Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Autoradiografi som en enkel och kraftfull metod för visualisering och karakterisering av farmakologiska mål

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Metoden för autoradiografi används rutinmässigt för att studera bindning av radioligands till vävnadssnitt för bestämning av kvalitativa eller kvantitativa farmakologi.

Abstract

In vitro autoradiografi syftar till att visualisera anatomiska fördelningen av ett protein av intresse i vävnad från experimentella djur liksom människor. Metoden bygger på den specifika bindningen av en radioligand till sitt biologiska mål. Därför frysta vävnadssnitt inkuberas med radioligand lösning och bindningen till målet är därefter lokaliserade genom påvisande av radioaktivt sönderfall, exempelvis med hjälp av ljuskänsliga filmen eller fosfor imaging plattor. Resulterande digital autoradiograms Visa anmärkningsvärda rumsliga upplösningen, vilket möjliggör kvantifiering och lokalisering av radioligand bindning i skilda anatomiska strukturer. Dessutom tillåter kvantifiering för farmakologiska karakterisering av liganden affinitet med hjälp av dissociation konstanter (Kd), hämning konstanter (Kjag) samt tätheten av bindningsställen (Bmax) i valda vävnader. Metoden ger alltså information om både målet lokalisering och ligand selektivitet. Här exemplifieras tekniken med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet γ-verkan syra (GHB) bindande platser i däggdjur hjärnvävnad, med särskild tonvikt på metodologiska överväganden angående bindande analysen parametrar, valet av radioligand och identifieringsmetoden.

Introduction

Autoradiografi är en metod som ger bilder av radioaktivt sönderfall. Tekniken används rutinmässigt för att studera vävnad fördelningen av ett protein med intresse i vitro som baserat på en specifik farmakologisk interaktion mellan en radioaktivt märkt substans och dess mål. Detta ger direkt information om selektivitet av liganden för målet. In vitro autoradiografi kan också användas för kvantitativ bestämning av farmakologiska bindande parametrar för radioligands, såsom dissociationskonstant (Kd) och täthet av bindningsställen (Bmax), samt för att fastställa den hämning konstanten (Ki) konkurrerande ligander1,2. Jämfört med traditionella Homogenatet radioligand bindande, har autoradiografi fördelen av att kunna visualisera rumsliga anatomi och ge kortfattad information om regionala uttryck mönster3. Metoden för autoradiografi är därför ett relevant alternativ till immuncytokemi, särskilt i avsaknad av en validerad antikropp. Autoradiografi genomförs enkelt i en standard radioisotop laboratorium ges tillgång till en lämplig radioligand med krävs farmakologisk specificitet, tillgång till en mikrotom kryostat för att förbereda vävnadssnitt och en lämplig imaging enhet som kan analysera fördelningen av radioaktivitet i avsnitten respektive vävnad. Noterbart är ett viktigt urvalskriterium för radioligand en begränsad mängd bindning till icke-målorganismer platser. Detta kan vara att andra proteiner, membran eller material som plast eller filter, och benämns kollektivt som icke-specifik bindning. Vanligtvis, icke-specifik bindning är ej mättnadsbar men kan vara mättnadsbar om det innebär ett särskilt protein som off-target. Det bästa sättet för att validera sant specifik bindning är att jämföra med vävnader saknar målet, t.ex., genetiskt modifierade (knock-out) vävnad4.

Här, illustreras metoden som med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet bindningsstället för γ-verkan syra (GHB) i däggdjur hjärnan. Förstå farmakologiska samspelet mellan GHB och dess bindningsställe är relevant eftersom GHB är både en kliniskt användbar drog i behandling av narkolepsi och alkoholism5, men också en naturlig beståndsdel i däggdjur hjärnan och ett fritids drog6. Hög affinitet GHB bindningsställen beskrevs först använda [3H] GHB bindning till råtta hjärnan Homogenatet7. Med åren ytterligare autoradiografi studier med [3H] GHB och analogt [3H] NCS-382 har visat en hög täthet av bindningsställen i framhjärnan regioner av råtta8,9,10, mus9 , gris11och apa/mänskliga hjärnan12. Molekylär identitet och exakta funktionell betydelse av dessa bindande platser har dock förblivit svårfångad.

Med avsikten att ytterligare karakterisera de bindande platserna och för att underlätta studier om de fysiologiska roll GHB, flera radioligands införliva olika isotoper begåvad med olika tillhörighet har utvecklats ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA och [125jag] BnOPh-GHB)13,14,15,16(ses i17) (figur 1). Kombinationen av selektiv hög affinitet radioligands och en mycket hög täthet av bindningen platser har tillåtit för produktion av högkvalitativa bilder med hjälp av den fosfor som imaging teknik9,11. Tillsammans med en disposition av de praktiska punkterna att inrätta ett den autoradiografiska experiment och en illustration att exemplifiera detaljer, kommer att diskussionsavsnittet betona i) valet av radionuklid, ii) Val av assay villkor och iii) användningen av fosfor Imaging plattor kontra röntgenfilm. Det övergripande målet med detta dokument är att tillhandahålla vetenskapliga, tekniska och metodologiska detaljer på autoradiografi tekniken för att informera om vävnadsdistribution och farmakologiska analyser av protein mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurhantering utfördes i enlighet med riktlinjerna från den danska djur experiment inspektorat.

Obs: Det protokollet som beskrivs här omfattar vävnad förberedelse (dvsmus hjärnvävnad), in vitro- den autoradiografiska analysen i tillräcklig detalj för att ställa in metoden i ett nytt labb, exponering för fosfor imaging plattor som efterföljande Densitometrisk analys av autoradiograms (figur 2) med syftet att lokalisera och kvantifiera radioligand bindning i skilda anatomiska strukturer. Histologiska jämförelse ingår ett protokoll för tolyloxi violett färgning. Bestämning av icke-specifik bindning med en konkurrerande ligand är dessutom omfattas av protokollet. För en detaljerad beskrivning om hur du fastställer Kd, Bmax eller Kjag, se föregående publikation4.

1. vävnad förberedelse av kryosnitt

  1. Avliva musen av cervikal Dislokation och omedelbart dissekera ut hjärnan med hjälp av sax och pincett. Direkt vidare till nästa steg för att undvika vävnadsskada.
  2. Snapin-frysa vävnaden genom nedsänkning i pulverform torris, gasformiga CO2 eller isopentan. Direkt överföra fryst vävnad till en kryostat med temperaturen inställd på-20 ° C. Alternativt kan du lagra vävnaden vid-80 ° C tills bearbetning.
    Obs: Undvik upprepad upptining/frysning för att minska vävnadsskador.
  3. Låt vävnaden acklimatisera till-20 ° C i kryostaten i 20 min innan ytterligare behandling för att undvika vävnad splittring.
  4. Täcka vävnad innehavaren med inbäddning medium utanför kryostaten och snabbt placera fryst vävnad preparatet i önskad orientering medan inbäddning mediet är fortfarande flytande. Till exempel, Placera musen hjärnan vertikalt på lillhjärnan för att uppnå rostralt koronalt avsnitt. Överföra vävnad innehavaren tillbaka till kryostaten och exponera inbäddning medellång till temperaturer under-10 ° C vid härdning.
    Obs: Ömtålig vävnad preparatet ska vara belagd i inbäddning medium inom vävnad formarna innan montering.
  5. Ställning vävnad innehavaren i mikrotomen kryostaten. Justera orienteringen av vävnad att undvika sluttande sektioner.
  6. Skära vävnaden med ledning av en stereotaxic atlas18 i avsnitten i önskad tjocklek (12 µm rekommenderas för [3H] märkt ligander). Försiktigt räta och veckla upp avsnittet med en borste i liten storlek om det behövs och tö-mount avsnittet på ett objektglas. Sekventiellt samla avsnitten från regionen av intresse för önskad tekniska replikering (t.ex., 4 sektioner per bild).
  7. Tillåta avsnitten om bilderna ska lufttorka för 1 h innan vidare hantering.
    Obs: Tillägg av torkmedel material till bild lådor minimerar fukt bygga upp på vävnadssnitt. Protokoll kan pausas här genom att lagra sektioner långsiktiga i bild lådor vid-80 ° C.

2. in vitro autoradiografi

FÖRSIKTIGHET: radioaktivitet. Arbeta i ett certifierat laboratorium enligt lokala bestämmelser. Använd skyddskläder. Enlighet med radioaktivt sönderfall eller outsourca till ett certifierat företag.

  1. Tina avsnitten minst 30 minuter i rumstemperatur (RT). Märka bilder med experimentella förhållanden. Använd en penna eftersom bilderna kommer att badas i etanol under efterföljande färgning.
  2. Placera glasen horisontellt i Plastbrickor.
    Obs: Positionering diabilder på en upphöjd plattform inom Plastbrickor underlättar deras hantering.
  3. Pre incubate avsnitten monterad på bilder i analysbuffert justerat till målet i fråga (för GHB protokoll, 50 mM KHPO4 buffert pH 6.0 används) genom att försiktigt applicera en lämplig volym in i bilden (700 µL för 3-4 gnagare koronalt avsnitt).
    Obs: Se till att varje avsnitt är helt täckt med vätska.
    1. Täcka Plastbrickor med lock för att undvika avdunstning och Preinkubera vid relevanta temperatur (för GHB protokollet före incubate för 30 min vid RT) under konstant mild (20 rpm) skakar på en tallrik shaker.
    2. För bestämning av icke-specifik bindning, komplettera analysbuffert med relevanta koncentration av omärkta förening (för GHB protocol, 1 mM GHB).
      Obs: Före inkubering kan inte vara nödvändigt.
  4. Häll av före inkubering vätska från varje bild och överföra bilderna tillbaka till plastbehållaren.
  5. För att undvika uttorkning, omedelbart Inkubera avsnitten med relevanta koncentration av radioligand i analysbuffert önskade villkor (för GHB protokoll, 1 nM [3H] HOCPCA för 1 h på RT) genom att täcka avsnitten helt med radioligand lösningen (700 µL för 3-4 gnagare koronalt avsnitt).
    1. Inkubera under konstant mild (20 rpm) skakningar i Plastbrickor med stängt lock.
      Obs: Radioligand koncentrationen kan verifieras genom att räkna en alikvot i en flytande scintillationsräknare.
  6. Ta bort inkubation lösningen genom att hälla av vätskan och överför bilderna till en Mikroskop objektglashållaren. Genast fortsätta till nästa steg för att undvika avsnitt uttorkning.
  7. Tvätta bilderna. För protokollet GHB, tvätta med iskall analysbuffert två gånger för 20 s och skölj sedan två gånger genom att doppa objektglashållaren i magasinen fylld med iskall destillerat vatten för att avlägsna salter. Placera glasen vertikalt i rack för lufttorkning för minst 1 h i RT eller torr-bilderna för 5 min med en fläkt som anges till kall temperatur.
    Obs: Tvätt måste optimeras, t.ex., omfattande tvätt kan vara användbara för att minska icke-specifik bindning.
  8. Överföra bilder till en fixeringsanordning som innehåller paraformaldehyd (PFA) pulver för övernattning fixering med PFA ångor på RT för att skydda integriteten hos komplexet ligand-målet.
    Varning: PFA är giftiga. Positionthe fixeringsanordning i dragskåp huva och undvika hud/ögonkontakt med PFA.
  9. Följande dag, överföra bilder till en exsickator låda som innehåller kiselgel för 3 h på RT att eliminera fukt.

3. exponering för fosfor Imaging plattor och skanning

  1. Placera avsnitten i en strålning-skärmad imaging plate kassett med vävnaden uppåt. För efterföljande kvantifieringen av radioligand bindande, inkludera en [3H] hur provtagningsutrustningen skall i varje kassett. Ordna avsnitten slumpmässigt och exponera avsnitten för direkt jämförelse i samma kassett.
  2. Radera den tritium-känsliga fosfor imaging plate omedelbart före användning för att ta bort ackumulerade signaler från lagring och eliminera bakgrund signaler. Därför läsa in plattan i fosfor imaging maskin och utsätta det synliga/IR ljus enligt anvisningarna från tillverkaren.
  3. Avlägsna plattan från fosfor imaging maskin och placera den omedelbart på avsnitten i kassett. Kontrollera att kassetten är helt stängd. Exponera avsnitten till fosfor bildbehandling plattan i 3 dagar på RT skyddad från ljus.
  4. Eftersom ljus raderas signalen från bildbehandling plattan, försiktigt öppna kassetten i mörkret och omedelbart överföra bildbehandling plattan i den mörka rutan av en fosfor imager eller placera fosfor kameran i ett mörkt rum.
    Obs: Kontrollera att notate den rumsliga ordningen av bilderna under exponering för att identifiera enskilda exemplar på den digitala bilden efter analys. Därför Visa fosfor imaging plattor också ett hörn skär i en tydlig vinkel för att identifiera rätt orientering av plattan på den digitala bilden.
  5. Skanna på plattan på högsta upplösning möjligt att erhålla en digital bild.

4. valfritt: Tolyloxi violett färgning av vävnadssnitt

  1. Bered 1% tolyloxi violett lösning genom att blanda 5 g tolyloxi violett acetat i 500 mL avjoniserat vatten (dH2O) tills upplöst (cirka 2 h). Filtrera genom filterpapper med hjälp av en tratt i en ny 500 mL flaska. Justera pH till 3.5-3.8.
  2. Placera bilden färgning uppsättning under spiskåpa. Förbereda facken med följande lösningar i vit polypropylen brickor (förutom xylen):
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% etanol
    d. 100% etanol
    e. 100% dH2O
    f. 1% tolyloxi violett
    g. 0,07% ättiksyra (Lägg 175 µL av ättiksyra till 250 mL dH2O).
    h. 100% xylen i grön vätska-resistenta brickor
    i. 100% xylen i grön vätska-resistenta brickor
  3. Överföra bilder till en spiskåpa och placera dem i en objektglashållaren.
  4. Lös lipider genom ökande graderade serie av etanol i dH2O till 100% etanol (bricka a-d) genom att doppa glasen för 1 min.
  5. Rehydrera exemplaren till dH2O genom fallande koncentrationer av etanol (bricka a-d i omvänd ordning, följt av fack e) genom att doppa glasen för 1 min.
  6. Fördjupa exemplar tolyloxi violett lösningen i 10 min.
  7. Skölj exemplaren i 0,07% ättiksyra genom att lyfta bilderna upp och ner försiktigt i 4-8 s. tvätta bilderna genom att doppa i dH2O för 1 min.
  8. Torka exemplaren genom nedsänkning av bilderna för 30 s i stigande koncentrationer av etanol (bricka a-d).
  9. Överför exemplaren genom två brickor av 100% xylen (magasin h och jag) att släcka etanolen.
  10. Rehydrera exemplaren till dH2O genom fallande koncentrationer av etanol (bricka a-d i omvänd ordning, följt av fack e) genom att doppa glasen för 1 min.
  11. Ta bort bilderna från saltlösning med pincett. Lägg några droppar av organiskt lösningsmedel montering media per bild och ett 24 x 60 mm täckglas ovanpå för att skydda exemplar. Avlägsna luftbubblor mellan preparatet och täckglas genom att försiktigt trycka in på täckglaset.
    Obs: Håll återstående bilderna i xylen under montering att förhindra uttorkning.
  12. Torr-bilderna som övernattning i ett dragskåp på RT.
  13. Få en bild av preparatet med Mikroskop och 1,25 X-objektiv.

5. Densitometrisk analys av Digital bild

  1. Mäta relativ optiska densitet (stavar) varje kalibrering som standard från den [3H] hur provtagningsutrustningen skall med image analys programvara.
    1. Välj ett område av samma storlek för varje punkt i den [3H] hur provtagningsutrustningen skall använda ett verktyg för regionen skapa från menyalternativet regionen bestämning. Tilldela ett nummer till varje markerat område genom att klicka på nummer under menyobjektet etikett.
    2. Exportera OD-värdena för varje standard kalibreringen genom att klicka filen | E xportera | 2D regionen rapport. Överföring av ROD värden till ett kalkylblad och normalisera av storleken på det markerade området. Utför linjär regression för att erhålla en standardkurva för ytterligare Densitometrisk analys.
      Obs: Kontrollera att de utvalda områdena är märkta för att identifiera matchande spö värden och prover.
  2. Utföra kvantifiering av autoradiograms med hjälp av den egenutvecklade imaging programvara genom att välja regionen av intresse (ROI) med en Region skapande verktyg i varje avsnitt och mäta dess ODs. Välj samma region i varje avsnitt genom att skapa en mall för regionen av intresse, som kopieras och manuellt justeras för mindre ändringar i hjärnans anatomi för varje autoradiogram. Identifiera anatomi av ROI genom jämförelse av autoradiograms med en hjärna atlas18. När flera behandlingar jämförs, utföra analysen förblindade och randomiserade undvika ensidig urval av ROIs.
  3. Exportera ROD värden och storlekar av utvalda områden i ett kalkylblad genom att klicka filen | E xportera | 2D regionen rapport.
  4. Dela upp markerade ROI av dess område att få tätheten per specifikt område uppmätta stav.
  5. Mäta stav bakgrund av plattan och exportera motsvarande ROD värden och storlek i ett kalkylblad. Subtrahera den genomsnittliga bakgrund signalen från varje spö värdet av varje ROI.
  6. Genomsnittliga stängerna tekniska replikat, dvs., avsnitt replikerar använda vävnad från samma djur.
  7. Använda standardkurvan konvertera stavar i enheter av radioligand bindande, dvs., nCi/mg vävnad motsvarande (TE).
    Anmärkning: Termen TE används eftersom standarder genereras med material som simulerar vävnad.
  8. Express bindande genom omvandling av nCi/mg nmol/mg TE enligt specifika aktiviteten hos radioligand (ekvation 1).
    Equation(1)
  9. För att erhålla specifika bindande värden, subtrahera icke-specifik bindning från totala bindande.
  10. Genomsnittliga bindningen av varje biologisk replikera med hjälp av genomsnittet av tekniska replikerar varje djurs (erhålls i steg 5,6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genom att använda protokollet beskrivs, anatomiska fördelningen av de hög affinitet GHB bindningsställen var visualiseras med radioaktivt märkt GHB analoga [3H] HOCPCA i mus hjärnan, som var skuren i koronalt, sagittal och horisontella sektioner (figur 3 ). Höga nivåer av bindande observerades i hippocampus och hjärnbarken, lägre i striatum och ingen bindning identifierades i lillhjärnan, motsvarande tidigare rapporterade uttrycksmönster av hög affinitet GHB platser9,10, 11,12. Såsom visas här, de anatomiska strukturerna kan visualiseras med hjälp av olika snittningen plan och anatomiska integritet kan stödjas av tolyloxi violett missfärgning. För GHB hög affinitet bindningsställen bekräftas särskilt regioner med låg radioligand bindning, t ex lillhjärnan, med efterföljande färgning av vävnad (figur 3). Koronalt avsnitt finns oftast i litteratur9,10. De är praktiska för kvantitativa ändamål som en högre mängd sektioner kan erhållas från en hjärna. Sagittal och horisontella sektioner har fördelen av att visualisera bindande under större delen av gnagare hjärnan inom ett avsnitt vilket ger bra överblick. Figur 4illustrerar det evolutionära bevarandet av hög affinitet GHB bindande platser däggdjur hjärnan. [3H] HOCPCA bindningsställen upptäcktes hos mus, råtta samt som gris hjärnvävnad möjliggör jämförelse av brutto hjärnans anatomi mellan arter. Generellt evolutionära bevarande och regional fördelning studier får stöd avsevärt i karakterisering av ett protein av intresse, i det här fallet en roman mål, och därmed kan ge indikationer om dess fysiologiska funktionen19.

De hög affinitet GHB bindningsställen var utforskad med GHB radioligands, som visar olika tillhörighet för bindningsställen men jämförbara särskilda verksamheter (figur 5). [3H] HOCPCA var tidigare visat sig ha en Kd 74 nM, vilket är överlägsen den kommersiellt tillgängliga radioligand [3H] NCS-382 med en Kd av 697 nM, båda bestäms vid pH 6,0 av kvantitativa autoradiografi9. Således [3H] HOCPCA är begåvad med mycket högre känslighet, vilket leder till en utmärkt signal-brus-förhållande. På grund av lägre känslighet [3H] NCS-382, högre radioligand koncentrationer måste användas för att erhålla liknande nivåer av bindande (jämför y i figur 5). Jämfört med [3H] GHB, även högre radioligand koncentrationer (30 nM) är nödvändigt för att uppnå jämförbara bindande nivåer. Detta beror huvudsakligen på betydligt lägre affinitet (Kjag 4,5 µm) denna radioligand20. Men ökar högre radioligand koncentration också nivån på icke-specifik bindning9,10 med en följaktligen lägre signal-brus-förhållande. Denna serie experiment belyser vikten av att ha en hög affinitet radioligand för att producera högkvalitativa bilder.

Eftersom hög affinitet GHB webbplatser uttrycks till så höga nivåer i framhjärnan regioner (60 pmol/mg17), är bestämning av farmakologiska parametrar av mättnad kurvor till sin natur svårt med hjälp av standard tritium känsliga fosfor imaging plattor på grund av risken för överöstes bilder. Därför, Kd värden för [3H] HOCPCA och [3H] NCS-382 har erhållits genom första avgörande Kjag värdena av homologa deplacement kurvor och sedan beräkningen av Kd (figur 6)9. För de flesta radioligands vore ett alternativ att använda isotop-utspädning som sker rutinmässigt i Homogenatet bindande analyser. Dessutom har Kd värden bestämts vid olika pH-värden. Uppenbarligen, hög affinitet GHB sajterna märks mest effektivt vid pH 6,0 (figur 6A och figur 6 d), sedan ändra assay villkor till pH 7,4 väsentligen påverka ligand affinitet. Således, Kd för [3H] HOCPCA vid pH 7,4 är ca 30 gånger högre numeriskt än vid pH 6,0. Ökande pH ytterligare resulterar i en högre grad av icke-specifik bindning, som blir en varning när du använder [3H] NCS-382 där endast små mängder specifik bindning kan erhållas vid pH 7,4 (figur 6E). Detta hindrar nämligen fastställandet av farmakologiska parametrar med hjälp av denna radioligand vid Fysiologiskt pH9, igen illustrera kraften i att ha en radioligand med som hög affinitet som möjligt.

Figure 1
Figur 1: strukturer av radioligands inriktning på hög affinitet GHB bindningsställen. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-en karboxylsyra ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-hydroxi-5H- benzocyclohept-6-yliden ättiksyra (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 och [3H] γ-verkan syra ([3H] GHB)16 som Tritierat radioligands med jämförbara specifik aktivitet (20-40 Ci/mmol), samt [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125jag] BnOPh-GHB)13 med en uppskattad molar aktivitet av 2000 Ci/mmol21. GHB strukturella elementet markeras i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt av protokollet av i vitro autoradiografi. (1) djuret är euthanized, vävnad är dissekeras och snapin-fryst på torris. Vävnad är sedan sektioneras på ett kryostaten, tö-monteras på objektglas och (2) avsnitt inkuberas med radioligand tills jämvikt bindande. För bestämning av icke-specifik bindning kompletteras lösningar med en omärkta displacer en relaterade men inte identiska kemiska struktur. (3) därefter obundna radioligand avlägsnas genom tvättning i analysbuffert och salter avlägsnas genom sköljning med destillerat H2O. När sektioner är torra, utförs paraformaldehyd (PFA) fixering för att permanent upprätta ligand-protein interaktionen. Avsnitt utsätts sedan för fosfor imaging plattor. (4) efter tillräckligt exponeringstid genomsöks plattor för att få digitala autoradiograms. (5) Slutligen, bildanalys utförs med hjälp av definitionerna av regioner av intresse (ROIs) och bindningen är kvantifierad. I exemplet visas illustreras optiska densiteter (ODs) i delar av musen cortex (vänster) och hippocampus (mitten). Kvantifiering utförs genom att exponera sektioner tillsammans med en [3H] hur provtagningsutrustningen skall (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa autoradiograms 1 nM [3H] HOCPCA bindning till mus hjärnan sektioner. (A) Radioligand bindande till koronala, sagittal och horisontella vävnadssnitt att illustrera vikten av den snittning plan på synbarheten av anatomiska strukturer. (B) tolyloxi violett färgning av motsvarande vävnadssnitt att kontrollera anatomiska regioner, särskilt regioner med låg/frånvarande radioligand bindande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa autoradiograms 1 nM [3H] HOCPCA bindning i olika arter. Jämförelse av (A) råtta, mus (B) och (C) gris in vitro- autoradiograms för att illustrera evolutionära bevarande av bindande platser till kortikala och Hippocampus regioner tillsammans med brutto hjärnans anatomi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kvantifiering av bindningen till hög affinitet GHB bindande platser med olika känslighet för GHB radioligands av i vitro autoradiografi i hjärnan skivor från mus hjärnbarken och hippocampus. Totala bindande redovisas som fmol/mg vävnad motsvarande (TE) för radioligands (A), [3H] HOCPCA (1 nM) och (B), [3H] NCS-382 (7 nM) och (C), [3H] GHB (30 nM) (liknande specifika aktiviteter). Icke-specifik bindning identifierades inte i närvaro av 1 mM GHB eller 1 mM HOCPCA för någon av de radioligands (visas inte). Data presenteras som genomsnitt ± SD för fyra biologiska replikat varje utförd i tre tekniska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Representativa resultat av den autoradiografiska bestämning av K-d och Bmax värden av homologa konkurrenskraftiga förskjutning av [3H] HOCPCA och [3H] NCS-382 i mus kortikala sektioner vid pH 6,0 och pH 7,4 för att illustrera påverkan av pH på affinitet för radioligands. (K-d och Bmax beräknades med samma förening som radioligand och konkurrent, genom inledande fastställandet av Ki -värden22). (A) Autoradiograms med optimal signal-brus-förhållande för 1 nM [3H] HOCPCA bindande vid pH 6,0. (B) ändra buffert pH till 7,4 kräver en högre [3H] HOCPCA koncentration (8 nM) att nå betydande bindande nivåer. (C) resulterande log-koncentration bindande kurvor; menar ± SEM. (D), 5 nM [3H] NCS-382 bindande vid pH 6,0 resulterar i låg icke-specifik bindning, medan (E) 40 nM [3H] NCS-382 är otillräcklig för att få bindande vid pH 7,4. (F) resulterande log-koncentration bindande kurvor; menar ± SEM. Data erhölls från 3-4 biologiska replikat varje utförd i 3-5 tekniska replikat, endast [3H] NCS-382 experiment vid pH 7,4 utfördes med endast 2 biologiska replikat. För båda radioligands, 1 mM GHB användes för bestämning av icke-specifik bindning. För information om analys och beräkning av K-d och Bmax, se9. Denna siffra har anpassats och omtryckt från föregående publikation9 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvaliteten på en den autoradiografiska assay bestäms oftast av känsligheten hos radioligand. En viktig bidragande faktor är den valda radioisotop, som ges av tillgången till kända ligander eller av genomförbarheten av specifika märkning tekniker ge ligander med lämplig specifik aktivitet (dvs, det mängden radioaktivitet per enhet mol av en radioligand)23och med begränsade mängder kemisk nedbrytning. Ett stort antal radioligands av kända ligander är märkta med tritium9,10,24,25,26, som härleder flera fördelar. För det första, tritium (3H) kännetecknas av en lång halveringstid (12.43 år) att främja långsiktig lagring av enskilda partier. För det andra, ligand-target interaktionen inte snedvrids av radionuklid som 3H-ligander är biologiskt oskiljbara från deras överordnade föreningar. Tritium avger låg energi β–-partiklar, som resa endast korta sträckor i vävnad vilket resulterar i hög rumslig upplösning och, därefter, större skillnad mellan anatomiska strukturer4. Ändå, tritium märkning endast kan framställas för att ge måttligt höga specifika aktiviteter. Detta är på grund av att finns 3H-källor är förorenat med icke-radioaktiva väte. Generellt, ju högre specifik aktivitet, den mindre radioligand som behövs för att ge känslig detektion23. Dessutom bör det övervägas att 3H-ligander har möjlighet att genomgå väte utbyte med vatten beroende på stabiliteten av 3H-etikett. För att kompensera för låga uttryck eller för låg specifik aktivitet, kan jod-125 användas som radionuklid13. Maximal specifik aktivitet av jod-125 är ca 100 gånger högre än för tritium. Flera ytterligare överväganden måste dock göras när du arbetar med jod-125. Exempelvis inducerar tillägg av jod-125 normalt strukturella förändringar i molekylen som kan påverka interaktionerna som ligand-målet. Eftersom jod-125 har en halveringstid på 60 dagar, anses korrigering för daglig förfall för specifik aktivitet och kvantifiering av ligand-target interaktioner23. 125 Jag-ligander avger γ-fotoner och trots mycket högre känslighet, producera bilder med lägre upplösning. Detta beror på det omvända förhållandet mellan upplösning och den Max energin av isotopen (som diskuteras nedan). Slutligen, jämfört med tritium, ökad försiktighet iakttas vid hantering av jod-125 beror på den högsta energin av radionukliden.

Beroende på nukliden, kan vävnad snittjockleken påverka upplösning. Av låg energi β–-strålning av tritium begränsar sin vävnad räckvidd ca 5 µm på grund av självupptagenhet. Följaktligen påverkas inte kvantifiering av vävnad tjocklek när snittjockleken överstiger 5 µm27,28. Radioaktivt sönderfall av high-energy isotoper har däremot en större vävnad penetration, vilket resulterar i lägre upplösning eftersom ligander med ett större avstånd till upptäckt medium också bidrar till bilden bildning. Följaktligen, tunnare sektioner främja högre upplösning för high-energy radionuklider1.

Inrättandet av en den autoradiografiska protokollet kräver kunskap om optimala bindande villkor (t.ex., buffert, pH och temperatur) och farmakologiska parametrar för radioligand affinitet och kinetik. Om radioligand inte har präglats före, är förberedande studier nödvändiga29. Att välja en optimal radioligand koncentration styrs både av radioligand affinitet och överflödet av bindande platser. Normalt, används en koncentration som återspeglar 5 - 6 gånger Kd för att kontrollera att alla bindande platser är mättade30. En annan strategi syftar till att ge den högsta andelen totalt-till-icke-specifik bindning av att välja radioligand koncentrationer under Kd31 och spara radioligand lösning på samma gång. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart när bindningsstället är mycket rikligt i den undersökta vävnaden eftersom hög radioligand koncentrationer skulle öka chansen att oversaturating autoradiograms, som i fallet för [3H] HOCPCA och den hög affinitet GHB bindande platser9. Dessutom för att effektivt etikett hela befolkningen av proteinet riktade, bör radioligand helst binda till alla möjligt mål konformationer. Särskilt i receptorn autoradiografi, kan användning av agonister bara avslöja en partiell antalet totala receptorer eftersom några kan vara närvarande i låg affinitet agonist stater. Däremot visar neutrala antagonister mest ofta affinitet för alla receptor staterna26,29.

Dessutom utförs allmänt bindande experiment jämvikt bindande villkor. Därför, den tid som behövs för att nå jämvikt bindande på önskad experimentella villkor (fast radioligand koncentration, buffert och temperatur) bör bestämmas i föreningen experiment att säkerställa jämvikt bindande omfattas av den experiment4,23,30. Efter radioligand inkubation, obundna radioligand tvättas bort av flera inkubationer med Analysbuffert och vanligtvis följt av sköljning i destillerat H2O. Signal-brus-förhållanden kan optimeras genom att justera temperatur och tid beroende på den dissociation andelen radioligand26,30,31.

Radioligands kan visa bindning till icke-biologiska material, dvsicke-specifik bindning. Radioligand bindning till cellulära komponenter än det avsedda målet definieras som ospecifik bindning. Ospecifik bindning till den totala mängden radioligand bindande bidrag bedöms i närvaro av en konkurrerande omärkta ligand som mål samma bindande plats som radioligand. Som icke-radioaktiva föreningen (displacer) levereras i 10,000-fold överskott, det upptar bindningsstället och radioligand kan endast binda till off-target platser26,31,32. Avgörande, bör omärkta föreningen vara av en annan kemisk struktur än radioligand eftersom detta sänker risken för undantränger både specifika samt icke-specifik bindning23. Icke-specifik bindning som uppstår genom bindning till membran kan vara ett stort problem särskilt när det gäller ganska lipofila radioligands. I vissa fall kan omfattande tvätt förfaranden ta bort icke-receptor bunden radioligand och därför förbättra den specifika bindande nyckeltal29.

När du väljer en analysbuffert, är det viktigt att överväga effekten av jonstyrka och pH på ligand-target interaktionen. Speciellt elektrostatiska växelverkan mellan polar ligander och hydrofil komponenter av bindande platser påverkas av Joniska styrkan i bufferten. Därför kan tillskott med monovalenta eller tvåvärda joner påverka den effektiva affinitet konstant23,33. Om optimal buffert sammansättning för studerade ligand-målet interaktion är okänd, bör olika gemensamma buffertar utforskas i pilotförsök. Buffertar kan också kompletteras med antioxidanter såsom askorbinsyra och hämmare av förnedrande enzymer29,34. Dessutom joniseringen av särskilda grupper inom bindningsstället eller på liganden själv påverkas av pH och har viktiga effekter på konstanten jämvikt bindande, den kinetiska konstanter och icke-specifik bindning23,33. Till exempel illustrerar sondera den hög affinitet GHB bindande webbplats med olika GHB radioligands fint vikten av pH på denna bindande mål (figur 6). Kännetecknar den optimalt pH för ligand-receptor interaktionen kan också ge ledtrådar om vikten av målet i relation till dess biologiska relevans.

En annan kritisk faktor i digital autoradiografi är exponeringstiden, dvs, den tid som behövs för att uppnå mätbara autoradiograms genom att utsätta de radioaktivt märkta vävnadssnitt till fosfor imaging plattor. Uppskattningarna baseras på mängden radioaktivitet i provet, energi och halveringstiden för isotopen samt önskad signal-brus-förhållandet. I synnerhet långvarig exponering tid resulterar i mättade bilder och hög bakgrund signal. Förhöjd bakgrund signal kan minskas genom att lagra kassetter inom ledning-avskärmad miljöer för att undvika kosmisk strålning1,4. Dock om suboptimala autoradiograms uppnås, kan preparatet exponeras flera gånger, förutsatt att ligand-målet anläggningen är fast och halveringstiden för radionukliden tillåter det.

Fosfor imaging plattorna kan återanvändas och har en lång livslängd när hanteras korrekt, dvs, bockning bör undvikas och plattor bör förvaras i torr miljö. Hantering av fosfor imaging plattor styrs av deras känslighet för ljus och kosmisk strålning. Det är därför viktigt att radera plattan innan varje användning för att minimera bakgrund signal. Exponering av radioaktivt märkt vävnadssnitt för imaging plattorna görs i strålning-skärmad kassetter helt saknar ljus. När du överför plattan till skannern i slutet av exponeringstiden, bör ljus från omgivningen också undvikas även korta kontakt med vitt ljus minskar ackumulerade signal. Plattor bör dessutom scannas omedelbart efter avlägsnande av preparatet till undvika signal fading. En nackdel med att använda fosfor imaging plattor är potentiella uppkomsten av artefakter och kvarvarande 'spökbilder' efter upprepad användning av plattor1.

Arbeta med tritium kräver imaging plattor utan en skyddande beläggning för att tillåta låg energi strålningen att nå fosfor kristallerna. Tritium-känsliga fosfor imaging plattor är därför mer känsliga för förorening eller skada på grund av felaktig hantering. När förorenade, tritium-känsliga plåtar inte kan rengöras och måste bytas. Fixering av komplexet ligand-målet med PFA ånga minskar risken för nedsmutsning av plattan, förlänga dess livslängd. Uttorkning av vävnad efter fixering är dessutom ett viktigt steg eftersom tritium känsliga plåtar är känsliga för fukt. På grund av dess känsliga natur, bör tritium-känsliga plåtar inte användas för andra isotoper1,4. Däremot plattorna för high-energy isotoper såsom jod-125 är mer robust och deras yta kan även rengöras genom att torka med 70% etanol.

Radiosensitive filmen har traditionellt använts för spatial registrering av radioaktivt sönderfall. Medan bilder med hög upplösning kan erhållas, har film autoradiografi flera begränsningar. Förutom nödvändigheten av farliga kemikalier och ett mörkrum för utveckling kännetecknas röntgenfilm av ett smalt dynamik. Därför kan det vara nödvändigt att utsätta radiomärkt sektioner upprepade gånger med olika exponeringstider för att uppnå mätbara icke-mättade bilder35. Dessutom uppvisar röntgenfilm begränsad känslighet som leder till varaktig exponeringstider för prov märkta med låg energi isotoper, dvs. tritium förfall kan kräva flera månaders exponering. Låg känslighet i kombination med små linjära området gör tekniken extremt tidskrävande, särskilt när optimal assay villkor måste vara beslutsam första1,35.

Med utvecklingen av fosfor imaging plattor, har flera av dessa begränsningar varit adresserade35,36,37. Imaging plattorna tjäna till att tillfälligt lagra bilder av radioaktivt sönderfall, som representerar den rumsliga ordningen av radioligand i vävnad preparatet. Photostimulable BaFBr:Eu2+ fosfor kristaller används för att fånga radioaktiva energi som avges av provet, som hög energi strålning (t.ex. röntgen, gammastrålning eller beta partiklar) resultat i excitation av Eu2+ till Eu3+ och åtföljande svällning av utgivna elektronen i fosfor galler4,37. Utsätta bildbehandling plattan till synlig eller infraröd ljus vänder reaktionen, dvs fångade elektronen släpps och under omvandlingen av Eu3+ till Eu2+ luminiscens avges. Det utsända ljuset är proportionell mot mängden radioaktivitet och dess upptäckt av en Fotomultiplikator möjliggör skapandet av en digital autoradiogram37. Detta system ger en ökning i känslighet åtföljd av en markant minskning i exponeringstid från månader till dagar3. På toppen av det, ökas betydligt den linjära dynamikomfång, vilket minskar risken för överöstes bilder. Linjäritet ges inom fyra till fem tiopotenser och har validerats upprepade gånger3,35,36,37,38. Även om filmen autoradiografi ger fortfarande överlägsen rumslig upplösning, resulterade insatser i skanningsteknik i förbättring av upplösning från 300 till 25 µm (pixelstorlek), möjliggör detaljerad differentieringen mellan anatomiska regioner3. Sammantaget fosfor imaging plattor är att underlätta inköp av digitala autoradiograms både på grund av en ökad linjär räckvidd och känslighet. Minskad exponeringstid och en förenklad utveckling teknik betydligt leda till minskad tid för dataanalys som möjliggör högre genomströmning.

Jämfört med autoradiografi, kännetecknas användbar farmakologiska parametrar såsom affinitet och densitet också ofta av tillämpningen av radioligands i vävnad Homogenatet bindande analyser. Denna metod har fördelen att producera resultat genom att mäta β-utsända radioaktivt sönderfall med en liquid scintillation detektor i ett effektivt sätt2. Sådana analyser som utförs i ett flera tillvägagångssätt, exempelvis i 96 brunnar mikrotiter plattor, och är användbar för screening av bibliotek av föreningar och för ett större antal koncentrationsberoende relationer. Ovanpå det, mättnad analys med denna inställning är ofta mer genomförbart jämfört med autoradiografi, som visar en risk för överöstes bilder med hög radioligand koncentrationer. Dock kringgår utför homologa förskjutning av en fast låg radioligand koncentration med icke-radioaktiva ligander för att få K-d och Bmax problemet med övermättade bilder (figur 6)22. Homogenatet bindande och autoradiografi producerar liknande uppskattningar för ligand affinitet konstanter medan vävnad täthet av proteinet av intresse kan underskattas i Homogenatet bindande. Det har därför föreslagits att cellmembranet störningar samtidig med vävnad homogenisering kan resultera i receptorn förlust eller förändrad bindande villkor3,33. Fel i vävnad dissektion kan dessutom producera homogenates förorenat med vävnad från intilliggande hjärnregioner. I jämförelse är även komplexa bindande mönster i små kärnor visualiseras och deriverbar på grund av den rumsliga anatomiska upplösningen i autoradiografi3,33.

Immunohistokemi visualiserar också fördelningen av ett protein av intresse anatomiskt. Metoden är kapabel att producera bilder med högupplösta anatomiska, som diskret vävnad komponenter kan identifieras på cellnivå och även subcellulär nivå med hjälp av elektronmikroskopi. Uttrycksnivåerna bedöms baserat på intensiteten av färgningen. Ändå är absolut kvantifiering av uttrycksnivåerna svårt på grund av bristen på lämplig referens standarder39. Immunhistokemi är dessutom beroende av tillgängligheten av en selektiv, väl validerade antikroppar som ofta är ett problem i receptorn forskning.

Innan man beslutar om utför i vitro autoradiografi, måste flera överväganden göras. Först av allt, kan post mortem vävnad förberedelse inklusive snittning samt upprepad frysning och upptining påverka bevarandet av bindande platser2. Dessutom beror metoden på tillgängligheten av en adekvat radioligand, som visar hög affinitet och selektivitet för målet i fråga2. Radioligand bör inte Visa signifikant bindning till off-target platser, och det bör också visa en gynnsam kinetiska profilen. Detta är nödvändigt eftersom ligand-målet anläggningen måste bo intakt under tillämpningsområdet för experimentet. Dessutom när lämpliga icke-radioaktiva föreningar föreligger, kan införandet av radionukliden blivit en kritisk faktor. Således, molekyl av intresse bör utrustas med lämpliga funktionella grupper för effektiv radiomärkning, som möjliggör produktion av radioligands med tillräckligt hög specifik aktivitet och kemisk stabilitet40. En annan nackdel med i vitro autoradiografi är att metoden endast tillåter användning av ett djur en gång. Mer är elegant tillägget att i vivo imaging metoder såsom position emissions tomografi (PET), som gör upprepade skanning av samma djur och bestämning av beläggning och dynamisk bindning egenskaper. PET är särskilt värdefullt för studien av högre däggdjur41 och DOS optimering i prekliniska studier 42,43,44.

Flera ändringar i den autoradiografiska teknik utöka dess tillämpning både när det gäller karakterisering av farmakologiska mål i friska och sjuka stater samt i läkemedelsutveckling. Först av allt, har senaste framsteg i imaging teknik lett till utvecklingen av realtid autoradiografi. Gasdetektorer av α och β-partiklar undanröja behovet av imaging plattor eller film genom direkt mätning av nedbrytningar, därmed producera snabba digitala autoradiograms45.

Dessutom möjliggör i vitro autoradiografi studier av funktionaliteten hos G-proteinkopplade receptorer (varandra) ovanpå information om deras anatomiska distribution i postmortala vävnader. Denna variant av metoden innebär inkubation av vävnadssnitt med en radioaktivt märkt analog av guanosin trifosfat (GTP), dvs [35S] guanosin 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), tillsammans med en icke-radioaktiva agonist av GPCR. När agonist binder och framkallar en reaktion på GPCR, införlivandet av [35S] GTPγS kan vara lokaliserade och kvantifieras via autoradiografi, som återspeglar endast de aktivera receptorn befolkningen2,46,47 .

Ex vivo autoradiografi representerar en annan version av tekniken, som bedömer den regionala bindningen av en radioligand efter administrering till ett levande experimentella djur. Efter offrandet av djur, kryosnitt av vävnad i fråga och den autoradiografiska exponering resultat i autoradiograms som återspeglar den radioligand bindande i vivo2. Ex vivo autoradiografi används vanligen inom drug discovery och utveckling program för att få information om den farmakokinetiska profilen av en ledande förening, dvs dess absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) . Särskilt hela kroppen autoradiografi ger insikt om narkotika distribution till alla organ och vävnader. Bestämning av icke-specifik bindning och kvantifiering är svårare jämfört med i vitro autoradiografi på grund av möjliga ämnesomsättning och nedbrytning av radioligand dock och inga medel för att tvätta bort obundna ligand48.

Autoradiografi används också för Preliminär testning och karakterisering av sällskapsdjur ligander4. De high-energy radionuklider kol-11 och fluor-18 används oftast för PET-ligander. PET är en framstående, icke-invasiv program för radioligands eftersom kvantifierbara 3D-bilder av den radioligand bindande i ett levande djur kan erhållas11,40,49.

In vitro autoradiografi med fosfor imaging plattor representerar en värdefull analys metod för farmakologiska karakterisering av ligand-target interaktioner. Metoden ger reproducerbara resultat vid anställningen av en relativt snabb och enkel protokollet när optimal assay villkor har fastställts. Anatomiska distribution av ett protein av intresse bestäms inom dess infödda mikromiljö, vilket gör studien av dess farmakologiska, fysiologiska och patologiska roll i friska och sjuka post mortem vävnad försöksdjur samt människor2,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Arbetet stöds av stiftelsen Lundbeck (Grant R133-A12270) och Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Författarna tackar Dr. Aleš Marek för leverans av [3H] radioligand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

Neurovetenskap fråga 145 Radioligand radioaktivt autoradiografi affinitet uttryck fosfor imaging HOCPCA γ-verkan syra GHB NCS-382 kvantitativa farmakologi
Autoradiografi som en enkel och kraftfull metod för visualisering och karakterisering av farmakologiska mål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter