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Neuroscience

स्वरांकन चित्रण और औषधीय लक्ष्यों के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और शक्तिशाली विधि के रूप में

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

स्वतः आदिचित्रण की विधि का प्रयोग नियमित रूप से गुणात्मक या मात्रात्मक भेषजगुण के निर्धारण के लिए रेडियोलीगन्स के ऊतक वर्गों के लिए बाध्यकारी अध्ययन के लिए किया जाता है ।

Abstract

इन विट्रो स्वरलिपि का उद्देश्य प्रयोगात्मक पशुओं के साथ-साथ मनुष्यों से ऊतक में रुचि के एक प्रोटीन के संरचनात्मक वितरण की कल्पना करना है । विधि अपने जैविक लक्ष्य के लिए एक रेडियोलिगंड के विशिष्ट बंधन पर आधारित है । इसलिए, जमे हुए ऊतक वर्गों radioligand समाधान के साथ incubated हैं, और बाद में लक्ष्य के लिए बाध्यकारी रेडियोधर्मी क्षय का पता लगाने के द्वारा स्थानीयकृत है, उदाहरण के लिए, सहज फिल्म या भास्वर इमेजिंग प्लेटों का उपयोग करके. परिणामस्वरूप डिजिटल स्वतः adiograms उल्लेखनीय स्थानिक संकल्प है, जो परिमाणन और रेडियोलीजिंड के स्थानीयकरण अलग संरचनात्मक संरचनाओं में बाध्यकारी सक्षम बनाता है प्रदर्शन । इसके अलावा, परिमाणन वियोजन स्थिरांक (kd), निषेध स्थिरांक (ki) और साथ ही चयनित ऊतकों में बाइंडिंग साइटों (Bmax) के घनत्व के माध्यम से संलग्नी अपनत्व के औषधीय लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, विधि दोनों लक्ष्य स्थानीयकरण और संलग्नी चयनीयता के बारे में जानकारी प्रदान करता है । यहां, तकनीक उच्च संबध γ-hydroxybutyric एसिड (ghb) स्तनधारी मस्तिष्क ऊतक में बाध्यकारी साइटों की स्वतः आदिलेखी लक्षण वर्णन के साथ उदाहरण है, methodological बाध्यकारी परख के बारे में विचार पर विशेष जोर के साथ पैरामीटर्स, रेडियोलिगंड और डिटेक्शन विधि का चयन ।

Introduction

स्वत आदिचित्रण एक विधि है जो रेडियोधर्मी क्षय की छवियों को प्रदान करता है । तकनीक नियमित रूप से एक रेडियोलॉजिकल यौगिक और इसके लक्ष्य के बीच एक विशिष्ट औषधीय संपर्क के आधार पर विट्रो में ब्याज की एक प्रोटीन के ऊतक वितरण का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह लक्ष्य के लिए लिगल की चयनीयता के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करता है । इन विट्रो स्वतः आदिचित्रण का उपयोग रेडियोलीगन्स के औषधीय बाध्यकारी मापदंडों के मात्रात्मक निर्धारण के लिए भी किया जा सकता है, जैसे वियोजन स्थिरांक (Kd) और बाइंडिंग साइटों का घनत्व (Bmax), साथ ही निर्धारित करने के लिए निषेध स्थिरांक (Ki) प्रतिस्पर्धा लिगंडस1,2. पारंपरिक homogenate रेडियोलिगंड बंधन की तुलना में, स्वत आदिचित्रण के लिए स्थानिक शरीर रचना विज्ञान कल्पना और क्षेत्रीय अभिव्यक्ति3पैटर्न के संक्षिप्त विवरण देने में सक्षम होने का फायदा है । स्वतः आदिचित्रण की विधि इसलिए immunocytochemistry के लिए एक प्रासंगिक विकल्प है, विशेष रूप से एक मान्य एंटीबॉडी के अभाव में. स्वत आदिचित्रण आसानी से एक मानक रेडियोआइसोटोप प्रयोगशाला में आवश्यक औषधीय विशिष्टता, ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए एक माइक्रोटोम cryostat करने के लिए उपयोग, और एक उपयुक्त इमेजिंग के साथ एक उपयुक्त रेडियोलिगंड की उपलब्धता को देखते हुए कार्यान्वित किया जाता है डिवाइस है कि संबंधित ऊतक वर्गों में रेडियोधर्मिता के वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम है. विशेष रूप से, रेडियोलिगंड के लिए एक महत्वपूर्ण चयन मापदंड गैर-लक्षित साइटों के लिए बाध्यकारी की एक सीमित मात्रा है । यह अन्य प्रोटीन, झिल्ली या सामग्री जैसे प्लास्टिक या फिल्टर के लिए हो सकता है, और सामूहिक रूप से गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के रूप में संदर्भित किया जाता है । आमतौर पर, गैर विशिष्ट बाध्यकारी गैर है, लेकिन संतृप्त किया जा सकता है अगर यह एक विशिष्ट बंद लक्ष्य प्रोटीन शामिल है । सही विशिष्ट बाध्यकारी मान्य करने का सबसे अच्छा तरीका है लक्ष्य की कमी ऊतकों की तुलना करने के लिए है, उदा, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर (नॉक आउट) ऊतक4.

यहां, इस पद्धति को स्तनधारी मस्तिष्क में γ-हाइड्रोक्सीब्यूटिरिक एसिड (ghb) के लिए उच्च-संबध बाइंडिंग साइट के ऑटोराडियोग्राफिक लक्षण वर्णन के साथ सचित्र है । ghb और उसके बाध्यकारी साइट के बीच औषधीय बातचीत को समझना ghb के रूप में प्रासंगिकता का है दोनों narcolepsy और शराब5के उपचार में एक चिकित्सकीय उपयोगी दवा है, लेकिन यह भी स्तनधारी मस्तिष्क का एक प्राकृतिक घटक और एक मनोरंजक औषध६. उच्च बंधुत्व ghb बाध्यकारी साइटों पहले [3ज] का उपयोग कर वर्णित किया गया ghb चूहा मस्तिष्क के लिए बाध्यकारी7homogenate । पिछले कुछ वर्षों में, [3ज] ghb और एनालॉग [3एच] ncs-३८२ के साथ आगे स्वतः आदिचित्रण अध्ययन चूहा8,9,10, माउस9 के अग्र मस्तिष्क क्षेत्रों में बाध्यकारी साइटों की एक उच्च घनत्व से पता चला है , सुअर11और बंदर/ हालांकि, आणविक पहचान और इन बाध्यकारी साइटों की सटीक कार्यात्मक प्रासंगिकता मायावी बनी हुई है ।

आगे बाध्यकारी साइटों की विशेषता के इरादे के साथ, और ghb की शारीरिक भूमिका पर अध्ययन की सुविधा के लिए, कई विभिंन बंधुता के साथ संपंन आइसोटोप शामिल रेडियोलीगन्स विकसित किया गया है ([3ज] ghb, [3 h] ncs-३८२, [3h] हॉपीसीए और [१२५I] bnoph-ghb)13,14,15,16(17में समीक्षित) (चित्रा 1) । चयनात्मक उच्च-अपनत्व रेडियोलीगन्स के संयोजन और बाध्यकारी साइटों की एक बहुत ही उच्च ऊतक घनत्व भास्वर इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के उत्पादन के लिए अनुमति दी है9,11. एक स्वतः एडिग्राफिक प्रयोग और एक उदाहरण की स्थापना में व्यावहारिक अंक की रूपरेखा के साथ साथ विवरण उदाहरण के लिए, चर्चा अनुभाग मैं जोर देंगे) radionuclide के विकल्प, द्वितीय) परख शर्तों के विकल्प, और iii) फ़ॉस्फ़र का उपयोग एक्स-रे फिल्म बनाम इमेजिंग प्लेट्स । इस पत्र का समग्र लक्ष्य ऊतक वितरण और प्रोटीन लक्ष्यों के औषधीय विश्लेषण के बारे में सूचित करने के लिए ऑटोएडिग्राफी तकनीक पर तकनीकी, methodological और वैज्ञानिक विवरण प्रदान करना है ।

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Protocol

सभी पशु हैंडलिंग डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय से दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया था ।

नोट: प्रोटोकॉल यहां वर्णित ऊतक तैयारी को शामिल किया गया (यानी, माउस मस्तिष्क ऊतक), एक नई प्रयोगशाला में विधि स्थापित करने के लिए पर्याप्त विस्तार में विट्रो स्वत: अडियोग्राफिक परख में, फॉस्फर इमेजिंग प्लेटों के लिए जोखिम के रूप में अच्छी तरह से स्वरादियोग्राम (चित्रा 2) के बाद के घनत्व का विश्लेषण अलग संरचनात्मक संरचनाओं में स्थानीयकृत और बढ़ाता रेडियोलीऔर बाध्यकारी के उद्देश्य के साथ । हिस्टोलॉजिकल तुलना के लिए, क्रेसिल वायलेट धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है । इसके अलावा, गैर-विशिष्ट एक प्रतिस्पर्धी संलग्नी के साथ बाध्यकारी के दृढ़ संकल्प प्रोटोकॉल के भीतर शामिल है । kd, Bmax या kiका निर्धारण करने के बारे में विस्तृत विवरण के लिए, पिछला प्रकाशन4देखें ।

1. ऊतकों को क्रायोसेक्शनिंग द्वारा तैयार करना

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize और तुरंत कैंची और forceps का उपयोग कर मस्तिष्क को काटना । सीधे अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ऊतक क्षति से बचने के लिए ।
  2. स्नैप-पाउडर सूखी बर्फ, गैसीय सह2 या isopentane में डुबकी द्वारा ऊतक फ्रीज । सीधे-20 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट तापमान के साथ एक cryostat करने के लिए जमे हुए ऊतक हस्तांतरण । वैकल्पिक रूप से, प्रसंस्करण तक-८० डिग्री सेल्सियस पर ऊतक स्टोर.
    नोट: ऊतक क्षति को कम करने के लिए दोहराया गल/
  3. ऊतक टूट से बचने के लिए आगे की प्रक्रिया से पहले 20 मिनट के लिए cryostat में-20 डिग्री सेल्सियस के ऊतकों acclimate करते हैं ।
  4. cryostat के बाहर मध्यम embedding के साथ ऊतक धारक को कवर और जल्दी से वांछित अभिविन्यास में जमे हुए ऊतक नमूना जगह है, जबकि एम्बेडिंग मध्यम अभी भी तरल है. उदाहरण के लिए, माउस मस्तिष्क को अनुलंब रूप से सेरेबैलम पर रखें ताकि रोस्ट्रल कोरोनल वर्गों को प्राप्त कर सकें । ऊतक धारक को वापस cryostat में स्थानांतरित करें और सख्ती के लिए-10 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान के लिए embedding मध्यम बेनकाब ।
    नोट: नाजुक ऊतक नमूने बढ़ते करने से पहले ऊतक molds के भीतर मध्यम embedding में लेपित किया जाना चाहिए ।
  5. cryostat के माइक्रोटोम में ऊतक धारक की स्थिति । sloped वर्गों से बचने के लिए ऊतक के अभिविन्यास समायोजित करें.
  6. ऊतक में एक stereotaxic एटलस के मार्गदर्शन के साथ कट18 वांछित मोटाई के वर्गों (12 μm [3एच] लेबल ligands के लिए अनुशंसित). ध्यान से सीधा और छोटे आकार के एक ब्रश के साथ खंड प्रकट करना यदि आवश्यक हो और thaw-एक खुर्दबीन स्लाइड पर खंड माउंट । क्रमिक रूप से वांछित तकनीकी प्रतिकृति (उदाहरणके लिए, स्लाइड प्रति 4 वर्गों) के लिए ब्याज के क्षेत्र से वर्गों लीजिए ।
  7. स्लाइड्स पर अनुभागों को आगे से हैंडलिंग से पहले 1 h के लिए हवा-शुष्क करने की अनुमति दें ।
    नोट: स्लाइड बक्से के लिए जलशुष्कक सामग्री के अलावा नमी ऊतक वर्गों पर निर्माण को कम करता है । procotol यहां-८० डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बक्से में वर्गों लंबी अवधि के भंडारण के द्वारा रोका जा सकता है ।

2. इन विट्रो स्वतः आदिचित्रण

चेतावनी: रेडियोधर्मिता । स्थानीय विनियमों के अनुसार एक प्रमाणित प्रयोगशाला में कार्य करें । सुरक्षात्मक कपड़े पहनें । एक प्रमाणित कंपनी के लिए रेडियोधर्मी क्षय या आउटसोर्स के अनुसार निपटान करें ।

  1. कमरे के तापमान (आरटी) में कम से 30 मिनट के लिए वर्गों गल । प्रयोगात्मक शर्तों के साथ स्लाइड लेबल । एक पेंसिल का उपयोग करें क्योंकि स्लाइड बाद में धुंधला के दौरान इथेनॉल में नहाया जाएगा ।
  2. स्लाइड को प्लास्टिक ट्रे में क्षैतिज रूप से रखें ।
    नोट: प्लास्टिक ट्रे के भीतर एक ऊंचा मंच पर स्लाइड पोजिशनिंग उनके हैंडलिंग की सुविधा ।
  3. पूर्व ईंटो परख बफर में स्लाइड पर घुड़सवार के लिए प्रश्न में लक्ष्य समायोजित (ghb प्रोटोकॉल के लिए, ५० मिमी khpo4 बफर पीएच ६.० प्रयोग किया जाता है) को ध्यान से स्लाइड पर एक उचित मात्रा में लागू (७०० μl के लिए 3-4 कृंतक कोरोनल वर्गों) ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि हर अनुभाग पूरी तरह से तरल के साथ कवर किया जाता है ।
    1. एक ढक्कन के साथ प्लास्टिक ट्रे को कवर करने के क्रम में वाष्पीकरण से बचने के लिए और प्रासंगिक तापमान पर पूर्व सेते (ghb प्रोटोकॉल के लिए प्री-इंसेबेट के लिए आरटी में 30 मिनट) के तहत लगातार कोमल (20 rpm) एक थाली शेखर पर मिलाते हुए ।
    2. गैर के निर्धारण के लिए विशिष्ट बाध्यकारी, unlabelled यौगिक के प्रासंगिक एकाग्रता के साथ पूरक परख बफर (ghb प्रोटोकॉल, 1 मिमी ghb के लिए) ।
      नोट: पूर्व ऊष्मायन आवश्यक नहीं हो सकता है ।
  4. प्रत्येक स्लाइड से पूर्व-ऊष्मायन तरल को बंद करें और स्लाइड को वापस प्लास्टिक ट्रे में स्थानांतरित करें ।
  5. निर्जलीकरण से बचने के लिए, तुरंत रेडियोलीऔर वांछित शर्तों के तहत परख बफर में रेडियोलीऔर के प्रासंगिक एकाग्रता के साथ वर्गों सेते (ghb प्रोटोकॉल के लिए, 1 एनएम [3एच] हॉपीसीए आरटी पर 1 एच के लिए) के साथ पूरी तरह से वर्गों को कवर करके radioligand समाधान (७०० μl के लिए 3-4 कृंतक कोरोनल वर्गों) ।
    1. बंद ढक्कन के साथ प्लास्टिक ट्रे के झटकों के तहत लगातार कोमल (20 rpm) मिलाते हुए ।
      नोट: radioligand एकाग्रता एक तरल प्रस्फुरण काउंटर में एक aliquot गिनती द्वारा मान्य किया जा सकता है ।
  6. तरल से बहना और एक खुर्दबीन स्लाइड रैक में स्लाइड स्थानांतरण द्वारा ऊष्मायन समाधान निकालें । अनुभाग निर्जलीकरण से बचने के लिए तुरंत अगले चरण पर जाएं ।
  7. स्लाइड को धोएं । ghb प्रोटोकॉल के लिए, बर्फ के साथ धोने के लिए ठंड परख बफर दो बार 20 के लिए और फिर दो बार बर्फ के साथ भरा ट्रे में स्लाइड रैक सूई से कुल्ला-ठंड आसुत पानी लवण को दूर करने के लिए । हवा के लिए रैक में खड़ी स्लाइडों की स्थिति में 1 एच आरटी के लिए सुखाने या ठंड के तापमान के लिए एक धौंकनी सेट के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड सूखी ।
    नोट: धोने अनुकूलित किया जाना चाहिए, उदा, व्यापक धुलाई गैर-विशिष्ट बाध्यकारी कम करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  8. स्लाइड् स-लक्ष्य परिसर की अखंडता की रक्षा के लिए RT पर पीएफए वाष्प के साथ रातोंरात निर्धारण के लिए पैराफॉर्मालडिहाइड (पीएफए) पाउडर युक्त एक फिक्सीटर के लिए स्लाइड्स स्थानांतरित करें ।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है । धूआं हुड में positionthe फिक्केटर और pfa के साथ त्वचा/
  9. अगले दिन, एक desiccator बॉक्स के लिए स्लाइड स्थानांतरण आरटी पर 3 एच के लिए सिलिका जेल से युक्त नमी को खत्म करने के लिए ।

3. फॉस्फर इमेजिंग प्लेट्स और स्कैनिंग का एक्सपोजर

  1. एक विकिरण में वर्गों प्लेस-ऊपर का सामना करना पड़ ऊतक के साथ इमेजिंग प्लेट कैसेट परिरक्षित । रेडियोलीऔर बाइंडिंग के बाद परिमाणन के लिए, हर कैसेट में एक [3एच] माइक्रोस्केल शामिल करें । वर्गों बेतरतीब ढंग से व्यवस्था और एक ही कैसेट में प्रत्यक्ष तुलना के लिए वर्गों का पर्दाफाश ।
  2. भंडारण से संचित संकेतों को हटाने और पृष्ठभूमि संकेतों को खत्म करने के लिए उपयोग से पहले ट्राइटियम-सेंसिटिव फॉस्फर इमेजिंग प्लेट को तुरंत मिटा दें । इसलिए, फास्फ़र इमेजिंग मशीन में प्लेट लोड करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार यह दृश्यमान/अवरक्त प्रकाश को बेनकाब करें ।
  3. फॉस्फ़र इमेजिंग मशीन से प्लेट निकालें और तुरंत इसे कैसेट में अनुभागों पर रखें । सुनिश्चित करें कि कैसेट पूरी तरह से बंद कर दिया है । 3 दिनों के लिए भास्वर इमेजिंग प्लेट के लिए वर्गों बेनकाब प्रकाश से परिरक्षित ।
  4. क्योंकि प्रकाश इमेजिंग प्लेट से संकेत मिटाता है, ध्यान से अंधेरे में कैसेट खोलने के लिए और तुरंत एक भास्वर imager के अंधेरे बॉक्स में इमेजिंग प्लेट हस्तांतरण या एक अंधेरे कमरे में फॉस्फर imager जगह है ।
    नोट: विश्लेषण के दौरान डिजिटल छवि पर व्यक्तिगत नमूना की पहचान करने के क्रम में प्रदर्शन के दौरान स्लाइड के स्थानिक व्यवस्था notate करने के लिए सुनिश्चित करें. इसलिए, फ़ॉस्फर इमेजिंग प्लेट्स डिजिटल चित्र पर प्लेट के सही अभिविन्यास की पहचान करने के लिए एक अलग कोण में एक कोने में कटौती भी प्रदर्शित करते हैं ।
  5. एक डिजिटल छवि प्राप्त करने के लिए संभव उच्चतम रिज़ॉल्यूशन पर प्लेट स्कैन करें ।

4. वैकल्पिक: ऊतक वर्गों के cresyl वायलेट धुंधला

  1. (लगभग 2 ज) भंग जब तक विआयनीकृत पानी (डीएच2ओ) की ५०० मिलीलीटर में क्रेसिल बैंगनी एसीटेट के 5 जी मिश्रण से 1% क्रेसिल बैंगनी समाधान तैयार करें । एक नया ५०० मिलीलीटर बोतल में एक कीप का उपयोग कर एक फिल्टर कागज के माध्यम से फ़िल्टर । पीएच 3.5-3.8 करने के लिए समायोजित करें ।
  2. धूआं हुड के तहत स्लाइड धुंधला सेट स्थिति । सफेद polypropylene ट्रे में निम्नलिखित समाधानों के साथ ट्रे तैयार करें (xylene के लिए छोड़कर):
    a. ५०% इथेनॉल/50% dH2O
    b. ७०% इथेनॉल/30% dH2O
    c. १००% इथेनॉल
    d. १००% इथेनॉल
    ई. १००% dH2O
    f .1% क्रीसिल वायलेट
    g. ०.०७% एसिटिक एसिड (एसीटिक एसिड के १७५ μl के लिए २५० एमएल का डीएच2ओ) जोड़ें ।
    एच. १००% xylene ग्रीन विलायक प्रतिरोधी ट्रे में
    १००% xylene ग्रीन विलायक प्रतिरोधी ट्रे में
  3. धूआं हुड के लिए स्लाइड स्थानांतरण और उन्हें एक स्लाइड रैक में जगह है ।
  4. 1 मिनट के लिए स्लाइड सूई द्वारा डीएच2ओ में १००% इथेनॉल (ट्रे a-डी) में इथेनॉल की वर्गीकृत श्रृंखला में वृद्धि के माध्यम से लिपिड भंग ।
  5. इथेनॉल की सांद्रता अवरोही के माध्यम से डीएच2हे करने के लिए नमूनों rehydrate (ट्रे ए डी रिवर्स क्रम में, ट्रे ई द्वारा पीछा किया) 1 मिनट के लिए स्लाइड सूई द्वारा ।
  6. 10 मिनट के लिए क्रेसिल बैंगनी समाधान में नमूनों विसर्जित कर दिया ।
  7. ०.०७% एसिटिक एसिड में नमूनों को ऊपर की स्लाइडों को उठाने के लिए कुल्ला करें और 4-8 एस के लिए धीरे से नीचे धो लें । dH2हे में 1 मिनट के लिए सूई द्वारा स्लाइड धोने ।
  8. 30 एस के लिए स्लाइड के विसर्जन के लिए इथेनॉल की सांद्रता आरोही (ट्रे ए डी) में नमूनों dehydrate ।
  9. १००% xylene (ट्रे एच और मैं) के दो ट्रे के माध्यम से नमूनों हस्तांतरण इथेनॉल बुझाने के लिए ।
  10. इथेनॉल की सांद्रता अवरोही के माध्यम से डीएच2हे करने के लिए नमूनों rehydrate (ट्रे ए डी रिवर्स क्रम में, ट्रे ई द्वारा पीछा किया) 1 मिनट के लिए स्लाइड सूई द्वारा ।
  11. स्लाइड खारा से forceps के साथ निकालें । स्लाइड प्रति कार्बनिक विलायक बढ़ते मीडिया की कुछ बूंदें जोड़ें और नमूनों की रक्षा के लिए शीर्ष पर एक 24 x ६० मिमी coverslip जोड़ें । धीरे coverslip पर दबाकर नमूना और coverslip के बीच हवा के बुलबुले निकालें ।
    नोट: शेष स्लाइडों को सूखने से रोकने के लिए बढ़ते हुए xylene में रखें ।
  12. आरटी में एक धूआं हुड में रात भर स्लाइड सूखी ।
  13. एक सूक्ष्मदर्शी और 1.25 x उद्देश्य के साथ नमूना की एक तस्वीर प्राप्त करें ।

5. डिजिटल छवि के डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण

  1. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ [3एच] microscale से प्रत्येक अंशांकन मानक के सापेक्ष ऑप्टिकल घनत्व (छड़) को मापने ।
    1. मेनू आइटम क्षेत्र निर्धारणसे क्षेत्र निर्माण के लिए एक उपकरण का उपयोग कर [3ज] microscale के प्रत्येक बिंदु के लिए समान आकार के एक क्षेत्र का चयन करें । मेनू आइटम लेबलके अंतर्गत संख्या पर क्लिक करके प्रत्येक चयनित क्षेत्र को एक संख्या असाइन करें ।
    2. फ़ाइल क्लिक करके अंशांकन मानक के प्रत्येक बिंदु के लिए आयुध डिपो मूल्यों को निर्यात करें | ई र्यात करें । 2d क्षेत्र रिपोर्ट। एक स्प्रेडशीट के लिए रॉड मूल्यों स्थानांतरण और चयनित क्षेत्र के आकार के द्वारा सामान्य । आगे डेन्सिमितीय विश्लेषण के लिए एक मानक वक्र प्राप्त करने के लिए रैखिक प्रतीपगमन करते हैं ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि चयनित क्षेत्रों में आदेश मिलान रॉड मूल्यों और नमूनों की पहचान करने के लिए लेबल कर रहे हैं ।
  2. प्रत्येक अनुभाग में एक क्षेत्र निर्माण उपकरण का उपयोग कर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का चयन करके मालिकाना इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऑटोराडिओग्राम का परिमाणन प्रदर्शन और अपने ods को मापने. ब्याज के क्षेत्र के लिए एक टेम्पलेट बनाने के द्वारा हर अनुभाग में एक ही क्षेत्र का चयन करें, जिसकी प्रतिलिपि बनाई जाती है और मैन्युअल रूप से प्रत्येक ऑटोराडिओग्राम के लिए मस्तिष्क एनाटॉमी में मामूली बदलाव के लिए समायोजित किया जाता है । एक मस्तिष्क एटलस18के साथ स्वतः adiograms की तुलना द्वारा रॉय के एनाटॉमी की पहचान. जब कई उपचार की तुलना में कर रहे हैं, अंधा विश्लेषण प्रदर्शन और क्रम में rois के पक्षपातपूर्ण चयन से बचने के लिए यादृच्छिक ।
  3. निर्यात रॉड मूल्यों और चयनित क्षेत्रों के आकार एक स्प्रेडशीट में फ़ाइल क्लिक करके । ई र्यात करें । 2d क्षेत्र रिपोर्ट।
  4. विशिष्ट क्षेत्र प्रति घनत्व प्राप्त करने के लिए अपने क्षेत्र द्वारा चयनित रॉय की मापा रॉड विभाजित करें ।
  5. प्लेट की पृष्ठभूमि की रॉड को मापने और एक स्प्रेडशीट में इसी रॉड मूल्यों और क्षेत्र के आकार का निर्यात करें । प्रत्येक ROI के हर रॉड मूल्य से औसत पृष्ठभूमि संकेत घटाना.
  6. औसत तकनीकी प्रतिकृति की छड़, अर्थात्, एक ही जानवर से ऊतक का उपयोग कर अनुभाग प्रतिकृति ।
  7. रेडियोलिगंड बाइंडिंग की इकाइयों में छड़ परिवर्तित करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें, अर्थात्, nci/मिलीग्राम ऊतक समकक्ष (TE) ।
    नोट: शब्द ते उपयोग किया जाता है क्योंकि मानक ऊतक अनुकरण सामग्री के साथ उत्पन्न कर रहे हैं ।
  8. एनसीआई/एमजी के रूपांतरण द्वारा एक्सप्रेस बाइंडिंग रेडियोलीगेंड (समीकरण 1) की विशिष्ट गतिविधि के अनुसार nci/
    Equation1
  9. विशिष्ट बाइंडिंग मान प्राप्त करने के लिए, कुल बाइंडिंग से गैर-विशिष्ट बाइंडिंग घटाएं ।
  10. प्रत्येक जानवर की तकनीकी प्रतिकृति के औसत का उपयोग करके प्रत्येक जैविक प्रतिकृति की बाइंडिंग औसत (५.६ चरण में प्राप्त) ।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, उच्च-बंधुत्व ghb बाइंडिंग साइटों का संरचनात्मक वितरण, माउस मस्तिष्क में, जो कि कोरोनल, समतलीय और क्षैतिज वर्गों में काटा गया था, रेडियोलाबटेंड ghb एनालॉग [3H] हॉपीसीए के साथ विज़ुअलाइज्ड किया गया था (चित्र 3 ). बंधन के उच्च स्तर हिप्पोकैम्पस और कोर्टेक्स में मनाया गया, striatum में कम बाध्यकारी और कोई बाध्यकारी सेरिबैलम में पाया गया था, उच्च संबध ghb साइटों की पिछले रिपोर्ट अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए इसी9,10, 11,12. के रूप में यहां दिखाया गया है, संरचनात्मक संरचनाओं अलग सेक्शनिंग विमानों और संरचनात्मक अखंडता का उपयोग कर किया जा सकता है क्रेसिल बैंगनी धुंधला द्वारा समर्थित किया जा सकता है । ghb उच्च संबध बाध्यकारी साइटों के लिए, विशेष रूप से कम radioligand बाध्यकारी के साथ क्षेत्रों, जैसे सेरिबैलम, ऊतक के बाद धुंधला के साथ की पुष्टि कर रहे हैं (चित्रा 3). कोरोनल वर्गों सबसे अधिक बार साहित्य9,10में पाया जाता है । वे मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए व्यावहारिक है वर्गों की एक उच्च राशि के रूप में एक मस्तिष्क से प्राप्त किया जा सकता है । समरूप और क्षैतिज वर्गों के एक खंड के भीतर इस प्रकार महान सिंहावलोकन प्रदान कृंतक मस्तिष्क के सबसे भर में बाध्यकारी visualizing का लाभ है । चित्रा 4स्तनधारी मस्तिष्क में उच्च बंधुत्व ghb बाध्यकारी साइटों के विकासवादी संरक्षण दिखाता है । [3ज] हॉपीसीए बाध्यकारी साइटों माउस, चूहा और साथ ही सुअर मस्तिष्क प्रजातियों के बीच सकल मस्तिष्क शरीर रचना की तुलना को सक्षम करने के ऊतकों में पाया गया । आम तौर पर, विकासवादी संरक्षण और क्षेत्रीय वितरण अध्ययन ब्याज के एक प्रोटीन के लक्षण वर्णन में काफी सहायता कर सकते हैं, इस मामले में एक उपंयास लक्ष्य है, और इस प्रकार अपने शारीरिक समारोह के बारे में संकेत दे सकता है19।

उच्च बंधुत्व ghb बाध्यकारी साइटों ghb रेडियोलिगन्स, जो बाध्यकारी साइटों लेकिन तुलनीय विशिष्ट गतिविधियों (चित्रा 5) के लिए विभिन्न बंधुता प्रदर्शन के साथ जांच की गई । [3ज] हॉपीसीए को पहले ७४ एनएम के ए.डी . को दिखाया गया था, जो कि वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध रेडियोलीऔर [3एच] एनसीएस से बेहतर है, ६९७ एनएम के ए केडी के साथ ३८२, दोनों मात्रात्मक ऑटोएडिग्राफी9द्वारा पीएच ६.० में निर्धारित किया गया है । इस प्रकार, [3ज] हॉपीसीए बहुत उच्च संवेदनशीलता के साथ संपन्न होता है, जो एक उत्कृष्ट सिग्नल-टू-शोर अनुपात में अग्रणी होता है । [3H] ncs-३८२ की कम संवेदनशीलता के कारण, उच्च रेडियोलीऔर सांद्रता का उपयोग बाइंडिंग के समान स्तर प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए ( चित्र 5में y-अक्षों की तुलना करें) । जब [3ज] ghb की तुलना में, यहां तक कि उच्च radioligand सांद्रता (30 एनएम) तुलनीय बाध्यकारी स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । यह मुख्य रूप से काफी कम समानता के कारण है (केमैं ४.५ μm के) इस radioligand20. हालांकि, उच्च रेडियोलीऔर एकाग्रता भी एक फलस्वरूप कम संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी9,10 के स्तर को बढ़ाता है । प्रयोगों की यह श्रृंखला उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के उत्पादन के लिए एक उच्च-आत्मीयता रेडियोलीऔर होने के महत्व पर प्रकाश डालती है.

क्योंकि उच्च संबध ghb साइटों अग्र मस्तिष्क क्षेत्रों (६० pmol/मिलीग्राम17) में इतने उच्च स्तर के लिए व्यक्त कर रहे हैं, संतृप्ति घटता द्वारा औषधीय मापदंडों का निर्धारण स्वाभाविक कठिन मानक ट्राइटियम संवेदनशील भास्वर इमेजिंग का उपयोग अतिसंतृप्त छवियों के जोखिम के कारण प्लेटें । इसलिए, [3ज] हॉपीसीए और [3एच] एनसीएस-३८२ के लिए kd मानों को प्रथम निर्धारण के द्वारा प्राप्त किया गया हैi मूल्यों को समजात विस्थापन घटता है, और फिर kd (चित्रा 6)9की गणना । अधिकांश रेडियोलीगन्स के लिए, एक विकल्प आइसोटोप-कमजोर पड़ने का उपयोग करने के रूप में नियमित रूप से homogenate बाध्यकारी assays में किया जाता है । इसके अलावा, कश्मीरडी मूल्यों अलग पीएच मूल्यों पर निर्धारित किया गया है । जाहिर है, उच्च बंधुआ ghb साइटों को सबसे अधिक कुशलता से पीएच ६.० (चित्रा 6a और चित्रा 6a) में बला हैं, के बाद से पीएच ७.४ काफी प्रभाव संलग्नी अपनत्व को परख स्थितियों को बदलने । इस प्रकार, Kd for [3H] ph ७.४ पर हॉपीसीए लगभग 30 गुना अधिक है जो कि ph ६.० से अधिक संख्यात्मक है । पीएच बढ़ती गैर की एक उच्च डिग्री विशिष्ट बाध्यकारी है, जो एक चेतावनी हो जाता है जब [3ज] ncs-३८२ का उपयोग कर जहां केवल विशिष्ट बाध्यकारी की कम मात्रा में पीएच ७.४ (चित्रा 6e) पर प्राप्त किया जा सकता है में परिणाम । यह वास्तव में शारीरिक पीएच9में इस रेडियोलीऔर का उपयोग कर औषधीय मापदंडों के निर्धारण में बाधा, फिर संभव के रूप में उच्च संबध के रूप में के साथ एक radioligand होने में शक्ति illustrating.

Figure 1
चित्र 1: उच्च-बंधुता ghb बाइंडिंग साइटों को लक्षित करने वाले रेडियोलीगन्स की संरचनाएं. [3ज] 3-हाइड्रोक्सीसाइक्लोपैंट-1-एनए कार्बोक्सिलिक अम्ल ([3ज] हॉपीसीए)14, [3h] (E, RS)-6, 7, 8, 9-tetrahydro-5-hydroxy-5H-benzocyclohept-6-यिलिडीन एसिटिक एसिड (ncs-३८२) ([3h] ncs-३८२)15 और [3ज] γ-hydroxybutyric एसिड ([3एच] ghb)16 तुलनीय विशिष्ट गतिविधि के साथ ट्राइटियमित रेडियोलिगन्स के रूप में (20-40 Ci/साथ ही [१२५I] 4-हाइड्रोक्सी-4-[4-(2-आयोडोबेन-जाइलोक्सी) फ़ेनिल] ब्यूटनोएट ([ १२५I] bnoph-ghb)13 अनुमानित मोलर गतिविधि के साथ २००० Ci/ ghb संरचनात्मक तत्व लाल रंग में हाइलाइट किया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो स्वतः एडिग्राफी में के प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । (1) जानवर euthanized है, ऊतक विच्छेदित है और सूखी बर्फ पर स्नैप जमे हुए है । ऊतक तो एक cryostat पर खोदी है, गल-माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार और (2) वर्गों के साथ इनक्यूबेटेड हैं radioligand जब तक संतुलन बाध्यकारी. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के निर्धारण के लिए, समाधान किसी संबंधित लेकिन समान रासायनिक संरचना के बिना लेबल वाले विस्थापक के पूरक होते हैं । (3) बाद में, असीम रेडियोलिगंड परख बफर में धोने से हटा दिया जाता है और लवण आसुत एच2ओ के साथ rinsing द्वारा समाप्त कर रहे हैं । जब वर्गों शुष्क हैं, paraformaldehyde (pfa) निर्धारण के लिए स्थाई रूप से ligand प्रोटीन संपर्क स्थापित किया जाता है । तबकों को फॉस्फर इमेजिंग प्लेटों से अवगत कराया जाता है. (4) पर्याप्त एक्सपोजर समय के बाद, प्लेटें डिजिटल ऑटोअडिओग्राम प्राप्त करने के लिए स्कैन कर रहे हैं । (5) अंततः, छवि विश्लेषण (rois) ब्याज के क्षेत्रों की परिभाषा का उपयोग किया जाता है, और बाध्यकारी quantified है । दिखाए गए उदाहरण में, ऑप्टिकल घनत्व (ओडीएस) माउस कॉर्टेक्स (बाएं) और हिप्पोकैंपस (मध्य) के अनुभागों में सचित्र हैं । परिमाणन एक [3ज] माइक्रोस्केल (दाएं) के साथ एक साथ वर्गों को उजागर करके किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:1 एनएम के प्रतिनिधि autoradiograms [3ज] माउस मस्तिष्क वर्गों के लिए बाध्यकारी हॉपीसीए । (क) कोरोनल, समवितल और क्षैतिज ऊतक वर्गों के लिए रेडियोलिगंड बाध्यकारी संरचनात्मक संरचनाओं की दृश्यता पर विभाजन विमान के महत्व को वर्णन करने के लिए । (ख) संरचनात्मक क्षेत्रों को सत्यापित करने के लिए इसी ऊतक वर्गों के क्रीसिल वायलेट धुंधला, विशेष रूप से कम के साथ क्षेत्रों/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4:1 एनएम के प्रतिनिधि autoradiograms [3ज] विभिन्न प्रजातियों में हॉपीसीए बाइंडिंग । की तुलना (क) चूहा, (ख) माउस और (ग) विट्रो में सुअर ऑटोअडिओग्राम क्रम में सकल मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान के साथ cortical और हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों के लिए बाध्यकारी साइटों के विकासवादी संरक्षण वर्णन करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: उच्च बंधुत्व ghb के लिए बाध्यकारी साइटों ghb रेडियोलिगन्स के लिए अलग संवेदनशीलता के साथ माउस कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस से मस्तिष्क स्लाइस में विट्रो स्वविकिरणी चित्रण में द्वारा quantification. कुल बाध्यकारी fmol के रूप में रिपोर्ट की है मिलीग्राम ऊतक समकक्ष (ते) रेडियोलिगन्स के लिए (A) [3h] हॉपीसीए (1 एनएम) और (B) [3h] ncs-३८२ (7 nm) और (C) [3h] ghb (30 nm) (समान विशिष्ट गतिविधियां). रेडियोलिगन्स में से किसी के लिए 1 मिमी ghb या 1 मिमी हॉपीसीए की उपस्थिति में गैर-विशिष्ट बाइंडिंग का पता नहीं लगाया गया (दिखाया नहीं गया) । डेटा चार जैविक प्रतिकृति प्रत्येक तीन तकनीकी प्रतिकृति में प्रदर्शन के माध्य ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: [3ज] हॉपीसीए और [3एच] के स्वनिर्मित प्रतियोगी विस्थापन द्वारा Kd और Bअधिकतम मानों के ऑटोडियोग्राफिक निर्धारण के प्रतिनिधि परिणाम पीएच ६.० और पीएच ७.४ पर माउस कोर्टिकल अनुभागों में ncs-३८२ के क्रम में रेडियोलीगन्स के अपनत्व पर पीएच के प्रभाव को दर्शाइए । (kडी और बीमैक्स radioligand और प्रतियोगी के रूप में एक ही यौगिक का उपयोग कर की गणना कर रहे थे, के प्रारंभिक निर्धारण के माध्यम से ki मान22). (क) 1 एनएम के लिए इष्टतम संकेत-से-शोर अनुपात के साथ ऑटोअडिओग्राम [3एच] पीएच ६.० पर हॉपीसीए बाध्यकारी है । (ख) ७.४ के लिए बफर पीएच बदलने की आवश्यकता है एक उच्च [3एच] हॉपीसीए एकाग्रता (8 एनएम) महत्वपूर्ण बाध्यकारी स्तर तक पहुंचने के लिए । (ग) परिणामस्वरूप लॉग-एकाग्रता बाध्यकारी घटता; माध्य ± SEM. (D) 5 nM [3h] ncs-३८२ पीएच ६.० में परिणाम कम गैर-विशिष्ट बाइंडिंग में, जबकि (E) ४० एनएम [3h] ncs-३८२ पीएच ७.४ पर बाध्यकारी प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त है । (च) परिणामस्वरूप लॉग-एकाग्रता बाध्यकारी घटता; माध्य ± SEM. डेटा से प्राप्त किया गया था 3-4 जैविक प्रतिकृति प्रत्येक 3-5 तकनीकी प्रतिकृति में प्रदर्शन किया, केवल [3H] ncs-३८२ प्रयोगों पर पीएच ७.४ केवल 2 जैविक प्रतिकृति के साथ प्रदर्शन किया गया । दोनों रेडियोलिगन्स के लिए, 1 मिमी ghb का उपयोग गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के निर्धारण के लिए किया गया था । विश्लेषण और Kd और Bmaxकी गणना पर विवरण के लिए,9देखें । यह आंकड़ा अनुकूलित किया गया है और पिछले प्रकाशन9 से elsevier से अनुमति के साथ reprinted । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

एक स्वतः आदिलेखी परख की गुणवत्ता अक्सर रेडियोलिगंड की संवेदनशीलता से निर्धारित होता है । एक प्रमुख योगदान कारक चयनित रेडियोआइसोटोप है, जो ज्ञात लिगन्स की उपलब्धता द्वारा या विशिष्ट लेबलिंग तकनीकों की व्यवहार्यता द्वारा उचित विशिष्ट गतिविधि के साथ लिगंडा उपज के लिए दिया जाता है (यानी, रेडियोधर्मिता की मात्रा प्रति इकाई तिल का एक रेडियोलिगंड)23और सीमित मात्रा में रासायनिक क्षरण के साथ । ज्ञात लिगंडा के रेडियोलीगन्स की एक बड़ी संख्या ट्राइटियम9,10,24,25,26के साथ लेबल कर रहे हैं, जो कई फायदे infers. सबसे पहले, ट्राइटियम (3ज) एक लंबे आधे जीवन (१२.४३ साल) व्यक्तिगत बैच के दीर्घकालिक भंडारण को बढ़ावा देने की विशेषता है । दूसरे, ligand-लक्ष्य बातचीत रेडियोन्यूक्लाइड द्वारा विकृत नहीं है के रूप में 3ज-लिगंडा जैविक रूप से उनके माता पिता के यौगिकों से अप्रभेद्य हैं । tritium कम ऊर्जा β-कणों, जो उच्च स्थानिक संकल्प में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक में ही कम दूरी की यात्रा और, बाद में, संरचनात्मक संरचनाओं के बीच अधिक से अधिक अंतर का उत्सर्जन करता है4. फिर भी, ट्राइटियम लेबलिंग केवल मध्यम उच्च विशिष्ट गतिविधियों उपज के लिए उत्पादन किया जा सकता है । यह तथ्य यह है कि उपलब्ध 3एच स्रोतों गैर रेडियोधर्मी हाइड्रोजन के साथ प्रदूषित कर रहे हैं के कारण है । आम तौर पर, उच्च विशिष्ट गतिविधि, कम radioligand के लिए संवेदनशील खोज23उपज की जरूरत है । इसके अलावा, यह विचार किया जाना चाहिए कि 3एच-लिगंडा 3एच-लेबल की स्थिरता के आधार पर पानी के साथ हाइड्रोजन एक्सचेंज से गुजरने की संभावना है । कम अभिव्यक्ति या बहुत कम विशिष्ट गतिविधि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, आयोडीन-१२५ रेडियोन्यूक्लाइड13के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । आयोडीन की अधिकतम विशिष्ट गतिविधि-१२५ लगभग १०० है-tritium की तुलना में अधिक गुना । हालांकि, आयोडीन-१२५ के साथ काम करते समय कई अतिरिक्त विचार किए जाने चाहिए । उदाहरण के लिए, आयोडीन-१२५ के अलावा आम तौर पर अणु में संरचनात्मक परिवर्तन लाती है जो ligand लक्ष्य बातचीत प्रभाव हो सकता है । के रूप में आयोडीन-१२५ के एक आधा जीवन है ६० दिन, दैनिक क्षय के लिए सुधार विशिष्ट गतिविधि और ligand के परिमाणन के लिए विचार किया जाना चाहिए-लक्ष्य बातचीत23. १२५ मैं-लिगंडा γ-फोटॉन उत्सर्जित करते हैं और बहुत अधिक संवेदनशीलता के बावजूद, कम रिज़ॉल्यूशन वाली छवियों का उत्पादन करते हैं । यह समाधान और आइसोटोप की अधिकतम ऊर्जा के बीच उलटा संबंध के कारण है (के रूप में नीचे चर्चा की). अंत में, tritium की तुलना में, वृद्धि की देखभाल जब आयोडीन-१२५ radionuclide की उच्च ऊर्जा के कारण हैंडलिंग लिया जाना चाहिए ।

nuclide पर निर्भर करता है, ऊतक खंड मोटाई संकल्प को प्रभावित कर सकते हैं. ट्राइटियम के कम ऊर्जा β-विकिरण सीमा अपने ऊतक लगभग तक पहुँचने के लिए आत्म अवशोषण के कारण 5 μm. एक परिणाम के रूप में, परिमाणन ऊतक मोटाई से प्रभावित नहीं है जब खंड मोटाई से अधिक है 5 μm27,28. इसके विपरीत, उच्च ऊर्जा आइसोटोप के रेडियोधर्मी क्षय एक अधिक से अधिक ऊतक पैठ है, कम छवि संकल्प में जिसके परिणामस्वरूप, क्योंकि खोज माध्यम के लिए एक अधिक से अधिक दूरी के साथ लाइगैंडों भी छवि गठन करने के लिए योगदान. नतीजतन, पतले वर्गों उच्च ऊर्जा रेडियोन्यूक्लिड्स1के लिए उच्च संकल्प को बढ़ावा देने के.

एक स्वतः एडिग्राफिक प्रोटोकॉल की स्थापना इष्टतम बाध्यकारी शर्तों के ज्ञान (जैसे, बफर, पीएच और तापमान) और अपनत्व और कैनेटीक्स के संदर्भ में रेडियोलिगंड के औषधीय मापदंडों की आवश्यकता है । यदि रेडियोलिगंड की विशेषता नहीं है, तो खोजपरक अध्ययन29आवश्यक हैं । एक इष्टतम रेडियोलिगंड एकाग्रता का चयन रेडियोलिगंड और बाध्यकारी साइटों की बहुतायत के संबध से दोनों निर्देशित है । आम तौर पर, एक एकाग्रता 5-6 बार कश्मीरडी को दर्शाती है कि सभी बाध्यकारी साइटों30संतृप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक अंय दृष्टिकोण के लिए कुल के उच्चतम अनुपात उपज के लिए गैर विशिष्ट Kd31 नीचे radioligand सांद्रता का चयन करके बाध्यकारी और एक ही समय में रेडियोलिगंड समाधान की बचत करना है । यह दृष्टिकोण विशेष रूप से उपयोगी है जब बाध्यकारी साइट उच्च रेडियोलिगंड सांद्रता oversaturating की संभावना में वृद्धि होगी के बाद से जांच ऊतक में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है, के लिए मामले के रूप में [3ज] हॉपीसीए और उच्च बंधुत्व ghb बाइंडिंग साइटें9. इसके अलावा, आदेश में कुशलता से लक्षित प्रोटीन की पूरी आबादी को लेबल करने के लिए, radioligand आदर्श सभी संभव लक्ष्य conformations के लिए बाध्य करना चाहिए । विशेष रूप से रिसेप्टर स्वतः आदिचित्रण में, एगोनिस्ट का उपयोग केवल कुल रिसेप्टर्स की एक आंशिक संख्या प्रकट हो सकता है के बाद से कुछ कम संबध एगोनिस्ट राज्यों में मौजूद हो सकता है. इसके विपरीत, तटस्थ विरोधी अक्सर सभी रिसेप्टर राज्यों26,29के लिए समानता प्रदर्शित करते हैं ।

इसके अलावा, आम तौर पर बाध्यकारी प्रयोगों संतुलन बाध्यकारी शर्तों के तहत किया जाता है । इसलिए, वांछित प्रायोगिक स्थितियों (फिक्स्ड रेडियोलीऔर एकाग्रता, बफर और तापमान) के तहत संतुलन बाध्यकारी तक पहुँचने के लिए आवश्यक समय के दायरे के भीतर संतुलन बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए संघ प्रयोगों में निर्धारित किया जाना चाहिए प्रयोग४,२३,३०. रेडियोलीऔर ऊष्मायन के बाद, असीम रेडियोलीऔर परख बफर के साथ कई इनक्यूबेशंस द्वारा धोया जाता है और आमतौर पर आसुत एच2ओ में rinsing द्वारा पीछा किया जाता है । सिग्नल-से-शोर अनुपात पर निर्भर करता है तापमान और समय का समायोजन करके अनुकूलित कर सकते हैं रेडियोलिगंड की वियोजन दर26,30,31.

रेडियोलीगन्स गैर-जैविक सामग्रियों के लिए बाध्यकारी प्रदर्शित कर सकते हैं, अर्थात्, गैर-विशिष्ट बाध्यकारी । इच्छित लक्ष्य के अलावा अन्य सेलुलर घटकों के लिए radioligand बाइंडिंग अविशिष्ट बाइंडिंग के रूप में परिभाषित किया गया है । रेडियोलिगंड बाइंडिंग की कुल राशि के लिए अविशिष्ट बाइंडिंग का योगदान एक प्रतिस्पर्धी unspecific संलग्नी की उपस्थिति में मूल्यांकन किया जाता है जो रेडियोलिगंड के समान बाइंडिंग साइट को लक्षित करता है । के रूप में गैर रेडियोधर्मी यौगिक (displacer) में आपूर्ति की है १०,०००-गुना अतिरिक्त, यह बाध्यकारी साइट पर रह रहे हैं और radioligand केवल बंद लक्ष्य साइटों26,31,३२करने के लिए बाइंड कर सकते हैं. महत्वपूर्ण रूप से, अबला यौगिक रेडियोलिगंड की तुलना में एक अलग रासायनिक संरचना का होना चाहिए क्योंकि यह दोनों विशिष्ट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर विशेष बाध्यकारी23displacing के जोखिम को कम करती है । झिल्ली के बंधन से उत्पन्न होने वाली गैर-विशिष्ट बाध्यकारी विशेष रूप से काफी लिपोफिलिक रेडियोलीगन्स के मामले में एक बड़ी समस्या हो सकती है । कुछ मामलों में, व्यापक धोने प्रक्रियाओं गैर रिसेप्टर बाध्य radioligand हटा सकते हैं और इसलिए विशिष्ट बाध्यकारी अनुपात में सुधार29.

जब एक परख बफर का चयन, यह ईओण शक्ति और लिज़ंड लक्ष्य बातचीत पर पीएच के प्रभाव पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । ध्रुवीय लाइगैंडों और बाध्यकारी साइटों के हाइड्रोफिलिक घटकों के बीच विशेष रूप से स्थिरवैद्युत बातचीत बफर के आयनिक शक्ति से प्रभावित हैं । इसलिए, मोनोसंयोजी या द्विसंयोजक आयनों के साथ पूरकता प्रभावी संबध लगातार23,३३को प्रभावित कर सकता है । यदि अध्ययन ligand-लक्ष्य बातचीत के लिए इष्टतम बफ़र संरचना अज्ञात है, पायलट प्रयोगों में विभिन्न आम बफ़र्स का पता लगाया जाना चाहिए. Buffers भी ऐसे ascorbic एसिड और अपमानजनक एंजाइमों के inhibitors के रूप में विरोधी oxidants के साथ पूरक किया जा सकता है29,३४। इसके अलावा, बाध्यकारी साइट के भीतर विशिष्ट समूहों के आयनन या लिज़ंड पर ही पीएच से प्रभावित है और संतुलन बाध्यकारी स्थिर, काइनेटिक दर स्थिरांक और गैर विशेष बाध्यकारी23,३३पर महत्वपूर्ण प्रभाव है । उदाहरण के लिए, उच्च-संबध ghb बाइंडिंग साइट को विभिंन ghb रेडियोलिगन्स के साथ जांच कर इस बाइंडिंग लक्ष्य (चित्र 6) पर pH के महत्व को अच्छी तरह दिखाता है । ligand-रिसेप्टर बातचीत के लिए इष्टतम पीएच लक्षण वर्णन भी अपनी जैविक प्रासंगिकता के संबंध में लक्ष्य के महत्व के बारे में सुराग दे सकता है ।

डिजिटल स्वरावरण चित्रण में एक और महत्वपूर्ण कारक है एक्सपोजर समय, अर्थात्, समय को प्राप्त करने के लिए आवश्यक quantifiable स्वतः adiograms को उजागर करके रेडियोलाबटेड ऊतक वर्गों के भास्वर इमेजिंग प्लेटों. अनुमान नमूने में रेडियोधर्मिता की मात्रा के आधार पर कर रहे हैं, ऊर्जा और आइसोटोप के आधे जीवन के साथ-साथ वांछित संकेत करने के लिए शोर अनुपात. विशेष रूप से, संतृप्त छवियों और उच्च पृष्ठभूमि संकेत में लंबे समय तक एक्सपोजर टाइम परिणाम । ऊंचा पृष्ठभूमि संकेत ब्रह्मांडीय विकिरण से बचने के लिए नेतृत्व परिरक्षित वातावरण के भीतर कैसेट भंडारण द्वारा कम किया जा सकता है1,4. फिर भी, यदि सबऑप्टिमल स्वतः adiograms हासिल कर रहे हैं, नमूना कई बार उजागर किया जा सकता है, बशर्ते कि ligand लक्ष्य जटिल तय हो गई है और रेडियोन्यूक्लाइड के आधे जीवन यह अनुमति देता है ।

भास्वर इमेजिंग प्लेटें पुन: उपयोग किया जा सकता है और एक लंबी उंर जब सही ढंग से संभाला है, अर्थात्, झुकने से बचा जाना चाहिए और प्लेटें एक शुष्क वातावरण में संग्रहित किया जाना चाहिए । भास्वर इमेजिंग प्लेटों की हैंडलिंग प्रकाश और ब्रह्मांडीय विकिरण के प्रति उनकी संवेदनशीलता के द्वारा निर्देशित है । इस प्रकार, यह पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के क्रम में हर उपयोग करने से पहले थाली को मिटा करने के लिए महत्वपूर्ण है. इमेजिंग प्लेटों के लिए रेडियोलाबटेड ऊतक वर्गों का प्रदर्शन विकिरण-परिरक्षित कैसेट पूरी तरह से रहित प्रकाश में किया जाता है । जब एक्सपोजर समय के अंत में स्कैनर के लिए थाली स्थानांतरित, किसी भी परिवेश प्रकाश भी सफेद प्रकाश के साथ भी कम संपर्क के रूप में बचा जाना चाहिए संचित संकेत कम कर देता है । इसके अलावा, प्लेट संकेत लुप्त होती से बचने के लिए नमूना हटाने के बाद तुरंत स्कैन किया जाना चाहिए. फ़ॉस्फर इमेजिंग प्लेटों का उपयोग करने की एक खामी कलाकृतियों की संभावित उपस्थिति और1प्लेटों के दोहराए गए उपयोग के बाद अवशिष्ट ' भूत चित्र ' है ।

ट्राइटियम के साथ कार्य करना एक सुरक्षात्मक कोटिंग के बिना इमेजिंग प्लेटों की आवश्यकता के लिए कम ऊर्जा विकिरण भास्वर क्रिस्टल तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं. ट्राइटियम-संवेदी फ़ॉस्फर इमेजिंग प्लेट्स इसलिए अधिक संदूषण या गलत हैंडलिंग के कारण क्षति के प्रति संवेदनशील होते हैं । एक बार दूषित होने पर, ट्राइटियम-संवेदनशील प्लेटें साफ नहीं की जा सकतीं और उन्हें प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है । पीएफए वाष्प के साथ लिगांड-लक्ष्य परिसर का निर्धारण प्लेट के संभावित संदूषण को कम करता है, इसके जीवनकाल को बढ़ाता है । इसके अलावा, स्थिरीकरण के बाद ऊतक के निर्जलीकरण एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि ट्राइटियम संवेदनशील प्लेटें नमी के प्रति संवेदनशील हैं । इसकी नाजुक प्रकृति के कारण, tritium-संवेदनशील प्लेटों अन्य आइसोटोप के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए1,4. इसके विपरीत, उच्च ऊर्जा आइसोटोप के लिए प्लेटें जैसे आयोडीन-१२५ और अधिक मजबूत कर रहे है और उनकी सतह भी ७०% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा साफ किया जा सकता है ।

परंपरागत रूप से, रेडियोसंवेदी फिल्म रेडियोधर्मी क्षय के स्थानिक रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है. जबकि उच्च संकल्प के साथ छवियों को प्राप्त किया जा सकता है, फिल्म स्वत आदिचित्रण कई सीमाएं हैं । खतरनाक रसायनों की आवश्यकता और विकास के लिए एक darkroom के अलावा, एक्स-रे फिल्म एक संकीर्ण गतिशील रेंज की विशेषता है । इसलिए, यह करने के लिए आवश्यक हो सकता है radiolabelled वर्गों को बार अलग एक्सपोजर समय के साथ का पर्दाफाश करने के क्रम में quantifiable गैर-संतृप्त छवियों३५प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, एक्स-रे फिल्म कम ऊर्जा आइसोटोप के साथ लेबल नमूना के लिए निरंतर प्रदर्शन के समय में जिसके परिणामस्वरूप सीमित संवेदनशीलता दर्शाती है, अर्थात् ट्राइटियम क्षय जोखिम के कई महीनों की आवश्यकता हो सकती है. कम संवेदनशीलता छोटे रैखिक रेंज के साथ संयुक्त तकनीक बहुत समय लगता है, खासकर जब इष्टतम परख शर्तों पहले1,३५निर्धारित किया जाना है बनाता है ।

फॉस्फ़र इमेजिंग प्लेटों के विकास के साथ, इनमें से कई सीमाएं३५,३६,३७को संबोधित की गई हैं । इमेजिंग प्लेटें अस्थाई रूप से रेडियोधर्मी क्षय की छवियों को स्टोर करने के लिए, ऊतक नमूने में रेडियोलिगंड के स्थानिक व्यवस्था का प्रतिनिधित्व करने के लिए सेवा करते हैं । photostimulable बफबर: यूरोपीय संघ2+ फॉस्फर क्रिस्टल के नमूने द्वारा उत्सर्जित रेडियोधर्मी ऊर्जा पर कब्जा करने के लिए उपयोग किया जाता है, उच्च ऊर्जा विकिरण के रूप में (जैसे, एक्स-रे, गामा किरणों या बीटा कणों) यूरोपीय संघ के उत्तेजन में परिणाम2+ यूरोपीय संघ3+ और फॉस्फर जाली में जारी इलेक्ट्रॉन के फलस्वरूप फँसाने के लिए4,३७। इमेजिंग प्लेट को दृश्यमान या अवरक्त प्रकाश में उजागर करने से अभिक्रिया में उल्टियां होती हैं, अर्थात् फंसे हुए इलेक्ट्रॉन जारी किए जाते हैं तथा यूरोपीय संघ के परिवर्तन के दौरान3+ यूरोपीय संघ2+ संदीप्ति उत्सर्जित होता है । उत्सर्जित प्रकाश रेडियोधर्मिता की मात्रा के लिए आनुपातिक है और एक photomultiplier द्वारा इसका पता लगाने एक डिजिटल स्वतः adiogram३७के निर्माण में सक्षम बनाता है. इस प्रणाली के साथ संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदान करता है एक महीने से3दिनों के लिए जोखिम समय में उल्लेखनीय कमी के साथ । उस के शीर्ष पर, रैखिक गतिशील रेंज काफी बढ़ जाती है, जो oversaturated छवियों की संभावना को कम कर देता है । रैखिकता को परिमाण के चार से पांच आदेशों के भीतर दिया जाता है और इसे बार3,३५,३६,३७,३८को मान्य किया गया है । हालांकि फिल्म ऑटोएडिग्राफी अभी भी बेहतर स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, स्कैनिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रयास ३०० से 25 μm (पिक्सेल आकार) से संकल्प के सुधार के परिणामस्वरूप, संरचनात्मक क्षेत्रों के बीच विस्तृत भिंनाकरण की अनुमति3। कुल मिलाकर, फ़ॉस्फर इमेजिंग प्लेटें एक बढ़ी हुई रैखिक सीमा और संवेदनशीलता के कारण डिजिटल ऑटोरेडियोग्राम के acquirement की सुविधा कर रहे हैं । कम एक्सपोजर समय और एक सरलीकृत विकास तकनीक काफी उच्च throughput अनुमति डेटा विश्लेषण के लिए कम समय के लिए सीसा ।

स्वत आदिचित्रण की तुलना में, इस तरह के अपनत्व और घनत्व के रूप में उपयोगी औषधीय मापदंडों भी आमतौर पर ऊतक homogenate बाध्यकारी assays में रेडियोलीगन्स के आवेदन की विशेषता है । इस विधि एक कुशल तरीके से एक तरल प्रस्फुरण डिटेक्टर के साथ β उत्सर्जित रेडियोधर्मी क्षय को मापने के द्वारा परिणाम के उत्पादन का लाभ है2. एक बहु-अच्छी तरह से दृष्टिकोण में किया जा रहा है, जैसे, ९६ में-अच्छी तरह से microtiter प्लेटों, यौगिकों की पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग और एकाग्रता पर निर्भर रिश्तों की एक बड़ी संख्या के लिए इस तरह के assays उपयोगी होते हैं. उस के शीर्ष पर, इस सेटअप के साथ संतृप्ति विश्लेषण का आयोजन अक्सर स्वतः एडिग्राफी की तुलना में अधिक व्यवहार्य है, जो उच्च रेडियोलीऔर सांद्रता के साथ अतिसंतृप्त छवियों का खतरा प्रदर्शित करता है । हालांकि, कश्मीरडी और बीमैक्स को प्राप्त करने के लिए गैर-रेडियोधर्मी लिगन्स के साथ एक निश्चित कम रेडियोलीऔर एकाग्रता के समजात विस्थापन का प्रदर्शन करने के लिए, ओवरसेचुरेटेड छवियों (चित्रा 6)22की समस्या को दरकिनार कर । Homogenate बाध्यकारी और स्वतः आदिचित्रण संलग्नी संबध स्थिरांक के लिए समान अनुमान का उत्पादन जबकि ब्याज के प्रोटीन के ऊतक घनत्व Homogenate बाध्यकारी में आंका जा सकता है । इस प्रकार, यह प्रस्तावित किया गया है कि ऊतक एकरूपता के साथ सेल झिल्ली व्यवधान को रिसेप्टर हानि या बदल बाध्यकारी शर्तों में परिणाम हो सकता है3,३३। इसके अलावा, ऊतक विच्छेदन में त्रुटियों आसन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से ऊतक के साथ प्रदूषित homogenates का उत्पादन हो सकता है । इसकी तुलना में, छोटे नाभिका में भी जटिल बाध्यकारी पैटर्न कल्पना और विभेदित कर रहे है स्वतः आदिचित्रण में स्थानिक संरचनात्मक संकल्प के कारण3,३३।

इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री भी रुचि के एक प्रोटीन के वितरण visualizes. विधि उच्च संरचनात्मक संकल्प के साथ छवियों का उत्पादन करने में सक्षम है, के रूप में असतत ऊतक घटकों सेलुलर स्तर पर पहचाना जा सकता है और यहां तक कि subcellular स्तर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. अभिरंजक की तीव्रता के आधार पर व्यंजक स्तर का मूल्यांकन किया जाता है । फिर भी, अभिव्यक्ति के स्तर का निरपेक्ष परिमाणन उचित संदर्भ मानकों की कमी के कारण मुश्किल है३९. इसके अलावा, इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री एक चयनात्मक, अच्छी तरह से सत्यापित एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर है जो अक्सर रिसेप्टर अनुसंधान में एक समस्या है ।

इन विट्रो स्वतः एडिग्राफी में प्रदर्शन पर निर्णय लेने से पहले, कई विचार किए जाने की जरूरत है । सबसे पहले, पोस्टमार्टम सहित ऊतक तैयार करने के साथ ही दोहराया ठंड और गल बंधन साइटों के संरक्षण को प्रभावित कर सकता है2. इसके अलावा, विधि एक पर्याप्त radioligand की उपलब्धता पर निर्भर करता है, जो प्रश्न2में लक्ष्य के लिए उच्च समानता और चयनशीलता को प्रदर्शित करता है । रेडियोलिगंड ऑफ़-टार्गेट साइट्स के लिए महत्वपूर्ण बाइंडिंग प्रदर्शित नहीं करना चाहिए, और यह भी एक अनुकूल गतिज प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करना चाहिए । यह आवश्यक है क्योंकि ligand-लक्ष्य जटिल प्रयोग के दायरे के दौरान बरकरार रहना चाहिए । इसके अलावा, जब उपयुक्त गैर रेडियोधर्मी यौगिकों मौजूद हैं, रेडियोन्यूक्लाइड की शुरूआत एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है । इस प्रकार, ब्याज का अणु कुशल रेडियोलाबलिंग के लिए उपयुक्त कार्यात्मक समूहों से सुसज्जित किया जाना चाहिए, जो पर्याप्त उच्च विशिष्ट गतिविधि और रासायनिक स्थिरता४०के साथ रेडियोलीगन्स के उत्पादन में सक्षम बनाता है । में एक और नुकसान के विट्रो स्वतः एडिग्राफी है कि विधि केवल एक बार एक जानवर के उपयोग की अनुमति देता है। अधिक सुंदर ढंग से vivo इमेजिंग तरीकों में इस तरह की स्थिति उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) है, जो एक ही जानवर और अधिभोग और गतिशील बाध्यकारी विशेषताओं के दृढ़ संकल्प के दोहराया स्कैनिंग सक्षम बनाता है के रूप में करने के लिए विस्तार है । पीईटी उच्च स्तनधारियों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है४१ और पूर्व नैदानिक अध्ययन में खुराक अनुकूलन के लिए ४२,४३,४४.

ऑटोराडियोग्राफिक तकनीक के कई संशोधनों को स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों के साथ ही दवा की खोज और विकास में औषधीय लक्ष्यों के लक्षण वर्णन के मामले में अपने आवेदन दोनों का विस्तार । सबसे पहले, इमेजिंग प्रौद्योगिकी के हाल के अग्रिमों में रीयल-टाइम ऑटोएडिग्राफी के विकास के लिए नेतृत्व किया है । α/β-कणों के गैस डिटेक्टरों के विघटन के प्रत्यक्ष माप द्वारा इमेजिंग प्लेटों या फिल्म के लिए की जरूरत है, जिससे तेजी से डिजिटल ऑटोराडिओग्राम४५उत्पादन ।

इसके अलावा, इन विट्रो ऑटोएडिग्राफी में जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता के अध्ययन में सक्षम बनाता है (gpcrs) पोस्टमार्टम के ऊतकों में उनके संरचनात्मक वितरण के बारे में जानकारी के शीर्ष पर. विधि के इस संस्करण में एक रेडियोसक्रिय रूप से ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (gtp), अर्थात्, [३५s] ग्वानोसिन 5 '-γ-थायोट्राइफॉस्फेट ([३५एस] gtpγs) के साथ-साथ ऊतक वर्गों की ऊष्मायन शामिल है । गैर रेडियोधर्मी एगोनिस्ट gpcr की । जब एगोनिस्ट बांधता है और gpcr की एक प्रतिक्रिया elicits, [३५S] gtpγs के निगमन स्थानीयकृत और स्वतः आदिचित्रण, जो केवल सक्रिय रिसेप्टर जनसंख्या को दर्शाता है के माध्यम से मात्रा निर्धारित जा सकता है2,४६,४७ .

पूर्व वीवो ऑटोरेडियोग्राफी तकनीक का एक और संस्करण का प्रतिनिधित्व करता है, जो एक जीवित प्रयोगात्मक पशु के लिए प्रशासन के बाद radioligand के क्षेत्रीय बंधन का आकलन है । पशु के बलिदान के बाद, सवाल में ऊतक के cryosectioning, और स्वतः adiograms में ऑटोराडियोग्राफिक जोखिम परिणाम जो विवो2 मेंरेडियोलिगंड बाइंडिंग को प्रतिबिंबित. पूर्व विवो ऑटोराडियोग्राफी आमतौर पर दवा खोज और विकास कार्यक्रमों के भीतर कार्यरत है ताकि एक प्रमुख यौगिक के फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल के बारे में जानकारी हासिल की जा सके, अर्थात्, इसका अवशोषण, वितरण, चयापचय और उत्सर्जन (एडीएमई) . विशेष रूप से पूरे शरीर स्वतः एडिग्राफी सभी अंगों और ऊतकों को दवा वितरण के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । हालांकि, गैर-विशिष्ट बाध्यकारी और परिमाणन का निर्धारण अधिक कठिन है की तुलना में विट्रो स्वतः एडिग्राफी संभव चयापचय और radioligand के क्षरण के कारण और दूर अबाध्य लिगांड४८धोने के लिए कोई मतलब नहीं है ।

स्वत आदिचित्रण भी प्रारंभिक परीक्षण और पीईटी लाइगैंडों4के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है । उच्च ऊर्जा रेडियोन्यूक्लिडेस कार्बन-11 और फ्लोरीन-18 सबसे अधिक बार पीईटी लिगन्स के लिए उपयोग किया जाता है । पीईटी रेडियोलीगन्स के लिए एक प्रमुख, गैर इनवेसिव आवेदन है क्योंकि एक जीवित पशु में रेडियोलाइऔर बाइंडिंग के quantifiable 3 डी छवियों प्राप्त किया जा सकता है11,४०,४९.

विट्रो में स्वरभांड इमेजिंग प्लेटों का उपयोग करने के लिए एक मूल्यवान परख विधि ligand के औषधीय लक्षण वर्णन-लक्ष्य बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है । विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से और सरल प्रोटोकॉल एक बार इष्टतम परख शर्तों की स्थापना की गई है के रोजगार द्वारा reproducible परिणाम पैदा करता है । ब्याज के एक प्रोटीन का संरचनात्मक वितरण अपने मूल microenvironment के भीतर निर्धारित किया जाता है, जो अपने शारीरिक, औषधीय और रोगजनक भूमिका का अध्ययन करने के लिए स्वस्थ और रोगग्रस्त प्रयोगात्मक पशुओं के पोस्टमार्टम ऊतक के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं मनुष्य2,४७.

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Disclosures

लेखक हित का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

काम lundbeck फाउंडेशन (अनुदान R133-A12270) और novo nordisk फाउंडेशन (अनुदान NNF0C0028664) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों [3एच] रेडियोलिगंड की आपूर्ति के लिए डॉ aleš मारेक धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४५ रेडियोलीगैंड रेडियोधर्मी स्वत आदिचित्रण अपनत्व अभिव्यक्ति फॉस्फर इमेजिंग हॉपीसीए γ-hydroxybutyric एसिड ghb ncs-३८२ मात्रात्मक भेषजगुण
स्वरांकन चित्रण और औषधीय लक्ष्यों के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और शक्तिशाली विधि के रूप में
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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