוי דיווח קודמות, דפוסי זיקה גבוהה אסיד אתרי9,10, 11,12. כפי שמוצג להלן, מבנים אנטומיים עשוי להיות visualized באמצעות מטוסים שונים אופטים, שלמות אנטומי תיתמך על ידי צביעת cresyl סגול. לאתרי גבוהה-זיקה מחייבת אסיד, במיוחד באזורים עם איגוד radioligand נמוך, כגון המוח הקטן, מאושרות עם צביעת עוקבות של הרקמה (איור 3). סעיפים הילתית מצויים לרוב ספרות9,10. הם מעשי למטרות כמותיים כמו סכום גבוה יותר של מקטעים ניתנים להשגה מוח אחד. הווריד והחלק אופקית יש את היתרון של להמחיש איגוד למרבית חלקי המוח מכרסמים בתוך מקטע אחד ובכך לספק סקירה מעולה. איור 4מדגימה שימור האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה במוח של יונקים אבולוציונית. [3H] אתרי קישור HOCPCA אותרו עכבר, חולדה באותה מידה כמו חזיר רקמת המוח המאפשר השוואה של המוח דוחה אנטומית בין המינים. באופן כללי, שימור אבולוציונית ולימודי ההפצה האזוריים עשויים לסייע באופן משמעותי האפיון של חלבון של עניין, במקרה זה מטרה הרומן, ובכך ייתן אינדיקציות שלו תפקיד פיזיולוגי19.

האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה היו שנבדק עם radioligands אסיד, המציגים הזיקות שונים עבור אתרי קישור אך דומות פעילויות ספציפיות (איור 5). [3H] HOCPCA היה בעבר הראו שישד K של 74 nM, אשר עדיפה radioligand זמינים מסחרית [3H] רכיבי NC-382 עם Kd של 697 nM, שניהם נקבע ב- pH 6.0 מאת כמותית autoradiography9. לפיכך, [3H] HOCPCA ניחן הרבה רגישות גבוהה יותר, שמוביל יחס אות לרעש מעולה. עקב הרגישות הנמוכה של radioligand גבוהה יותר, רכיבי NC-382 [3H] ריכוזי צריך לשמש כדי להשיג רמות דומות של איגוד (להשוות y-axes באיור5). בהשוואה [3H] GHB גם ריכוז גבוה של radioligand (30 ננומטר) הנדרשת להשיג רמות דומות מחייב. זאת בעיקר בשל בזיקה נמוך משמעותית (Kאני של 4.5 מיקרומטר) של radioligand20. עם זאת, ריכוז גבוה יותר של radioligand גם מעלה את רמת של איגוד שאינם ספציפיים9,10 עם יחס אות לרעש התחתון כתוצאה מכך. זו סדרה של ניסויים מדגיש את החשיבות של הצורך של radioligand גבוהה-זיקה להפקת תמונות באיכות גבוהה.

מכיוון האתרים אסיד גבוה-זיקה באים לידי ביטוי לרמות כל כך גבוה באזורים הקדמי (60 pmol/מ ג17), קביעת פרמטרים תרופתי על ידי עקומות רוויה היא קשה מיסודו באמצעות הדמיה פוספור רגיש טריטיום סטנדרטי צלחות בשל הסכנה של תמונות רווי. לכן, Kd ערכים עבור [3H] HOCPCA [3H] רכיבי NC-382 הושגו בערכים הראשון הקובע Kאני התקה הומולוגית עקומות, ולאחר מכן חישוב של Kd (איור 6)9. עבור רוב radioligands, יהיה חלופה לשימוש איזוטופ-דילול באופן שגרתי זאת על מבחני הכריכה homogenate. יתר על כן, נקבע ערכיםד K-ערכי pH שונים. אין ספק, האתרים אסיד גבוה-זיקה באופן היעיל ביותר מצורפים לסחורות המסומנות ב- pH 6.0 (6A איור , איור 6D), מאז שינוי assay לתנאים pH 7.4 באופן משמעותי להשפיע על זיקה ליגנד. לפיכך, Kd עבור [3H] HOCPCA ב- pH 7.4 הוא כ – 30 פעמים גבוה מספרית מזה ב- pH 6.0. הגדלת ה-pH יותר התוצאה היא רמה גבוהה יותר של איגוד שאינם ספציפיים, אשר הופכת אזהרה בעת שימוש [3H] רכיבי NC-382 היכן ניתן להשיג רק כמויות נמוכות של איגוד מסוים ב- pH 7.4 (איור 6E). זה למעשה מעכבת קביעת פרמטרים תרופתי באמצעות radioligand הזה ב pH פיזיולוגיים9, שוב הממחישות את הכוח שיש radioligand עם כמו זיקה גבוהה ככל האפשר.

Figure 1
איור 1: מבנה של radioligands מיקוד האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ene חומצה קרבוקסילית ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, ר') - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-הידרוקסי-H5 - benzocyclohept-6-ylidene חומצה אצטית (רכיבי NC-382) ([3H] רכיבי NC-382)15 חומצה γ-hydroxybutyric [3H] ([3H] אסיד)16 tritiated radioligands עם פעילות ספציפית דומות (20-40 mmol/Ci), כמו גם [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125אני] BnOPh-GHB)13 עם פעילות טוחנת המשוערת של 2000 Ci/mmol21. היסוד המבני אסיד מסומן באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סקירה סכמטי של הפרוטוקול של autoradiography במבחנה . (1) בעל החיים הוא מורדמים, רקמות הוא גזור, הצמד קפוא בקרח יבש. רקמות ואז הוא למחלקה על cryostat, הפשרה רכוב על גבי שקופיות מיקרוסקופ, (2) סעיפים מודגרת עם radioligand עד מחייב שיווי משקל. לקביעת מחייב שאינם ספציפיים, פתרונות הם השלימו עם displacer unlabelled של מבנה כימי קשורים אך אינם זהים. (3) לאחר מכן, radioligand לא מאוגד יוסר על ידי שטיפה במאגר assay והם מלחי מופרשים על ידי שטיפה עם מזוקקים H2O. כאשר חלקים יבשים, paraformaldehyde (PFA) קיבוע מבוצע להקים לצמיתות את האינטראקציה ליגנד-חלבון. חלקים חשופים ואז פוספור הדמיה צלחות. (4) אחרי מספיק זמן חשיפה, צלחות נסרקים להשיג autoradiograms דיגיטלי. (5) בסופו של דבר, ניתוח תמונות מתבצעת באמצעות הגדרות של אזורים מעניינים (ROIs), האיגוד הוא לכמת. בדוגמה המוצגת, צפיפות אופטית (נחמד) מומחשים מקטעים של העכבר קליפה (משמאל), ההיפוקמפוס (באמצע). כימות נעשית על ידי חשיפת המקטעים יחד עם [3H] microscale (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: autoradiograms נציג איגוד HOCPCA ננומטר [3H] 1 העכבר של המוח מקטעים. Radioligand (א) מחייב את העטרה, רקמות הסאגיטלי ואופקיים מקטעים כדי להמחיש את חשיבות חלוקתה מטוס בניראות של מבנים אנטומיים. (B) Cresyl סגול מכתים סעיפים הרקמה המתאימה כדי לוודא אזורים אנטומיים, במיוחד באזורים נמוכים/נעדרים מחייב radioligand. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: autoradiograms נציג של איגוד HOCPCA ננומטר [3H] 1 מינים שונים. השוואה של עכברוש (א), (B) העכבר (C) חזיר במבחנה autoradiograms כדי להמחיש אבולוציונית שימור איגוד אתרים ואזורים בקליפת המוח בהיפוקמפוס יחד עם המוח דוחה אנטומיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: כימות של איגוד לאתרים איגוד אסיד גבוה-זיקה עם רגישות שונה אסיד radioligands על ידי במבחנה autoradiography במוח פרוסות מן העכבר קליפת ההיפוקמפוס. מחייב הכולל המדווח fmol/mg חלופי רקמות (TE) radioligands (א) [3H] HOCPCA (1 ננומטר) ו- (B) [3H] רכיבי NC-382 (7 ננומטר) ו- GHB (C) [3H] (30 ננומטר) (דומה לפעילות ספציפית). איגוד שאינו ספציפי לא זוהה בנוכחות 1 מ"מ אסיד או 1 מ HOCPCA עבור כל אחד radioligands (לא מוצג). הנתונים מוצגים אומר ± SD של ארבעה משכפל ביולוגי שאחד הופיעה משכפל טכני 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: התוצאות נציג של קביעת autoradiographic Kd ו- B ערכימקסימום מאת הומולוגי תחרותי תזוזה של [3H] HOCPCA [3H] רכיבי NC-382 בסעיפים קורטיקלית העכבר ב pH 6.0 ו- pH 7.4 על מנת להדגים את השפעת pH על זיקתו של radioligands. (Kd ו- Bמקס חושבו שימוש באותו המתחם radioligand מתחרה, באמצעות קביעה ראשונית של Kאני מעריכה22). Autoradiograms (א) עם יחס אות לרעש אופטימלית עבור איגוד HOCPCA ננומטר [3H] 1 ב- pH 6.0. (B) שינוי pH המאגר ל- 7.4 דורש ריכוז גבוה יותר של HOCPCA [3H] (8 nM) להגיע לרמות איגוד משמעותית. עקומות כריכת יומן-ריכוז Resulting (ג); זאת אומרת ± ב- SEM (D) 5 מחייב רכיבי NC-382 nM [3H] ב- pH 6.0 תוצאות באיגוד שאינם ספציפיים נמוכה, ואילו (E) 40 ננומטר [3H] רכיבי NC-382 אינה מספיקה להשיג מחייב ב- pH 7.4. עקומות כריכת יומן-ריכוז Resulting (F); זאת אומרת ± נתונים ב- SEM היה מתקבל מ- 3-4 ביולוגי משכפל שאחד הופיעה ב- 3-5 משכפל טכני, רק [3H] רכיבי NC-382 ניסויים ב- pH 7.4 בוצעו עם משכפל הביולוגי רק 2. עבור שני radioligands, 1 מ"מ שאסיד שימש מצפני מחייב שאינם ספציפיים. לקבלת פרטים אודות ניתוח וחישוב של Kd ו- Bמקס, ראה9. איור זה הותאם ו הדפסת הפרסום הקודם9 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איכות autoradiographic assay נקבעת בדרך כלל לפי הרגישות של radioligand. גורם תורם מרכזי הוא radioisotope הנבחר, אשר ניתנת על-ידי הזמינות של ליגנדים ידוע או את הכדאיות של טכניקות ספציפיות labelling להניב ליגנדים עם פעילות ספציפית המתאימה (קרי, את כמות הרדיואקטיביות לכל יחידת השומה של radioligand)23, עם כמות מוגבלת של השפלה כימי. מספר גדול של radioligands של ליגנדים ידוע מלווים בלוחיות טריטיום9,10,24,25,26, אשר מסיק מספר יתרונות. ראשית, טריטיום (3H) מאופיין זמן מחצית חיים (12.43 שנים) קידום אחסון לטווח ארוך של אצוות בודדים. שנית, האינטראקציה ליגנד-יעד לא מעוותת על ידי רדיונוקלידים כמו 3H-ליגנדים ביולוגית להבחין מגניחותיה תרכובות האב שלהם טריטיום פולט אנרגיה נמוכה β–-חלקיקים, אשר נוסע רק למרחקים קצרים ברקמת וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית גבוהה ומבנים, לאחר מכן, הבדל גדול בין אנטומי4. למרות זאת, טריטיום labelling יכול רק להיות מיוצר להניב תשואה גבוה פעילויות ספציפיות. זה בשל העובדה כי זמינות 3H-מקורות מזוהמים עם מימן לא רדיואקטיבי. באופן כללי, גבוה יותר לפעילות ספציפית, radioligand פחות צורך להניב זיהוי רגיש23. יתר על כן, זה יש לקחת בחשבון את 3H-ליגנדים יש את האפשרות לעבור חילופי מימן עם המים בהתאם היציבות של 3H-תווית. כדי לפצות על ביטוי נמוך או פעילות ספציפית נמוכה מדי, יוד-125 יכול לשמש רדיונוקלידים13. פעילות ספציפית מקסימלי של יוד-125 הוא כ 100-fold גבוה יותר מזה של טריטיום. עם זאת, מספר שיקולים נוספים יש לבצע בעת עבודה עם יוד-125. למשל, התוספת של יוד-125 גורם בדרך כלל שינויים מבניים המולקולה אשר עשוי להשפיע את האינטראקציות ליגנד-יעד. כמו יוד-125 יש תוחלת חיים של 60 ימים, יש לשקול תיקון עבור דעיכה יומי עבור פעילות ספציפית, כימות של ליגנד-יעד אינטראקציות23. 125 ליגנדים פולטים γ-פוטונים, למרות הרבה רגישות גבוהה יותר, להפיק תמונות ברזולוציה נמוכה יותר. זאת בשל היחס ההפוך בין הרזולוציה ואת האנרגיה המרבי של האיזוטופ (כמפורט להלן). לבסוף, לעומת טריטיום, מוגברת להקפיד בעת טיפול יוד-125 בשל האנרגיה גבוהה יותר של רדיונוקלידים.

בהתאם ה נוקליד, עובי בסעיף רקמות עשויים להשפיע רזולוציה. Β אנרגיה נמוכה–-הקרינה של טריטיום מגביל להגיע רקמות שלו כ 5 מיקרומטר עקב לדין. כתוצאה מכך, כימות לא מושפע עובי רקמת כאשר העובי סעיף עולה 5 מיקרומטר27,28. לעומת זאת, רדיואקטיביות של איזוטופים אנרגיה גבוהה יש חדירה רקמות גדולה יותר, וכתוצאה מכך תמונה ברזולוציה נמוכה יותר בגלל ליגנדים למרחק גדול, למדיום זיהוי לתרום גם היווצרות התמונה. כתוצאה מכך, סעיפים דק יותר לקדם ברזולוציה גבוהה יותר עבור אנרגיה גבוהה radionuclides1.

הקמת פרוטוקול autoradiographic דורש ידע של תנאי מחייב אופטימלית (למשל, מאגר, pH, טמפרטורה) והפרמטרים תרופתי של radioligand מבחינת זיקה וקינטיקה. אם לא מלווה את radioligand לפני, מחקרי גישוש הם הצורך29. בחירת ריכוז של האופטימלית radioligand מודרך הן על ידי בזיקה של radioligand ואת איגוד אתרי השפע. בדרך כלל, ריכוז המשקף K 5 - 6 פעמיםd משמש כדי לוודא כי כל האתרים מחייב הן רוויות30. גישה אחרת שואפת תשואות היחס הגבוה של סך-כדי-לא ספציפית מחייבת על-ידי בחירה radioligand ריכוזים מתחתדK31 ושמירת פתרון radioligand באותו הזמן. גישה זו שימושית במיוחד כאשר האתר מחייב הוא מאוד שופע בתוך הרקמה שנבדקו מאז ריכוזים גבוהים radioligand להגדיל את הסיכוי של oversaturating autoradiograms, וגם את HOCPCA מקרה עבור [3H] מהאסיד גבוהה-זיקה איגוד אתרי9. יתר על כן, על מנת ביעילות תווית על כל האוכלוסייה של החלבון יישוב, radioligand צריכה באופן אידיאלי לאגד שכל הייצורים החיים מטרה אפשרית. בפרט קולטן autoradiography, השימוש של אגוניסטים עלול רק לגלות מספר חלקי של קולטנים סה כ מאז כמה יכול להיות נוכח הברית נמוך-זיקה אגוניסט. לעומת זאת, היריבים ניטראלי מציגים לרוב אהדה כלפי כל קולטן הברית26,29.

יתר על כן, איגוד ניסויים מבוצעים בדרך כלל בתנאים מחייב שיווי משקל. לכן, הזמן הנדרש כדי להגיע שיווי משקל מחייב בתנאים ניסיוני הרצוי (ריכוז קבוע radioligand, מאגר וטמפרטורה) צריך להיות נחוש בניסויים האגודה כדי להבטיח שיווי משקל מחייב בתוך הטווח של ניסוי4,23,30. לאחר דגירה radioligand, radioligand לא מאוגד הוא נשטף על ידי מספר incubations באמצעות מאגר assay ואחריו בדרך כלל שטיפה מזוקקים H2O. אות לרעש יחסי ניתן למטב על-ידי התאמת טמפרטורה וזמן בהתאם דיסוציאציה קצב radioligand26,30,31.

Radioligands עשוי להציג קשירה לחומרים הלא-ביולוגיים, קרי, מחייב שאינם ספציפיים. Radioligand מחייב מרכיבי התא מלבד המטרה מוגדר איגוד לא ספציפי. התרומה של איגוד לא ספציפי כדי הסכום הכולל של איגוד radioligand שקובעת בנוכחות ליגנד unlabelled מתחרים שמכוונת באותו אתר איגוד כמו radioligand. המתחם שאינו רדיואקטיבי (displacer) מסופק עודף 10,000-fold, שנכבש באתר איגוד, radioligand יכולה רק לאגד את-יעד אתרי26,31,32. ויותר חשוב, המתחם unlabelled צריך להיות של מבנה כימי שונה מאשר radioligand מאז שילוב זה מפחית את הסיכון של איגוד ספציפי, כמו גם שאינם ספציפיים23ועקרו מבתיהם. איגוד שאינן ספציפיות הנובעות איגוד לממברנות יכול להיות בעיה גדולה במיוחד במקרה של radioligands lipophilic למדי. במקרים מסוימים, נהלים כביסה נרחב עשויים להסיר את קולטן בלתי מאוגד radioligand וכך לשפר הספציפית איגוד יחסי29.

בעת בחירת מאגר assay, חשוב לקחת בחשבון את ההשפעה של כוח יונית ו- pH על האינטראקציה ליגנד-יעד. במיוחד אלקטרוסטאטיות בין קוטב ליגנדים הידרופילית רכיבי האיגוד אתרים מושפעים כוח יונית של המאגר. לכן, תוספי עם יונים monovalent או כלט עשוי להשפיע יעיל זיקה מתמדת23,33. אם הרכב המאגר אופטימלית עבור האינטראקציה ליגנד למדה-יעד אינו ידוע, בופרים הנפוצים שונים לבחון בניסויים פיילוט. מאגרים עשויים גם להיות בתוספת נוגדי חמצון כגון חומצה אסקורבית, מעכבי של משפיל אנזימים29,34. יתר על כן, יינון של קבוצות ספציפיות בתוך האתר מחייב או על ליגנד עצמו מושפע pH ויש לו השפעות קריטיות את קבוע שיווי משקל מחייב, קצב קינטי קבועים שאינם ספציפיים איגוד23,33. לדוגמה, חיטוט מהאסיד גבוהה-זיקה מחייב אתר עם radioligands אסיד שונים יפה ממחיש את החשיבות של ה-pH על יעד זה מחייב (איור 6). אפיון רמת ה-pH האופטימלי עבור האינטראקציה קולטן ליגנד עשוי גם לתת רמזים על החשיבות של המטרה ביחס להתאמתו ביולוגי.

גורם קריטי נוסף autoradiography דיגיטלי הוא את זמן החשיפה, כלומר, הזמן הנדרש כדי להשיג לכימות autoradiograms על ידי חשיפת הסעיפים radiolabelled רקמות כדי פוספור הדמיה צלחות. אומדנים מבוססים על כמות רדיואקטיביות המדגם, אנרגיה, זמן מחצית החיים של האיזוטופ, כמו גם את יחס אות לרעש הרצוי. בפרט, ממושך תוצאות זמן חשיפה רקע אותות ותמונות רוויים. רקע מוגברות האות יכול להיות מופחת על-ידי אחסון קלטות בתוך הצינור מוגן עופרת סביבות כדי למנוע קרינה קוסמית1,4. יחד עם זאת, אם autoradiograms שיוצרת מושגות, הדגימה ניתן לחשוף מספר פעמים, ובלבד המתחם ליגנד-יעד קבוע ומאפשר half-life של רדיונוקלידים זה.

פוספור הדמיה צלחות הניתנים לשימוש חוזר, יש תוחלת חיים ארוכה כאשר מטופל כראוי, דהיינו, כיפוף להימנע ויש הצלחות לאחסנו בסביבה יבשה. הטיפול פוספור הדמיה צלחות מונחה על ידי את רגישותם לקרינה קוסמית ובהירים. לכן, חשוב למחוק את הצלחת לפני כל שימוש כדי למזער רקע אות. חשיפה של מקטעי רקמת radiolabelled הלוחות ההדמיה נעשית ממוגן קרינה קלטות לחלוטין ללא אור. בעת העברת את הצלחת הסורק בסוף זמן החשיפה, כל תאורת יש גם להימנע ככל קצרות אפילו קשר עם אור לבן מפחית את האות שהצטברו. יתר על כן, כדאי לסרוק צלחות מיד לאחר הסרת הדגימה כדי למנוע דהייה אות. החיסרון של שימוש פוספור הדמיה צלחות היא המראה פוטנציאלי של חפצי אמנות, ממסר 'רפאים תמונות' לאחר שימוש חוזר ונשנה של צלחות1.

עבודה עם טריטיום דורש הדמיה צלחות ללא ציפוי מגן כדי לאפשר את קרינת אנרגיה נמוכה להגיע הקריסטלים זרחן. צלחות הדמיה פוספור טריטיום רגיש ולכן הם רגישים יותר זיהום או נזק שייגרם עקב טיפול לא נכון. ברגע מזוהמים, צלחות טריטיום רגיש אינו ניתן לניקוי ויש צורך להחליף. קיבוע של המתחם ליגנד-יעד עם כדורגלן קיטור מפחית זיהום פוטנציאליים של הצלחת, הארכת תוחלת החיים שלה. יתר על כן, התייבשות של רקמת מיד לאחר קיבוע היא שלב חיוני מאז צלחות רגיש טריטיום רגישים לחות. בשל עדינותה, רגיש טריטיום הצלחות אין להשתמש עבור אחרים איזוטופים1,4. לעומת זאת, הצלחות על איזוטופים אנרגיה גבוהה כגון יוד-125 עמידים יותר, פני השטח שלהם אפילו ניתן לנקות על ידי מנגב עם 70% אתנול.

באופן מסורתי, סרט רגיש שימש עבור ההקלטה המרחבי של דעיכה רדיואקטיבית. בעוד תמונות ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג, הסרט autoradiography יש מספר מגבלות. חוץ בצורך של כימיקלים מסוכנים. ו חושך לפיתוח, לסרטי רנטגן מאופיין על ידי טווח דינמי צר. לכן, ייתכן צורך לחשוף חלקים radiolabelled שוב ושוב עם פעמים חשיפה שונים על מנת להשיג תמונות שאינן רוויות לכימות35. יתר על כן, לסרטי רנטגן תערוכות רגישות מוגבלת וכתוצאה מכך פעמים חשיפה מתמשכת עבור הדגימה עם אנרגיה נמוכה איזוטופים, כלומר. טריטיום דעיכה עשויים לדרוש מספר חודשים של חשיפה. רגישות נמוכה בשילוב עם טווח קטן ליניארית הופך הטכניקה זמן רב מאוד, במיוחד כאשר תנאים אופטימליים assay צריך להיות נחוש הראשון1,35.

עם התפתחות פוספור הדמיה צלחות, מספר מגבלות אלה היו כשהיא ממוענת35,36,37. הלוחות הדמיה לשרת באופן זמני לאחסן תמונות של דעיכה רדיואקטיבית, המייצג את הסידור המרחבי של radioligand ב הדגימה רקמות. Photostimulable BaFBr:Eu2+ זרחן הקריסטלים משמשים כדי ללכוד את האנרגיה הרדיואקטיבית הנפלטת המדגם, כתוצאות קרינה (למשל, צילומי רנטגן, קרני גמא או וחלקיקי ביתא) אנרגיה גבוהה ב- עירור של האיחוד האירופי2+ האירופי3+ והשמנה הסוגר של האלקטרון שוחרר ב הזרחן סריג4,37. לחשוף את הצלחת הדמיה גלוי או אינפרא-אדום לאור היפוך התגובה, קרי, האלקטרון לכודה משתחררת, במהלך השינוי של האיחוד האירופי3+ האיחוד האירופי2+ נפלטת הפריה חוץ גופית. האור הנפלט הוא יחסי כמות הרדיואקטיביות ומאפשרת זיהוי שלו על ידי האופטיקה היצירה של autoradiogram דיגיטלי37. מערכת זו מספקת עלייה בתוך רגישות מלווה על ידי צמצום זמן החשיפה של חודש ימים3מסומן. בנוסף לכך, הטווח הדינמי ליניארי במידה ניכרת מתגברת, אשר מפחית את הסיכוי רווי תמונות. ליניאריות ניתנת בתוך ארבעה עד חמישה סדרי גודל ואת אומתה שוב ושוב3837,36,35,3,. למרות autoradiography הסרט עדיין מספקת רזולוציה מרחבית מעולה, המאמצים סריקה הטכנולוגיה הביא השיפור ברזולוציה של 300 25 מיקרומטר (גודל פיקסל), המאפשר את הבידול מפורט בין אזורים אנטומי3. בסך הכל, צלחות הדמיה זרחן הן להקל על הקניית של autoradiograms דיגיטליות הן בשל להגדיל את טווח ליניארי ורגישות. טכניקה פשוטה וזמן חשיפה מופחתת באופן משמעותי להוביל ירד זמן לניתוח נתונים ומאפשר תפוקה גבוהה יותר.

בהשוואה autoradiography, שימושי תרופתי פרמטרים כגון זיקה וצפיפות מאופיינים גם בדרך כלל על-ידי היישום של radioligands ב homogenate רקמות מחייב מבחני. בשיטה זו יש היתרון של הפקת תוצאות על ידי מדידת הנפלטים β דעיכה רדיואקטיבית עם גלאי גזים באופן יעיל2. מבוצע בגישה רב טוב, למשל, בצלחות microtiter 96-ובכן, כגון מבחני שימושיות להקרנה של ספריות של תרכובות ועבור מספר גדול יותר של יחסים תלויי-ריכוז. נוסף על כך, ניצוח רוויה ניתוח עם תוכנית התקנה זו לעתים קרובות יותר ריאלי בהשוואה autoradiography, אשר מציג סיכון של תמונות רווי עם ריכוזים גבוהים radioligand. עם זאת, ביצוע התקה הומולוגית של ריכוז קבוע radioligand נמוך עם ליגנדים שאינו רדיואקטיבי על מנת לקבל Kd ו- Bמקס עוקף את הבעיה של רווי תמונות (איור 6)22. איגוד Homogenate ו- autoradiography מייצרים הערכות דומות עבור ליגנד זיקה קבועים ואילו צפיפות רקמת החלבון עניין יכול לזלזל באיגוד homogenate. לפיכך, שהוא הוצע כי הפרעה קרום התא בו-זמני עם רקמת homogenisation עלול לגרום לאובדן קולטן או שינו מחייב תנאים3,33. יתר על כן, שגיאות רקמות לנתיחה עשוי לייצר homogenates מזוהם עם רקמות מאזורים סמוכים במוח. לשם השוואה, מחייב אפילו מורכבים דפוסים גרעינים קטנים הם מטמיעים דיפרנציאבילית בשל הרזולוציה האנטומי המרחבי ב3,autoradiography33.

אימונוהיסטוכימיה גם מדמיין את ההתפלגות של חלבון עניין מבחינה אנטומית. השיטה זו מסוגל להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה אנטומיים, כפי ניתן לזהות מרכיבי רקמת דיסקרטית ברמה התאית, אפילו subcellular רמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. רמות הביטוי הם העריכו בהתבסס על עוצמת ההכתמה. למרות זאת, כימות מוחלטת של רמות הביטוי קשה עקב חוסר ההתייחסות המתאימה סטנדרטים39. יתר על כן, אימונוהיסטוכימיה תלויה בזמינות של נוגדן סלקטיבית, לאמת היטב אשר לעיתים קרובות בעיה במחקר קולטן.

לפני שמחליטים על ביצוע במבחנה autoradiography, מספר שיקולים צריך להתבצע. קודם כל, פוסט-מורטם רקמות הכנה כולל חלוקתה וכן חוזרים ונשנים הקפאה והפשרה של עשויים להשפיע על השימור של איגוד אתרים2. יתר על כן, השיטה תלויה בזמינות של radioligand נאותים, אשר מציג את זיקה גבוהה ואת סלקטיביות עבור היעד שאלה2. Radioligand לא אמורה להציג מחייב משמעותי אתרים את המטרה, זה צריך גם להוכיח פרופיל קינטי חיובית. זה נחוץ, כי המתחם ליגנד-יעד חייב להישאר ללא פגע במהלך הטווח של הניסוי. יתר על כן, כאשר קיימות תרכובות שאינו רדיואקטיבי מתאימים, כניסתה של רדיונוקלידים עלולה להיות גורם קריטי. לפיכך, מולקולת עניין צריך להיות מצויד קבוצות פונקציונליות מתאימה עבור radiolabelling יעיל, אשר מאפשר ייצור של radioligands עם פעילות ספציפית מספיק גבוה, לשחיקה40. חיסרון נוסף של autoradiography במבחנה הוא השיטה מאפשרת רק השימוש של חיים פעם אחת. עוד הוא באלגנטיות ההרחבה ויוו הדמיה שיטות כגון מיקום פליטת פוזיטרונים (PET), אשר מאפשר סריקה חוזרת ונשנית של החיה ונחישות באותו תפוסת ומאפייני איגוד דינמי. חיית המחמד הוא יקר במיוחד עבור המחקר של יונקים גבוהה יותר41 , אופטימיזציה מנה במחקרים קליניים 42,43,44.

מספר שינויים של הטכניקה autoradiographic להרחיב את תחולת הן מבחינת אפיון תרופתי מטרות הברית בריאים וחולים, כמו גם גילוי תרופות ופיתוח. קודם כל, התפתחויות אחרונות הדמיה הטכנולוגיה הובילו להתפתחות של autoradiography בזמן אמת. גלאי גזים של α/β-חלקיקים ולייתר את ההדמיה צלחות או סרט על ידי מדידה ישירה של disintegrations, ובכך לייצר autoradiograms דיגיטליים מהירים45.

יתר על כן, במבחנה autoradiography מאפשרת לימודי מהפונקציונליות של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) על מידע לגבי פריסתם אנטומי ברקמות פוסט-מורטם. וריאנט זה של השיטה כרוך דגירה של מקטעי רקמת עם אנלוגי עם תוויות ברורות radioactively של guanosine טריפוספט (GTP), קרי, 35S] guanosine 5'-γ-thiotriphosphate (35S] GTPγS), ביחד עם אגוניסט רדיואקטיבי של GPCR. מתי אגוניסט נקשר וזה מעורר תגובה GPCR, שילוב של35S] יכול להיות מקומי, לכמת באמצעות autoradiography, אשר משקף רק את קולטן מופעל האוכלוסייה2,46,47 GTPγS .

Ex-vivo autoradiography מייצג גירסה אחרת של הטכניקה, הבודק הכריכה האזורי של radioligand לאחר שהממשל-חיים ניסיוני. בעקבות הקרבת החיה, cryosectioning רקמת המדובר, ולהוביל חשיפה autoradiographic autoradiograms אשר משקפים את radioligand מחייב ויוו2. Ex-vivo autoradiography הוא מועסק בדרך כלל תוך גילוי סמים ותוכניות פיתוח על מנת לקבל מידע על הפרופיל פרמוקוקינטיים של עופרת במתחם, קרי, הספיגה שלה, הפצה, חילוף החומרים, הפרשה (גלית נחמני) . במיוחד לכל הגוף autoradiography מספק תובנות לגבי הפצת סמים כדי כל איברים ורקמות. עם זאת, קביעת שאינם ספציפיים מחייבים, כימות היא קשה יותר בהשוואה במבחנה autoradiography בשל חילוף החומרים אפשרי והשפלות של radioligand, אין אמצעים ועקצה לא מאוגדים ליגנד48.

Autoradiography משמשת גם בדיקות מקדימות ואפיון של חיית המחמד ליגנדים4. Radionuclides אנרגיה גבוהה פחמן-11 ופלואור-18 משמשים לעתים קרובות ליגנדים חיית המחמד. חיית המחמד הוא יישום בולט, לא פולשנית עבור radioligands כי לכימות תמונות 3D של radioligand האיגוד בחיים ניתן להשיג40,11,49.

במבחנה autoradiography באמצעות פוספור הדמיה צלחות מייצג שיטה assay יקר עבור אפיון ליגנד-יעד אינטראקציות תרופתי. השיטה מניבה תוצאות לשחזור על ידי העבודה של פרוטוקול פשוט ומהיר יחסית ברגע תנאים אופטימליים assay הוקמו. נקבעת חלוקת האנטומי של חלבון עניין בתוך שלו microenvironment מקורי, אשר מאפשר חקר תפקידה פיזיולוגיים, תרופתי, פתולוגיים ברקמה בריאים וחולים פוסט-מורטם של חיות ניסוי כמו גם 2,בני47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי קרן לונדבק (גרנט R133-A12270) ושל קרן נורדיסק Novo (גרנט NNF0C0028664). המחברים מודים ד ר עופר בר מארק על אספקת radioligand [3H].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

מדעי המוח גיליון 145 Radioligand רדיואקטיבי autoradiography אהדה ביטוי פוספור הדמיה HOCPCA וγ-hydroxybutyric חומצה GHB רכיבי NC-382 כמותיים פרמקולוגיה
Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter