Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Abstract

Vitro autoradiography deneysel hayvan hem de insan dokudan ilgi bir proteinin anatomik dağılımını görselleştirmenizi amaçlamaktadır. Bu yöntem bir radioligand biyolojik hedefine için belirli bağlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, donmuş doku bölümleri radioligand çözüm ile inkübe ve bağlama hedef için daha sonra radyoaktif bozunma, algılama tarafından Örneğin, ışığa duyarlı film ya da fosfor plakaları Imaging kullanarak yerelleştirilmiştir. Elde edilen dijital autoradiograms miktar ve yerelleştirme radioligand bağlama farklı anatomik yapılar sağlar olağanüstü Uzaysal çözünürlük görüntüler. Ayrıca, miktar ligand afinite farmakolojik karakterizasyonu için ayrılma sabitleri (Kd), inhibisyon sabitleri (Kben) yanı sıra bağlayıcı siteleri (Bmax) seçili dokularda yoğunluğu aracılığıyla izin verir. Böylece, belgili tanımlık yöntem hedef Yerelleştirme ve ligand seçicilik hakkında bilgi sağlar. Burada, teknik autoradiographic karakterizasyonu siteleri bağlama tahlil ile ilgili metodolojik konuları üzerinde durularak memeli beyin dokusu içinde bağlama yüksek afinite γ-hidroksibütrik asit (GHB) örneği Parametreler, radioligand ve algılama yöntemi seçimi.

Introduction

Autoradiography radyoaktif bozunma görüntüleri sağlayan bir yöntemdir. Tekniği rutin bir protein radiolabelled bir bileşik ve hedefine arasında belirli bir farmakolojik etkileşim temel faiz vitro doku dağılımı incelemek için kullanılır. Bu hedef için ligand selectivity hakkında doğrudan bilgi sağlar. Vitro autoradiography de radioligands, bağlayıcı siteleri (Bmax), yoğunluğu ve ayrışma sabiti (Kd) gibi parametrelerin farmakolojik bağlama kantitatif tayin yanı sıra belirlemek için kullanılabilir rakip ligandlar1,2inhibisyon sabiti (Ki). Geleneksel homogenate radioligand bağlama için karşılaştırıldığında, autoradiography kayma anatomi görselleştirmek için güçlü olmak ve bölgesel ifade kalıpları3özlü ayrıntılarını veren avantajına sahiptir. Autoradiography yöntemi bu nedenle özellikle doğrulanmış bir antikor yokluğunda immunocytochemistry ilgili bir alternatiftir. Autoradiography kolayca uygun bir radioligand durumu ile gerekli farmakolojik özgüllüğü, doku bölümleri ve uygun bir görüntüleme hazırlanması için bir microtome cryostat erişim verilen bir standart Radyoizotop laboratuvar uygulanır radyoaktivite kendi doku bölümlerde dağıtım analiz yapabiliyor aygıt. Özellikle, bir önemli seçim radioligand için sınırlı bağlama hedef olmayan sitelere bir kriterdir. Bu diğer proteinler, membran veya plastik veya filtreler gibi maddeler olabilir ve toplu non-spesifik bağlama olarak anılacaktır. Genellikle, non-spesifik bağlama saturable olmayan ama belirli bir hedef kapalı protein içeriyorsa saturable olabilir. Doğru belirli bağlama doğrulama için en iyi yolu (knock-out) doku4hedef örneğin, genetik olarak eksik dokuların karşılaştırmak için tasarlanmış olduğunu.

Burada, metodoloji γ-hidroksibütrik asit (GHB) memeli beyinde yüksek afinite bağlama sitesine autoradiographic karakterizasyonu gösterilmektedir. GHB hem klinik olarak yararlı bir ilaç tedavisi Narkolepsi ve alkolizm5, aynı zamanda doğal bir kurucu memeli beyin ve bir eğlence olduğu gibi farmakolojik etkileşim GHB ve bağlama sitesi arasında alaka en önemli noktadır uyuşturucu6. Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri ilk [3H] GHB bağlama sıçan beyin homogenate7kullanarak açıklanan. Yıllar içinde autoradiography çalışmaları [3H] ile daha fazla GHB ve analog [3H] NCS-382 siteler fare8,9,10, fare9 ön bölgelerinde bağlama yüksek yoğunluklu gösterdi ,11ve maymun/insan beyin12domuz. Ancak, bu bağlama sitelerin tam işlevsel alaka ve moleküler kimlik zor kalmıştır.

Daha fazla bağlayıcı siteleri niteleyen ve GHB fizyolojik rolü üzerinde çalışmalar kolaylaştırmak için niyeti ile birden çok radioligands farklı benzeşim ile donatılmış farklı izotoplar birleşmeyle geliştirilmiştir ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA ve [125ben] BnOPh-GHB)13,14,15,16(17' gözden) (şekil 1). Siteleri görüntüleme tekniği9,11fosfor kullanarak yüksek kaliteli görüntüleri üretimi için izin bağlama çok yüksek doku yoğunluğu ve seçmeli yüksek benzeşme radioligands birleşimi. Autoradiographic deney ve bir örnek ayrıntıları örneklemek için ayarlama içinde pratik noktaları bir taslağını ile birlikte, i) radyonüklid seçimi, ii) tahlil koşullar seçimi ve III) fosfor kullanımı tartışma bölümünde vurgulamak olacaktır Röntgen film karşı plakaları görüntüleme. Bu yazıda genel amacı autoradiography tekniğine doku dağıtım ve protein hedeflerin farmakolojik analizleri hakkında bilgilendirmek için teknik, metodolojik, bilimsel bilgileri sağlamaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan işleme Danimarka hayvan deney Müfettişliği yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

Not: Burada açıklanan protokol doku hazırlık (Yani, fare beyin dokusu), vitro autoradiographic tahlil kurma yöntemi yeni bir laboratuvarda, tabak Imaging fosfor maruz için yeterli ayrıntılı kapsar yanı sıra autoradiograms (Şekil 2) sonraki densitometric analizi Yerelleştirme ve farklı anatomik yapıları bağlamasında radioligand miktarının amacı ile. Histolojik karşılaştırma için Kresil Menekşe boyama için bir protokol dahil edilir. Ayrıca, non-spesifik bağlama rakip bir ligand ile belirlenmesi protokolde yer alır. Kd, Bmax veya Kbenbelirleme hakkında ayrıntılı bir açıklama için bkz: önceki yayın4.

1. doku hazırlık Cryosectioning tarafından

  1. Fare tarafından servikal çıkığı ötenazi ve hemen makas ve forseps kullanarak beyin incelemek. Doğrudan doku hasarı önlemek için bir sonraki adıma geçin.
  2. Ek-doku batma tarafından toz kuru buz, gaz halinde olan yakıtlar CO2 veya isopentane donma. Doğrudan transfer donmuş doku bir cryostat ile sıcaklığı-20 ° c için ayarla Alternatif olarak,-80 ° C'de doku işleme kadar saklayın.
    Not: tekrarlanan çözdürme/doku hasarı azaltmak için dondurma kaçının.
  3. Doku doku yıkıcı önlemek için daha fazla alay önce 20 min cryostat-20 ° C'de alışmana izin.
  4. Cryostat dışında gömme orta ile doku tutucu kapak ve gömme orta hala sıvı ise hızlı bir şekilde istenen yönde donmuş doku örneği yerleştirin. Örneğin, dikey olarak beyincik üzerine fare beyin rostral koronal bölümler elde etmek için koyun. Geri cryostat için doku tutucu aktarmak ve sıcaklığa aşağıdaki gömme orta-10 ° C sertleştirme için maruz.
    Not: Kırılgan doku örneği orta montaj önce doku kalıpları içinde katıştırma kaplı olması.
  5. Doku tutucu cryostat microtome içinde konumlandırın. Eğimli bölümlerde önlemek için doku yönünü ayarlayın.
  6. İstediğiniz kalınlıkta bölümlerini stereotaksik atlas18 rehberliğinde doku kesmek (12 µm [3için H] tavsiye ligandlar etiketli). Dikkatli bir şekilde düzeltmek ve küçük boyutlu bir fırçayla bölümünü gerekirse açılmak ve tezcan-bölüm bir mikroskop slayt üzerine monte. Ardışık olarak istenen teknik çoğaltma (örneğin, slayt başına 4 bölüm) için ilgi bölgesinden bölümleri toplamak.
  7. 1 h için daha fazla tutmadan önce kurumasını slaytlardaki bölümler de olanak sağlar.
    Not: Ek slayt kutularına nem alıcı malzemenin doku bölümlerinde nem inşa en aza indirir. Alınırken burada-80 ° C'de slayt kutularındaki bölümleri uzun vadeli depolayarak duraklatılmış

2. vitro Autoradiography

Dikkat: radyoaktivite. Yerel düzenlemelere göre sertifikalı bir laboratuarda çalışmak. Koruyucu giysi giyin. Radyoaktif bozunma uygun olarak imha etme veya sertifikalı bir şirkete dış kaynak.

  1. Bölümler için en az 30 dk (RT) oda sıcaklığında erimek. Slaytlar deneysel koşullar ile etiketleyin. Slaytları etanol sonraki boyama sırasında banyo çünkü bir kalem kullanın.
  2. Slaytları yatay olarak plastik tepsilerde yerleştirin.
    Not: slaytlar plastik tepsi içinde yükseltilmiş platformda konumlandırma kullandıklarında daha kolaylaştırır.
  3. (GHB protokolü, 50 mM KHPO4 tampon pH 6.0 kullanılan için) önceden incubate tahlil arabellek slaytları monte bölümleri hedef söz konusu dikkatle slayt (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL) uygun bir birimi uygulayarak ayarlanabilir.
    Not: her bölüm tamamen sıvı ile kaplıdır emin olun.
    1. Plastik tepsi buharlaşma önlemek ve sürekli hafif (20 devir/dakika) bir tabak shaker sallayarak altında (GHB protokolü için RT, 30 dk önceden incubate için) ilgili sıcaklığında önceden kuluçkaya için bir kapak ile kapak.
    2. Non-spesifik bağlama belirlenmesi için tahlil arabellek etiketsiz bileşik (için GHB protokolü, 1 mM GHB) ilgili konsantrasyonu ile ek.
      Not: Ön kuluçka gerekli olmayabilir.
  4. Her slayt sıvıdan ön kuluçka kapalı dökün ve slaytları plastik tepsiyi aktarın.
  5. Kurutma önlemek için hemen radioligand tahlil arabelleği istenen koşullar altında ilgili konsantrasyonu bölümlerle kuluçkaya (GHB protokolü, 1 nM [3H] HOCPCA RT, 1 h için) radioligand tamamen bölümlerle kapsayan tarafından çözüm (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL).
    1. Altında kapalı Kapaklı plastik tepsilerinin sürekli hafif (20 devir/dakika) sallayarak altında kuluçkaya.
      Not: Bir aliquot bir sıvı mercek Counter sayarak radioligand konsantrasyon doğrulanabilir.
  6. Ve slaytlar mikroskop slayt raf transfer kuluçka çözüm sıvı dökerek çıkarın. Hemen bölüm kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.
  7. Slaytları yıkayın. GHB iletişim kuralı için buz gibi tahlil arabellek 20 s ve sonra durulama için iki kez iki kez slayt raf tuzları kaldırmak için buz gibi soğuk distile su kanalları içine daldırma tarafından yıkayın. Slaytları dikey olarak en az 1 h RT için air-drying için raflar yerleştirin veya kuru bir üfleyici ile 5 min için slaytlar için soğuk sıcaklık ayarlayın.
    Not: Çamaşır optimize edilmiş olması gerekir, örneğin, geniş çamaşır non-spesifik bağlama azaltmak için yararlı olabilir.
  8. Slaytları ligand-hedef karmaşık bütünlüğünü korumak için paraformaldehyde (PFA) toz ile İngiltere'de yılın buharları RT adlı gecede fiksasyon için içeren bir fiksatör aktarın.
    Dikkat: PFA zehirlidir. Positionthe fiksatör hood duman ve İngiltere'de yılın cilt/göz temasından kaçının.
  9. Ertesi gün, slaytları RT nem ortadan kaldırmak için 3 h için silika jel içeren bir desiccator kutusu aktarın.

3. fosfor görüntüleme plakaları ve tarama maruz

  1. Bölümleri görüntüleme plaka radyasyon korumalı kaset içinde bir doku yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İçin sonraki miktar radioligand bağlama [3H] microscale her kasete içerir. Rasgele bölümleri düzenlemek ve doğrudan karşılaştırma aynı kaset için bölümleri bulaşmasına neden.
  2. Birikmiş sinyalleri deposundan kaldırmak için plaka kullanımdan hemen önce Imaging trityum duyarlı fosfor silmek ve arka plan ortadan kaldırmak için sinyal gönderir. Bu nedenle, plaka fosfor görüntüleme makineye yüklemek ve görünür/kızılötesi üreticinin yönergelerine göre ışık için maruz kalmaktadır.
  3. Fosfor görüntüleme plaka çıkarın ve hemen kaset bölümlerde üzerine yerleştirin. Kaset tamamen kapalı olduğundan emin olun. Fosfor görüntüleme plaka bölümlerine gelen ışık korumalı RT 3 gün için ortaya çıkarmak.
  4. Işık sinyal görüntüleme plaka siler çünkü dikkatle kaset karanlıkta açın ve hemen görüntüleme plaka fosfor Imager koyu kutu aktarmak veya fosfor Imager karanlık bir odaya yerleştirin.
    Not: dijital görüntü üzerinde bireysel numune analiz sonra tanımlamak için mekansal düzenleme slaytları pozlama sırasında notate emin olun. Bu nedenle, fosfor görüntüleme tabaklar da bir köşe amacıyla dijital resim tabağa doğru yönünü belirlemek için farklı bir açı kesmek görüntüleyin.
  5. Plaka dijital bir görüntü elde etmek olası en yüksek çözünürlükte tarama.

4. isteğe bağlı: Kresil doku bölümlerini Menekşe boyama

  1. Kresil Menekşe asetat 500 mL deiyonize su (dH2O) içinde 5 g karıştırılarak % 1 Kresil Menekşe çözüm hazırlamak (yaklaşık 2 h) eriyene kadar. Bir huni yeni bir 500 mL şişe kullanarak bir filtre kağıdı ile filtre. PH 3.5-3,8 için ayarlayın.
  2. Duman başlık altında slayt boyama konumunu belirleyin. Tepsiler beyaz Polipropilen tepsiler (Ksilen dışında) aşağıdaki çözümleri ile hazırlayın:
    a. %50 ethanol/50% dH2O
    b. %70 ethanol/30% dH2O
    c. %100 etanol
    ö. %100 etanol
    e. %100 dH2O
    f. %1 Kresil Menekşe
    g. %0,07 Asetik asit (dH2O için 250 mL asetik asitin 175 µL ekleyin).
    h. %100 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine
    Ben %100 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine
  3. Duman başlık slaytları aktarmak ve bir slayt rafa koyun.
  4. Lipidler dH2O etanol artan kademeli dizi 1 dk slaytlarını daldırma tarafından % 100 etanol (tepsi a-d) geçiyoruz.
  5. Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.
  6. Numunelerin Kresil Menekşe çözüm için 10 dk içinde bırakın.
  7. Örnek slaytlar dH2O için 1 dk içinde daldırma tarafından yukarı ve aşağı slayt 4-8 s. yıkama için hafifçe kaldırarak % 0.07 Asetik asit durulayın.
  8. 30 slaytlarını daldırma tarafından numuneler kurutmak etanol (tepsi a-d) konsantrasyonları artan s.
  9. Numunelerin % 100 Ksilen (tepsi h ve ben) etanol gidermek için sahip iki kanalları aracılığıyla aktarın.
  10. Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.
  11. Slaytları Forseps ile serum kaldırın. Organik çözücü slayt başına ortam takma birkaç damla ekleyin ve bir 24 x 60 mm coverslip numuneler korumak için üstüne ekleyin. Hava kabarcıkları numune ve coverslip arasında yavaşça coverslip basarak kaldırın.
    Not: kalan slaytlar kurutma önlemek için montaj sırasında Ksilen içinde tutun.
  12. Slaytları bir duman başlıklı RT., Kuru gecede
  13. Örnek bir resmini elde etmek mikroskop ve 1,25 X amacı ile.

5. densitometric dijital görüntü analizi

  1. Her kalibrasyon standart [3H] microscale bir görüntü analiz yazılımı ile gelen göreli optik yoğunlukları (çubuklar) ölçmek.
    1. Menü öğesi Bölge belirlenmesiiçin Bölge oluşturma aracıyla [3H] microscale her noktası için eşit büyüklükte bir alan seçin. Bir sayı sayı üzerine Etiketmenü öðesi altýnda tıklayarak seçili her alanına atamak.
    2. Tıklatarak her nokta kalibrasyon standart OD değerleri verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu. ÇUBUK değerleri bir e-tabloya aktarmak ve seçili alanın büyüklüğüne göre normalize. Daha fazla densitometric çözümleme için standart bir eğri elde etmek için doğrusal regresyon gerçekleştirmek.
      Not: Seçilen alanları eşleşen ROD değerleri ve örnekleri belirlemek için etiketli emin olun.
  2. Özel bölge seçerek görüntüleme yazılımı kullanarak autoradiograms miktar gerçekleştirmek her bölümünde bir Bölge oluşturma aracını kullanarak ve onun ODs ölçme faiz (ROI). Aynı bölge için bölge ilgi hangi bol ve el ile beyin anatomisi her autoradiogram için küçük değişimler için ayarlanmış bir şablon oluşturarak her bölümünde seçin. ROI anatomisi ile bir beyin atlas18autoradiograms kıyasla tanımlayın. Birden çok tedavileri karşılaştırıldığında, kör ve önyargılı ROIs yelpazesi önlemek için randomize çözümlemesi gerçekleştirin.
  3. ÇUBUK değerlerini ve boyutlarını Seçilen alanların tıklatarak bir elektronik tabloya verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu.
  4. Belirli alan başına yoğunluğu elde etmek için seçilen Roi onun alanına göre ölçülen ROD bölün.
  5. Arka plaka çubuk ölçmek ve ilgili ROD değerleri ve alan boyutu bir elektronik tabloya dışa aktarın. Her yatırım Getirisi her çubuk değerinden ortalama arka plan sinyal çıkarma.
  6. Ortalama teknik çoğaltır, Yani, Bölüm başlıkları aynı hayvan dokudan kullanarak çoğaltır.
  7. Çubuklar radioligand bağlama, i.ebirimlerine dönüştürmek için standart eğri kullanın., ncı/mg doku eşdeğerleri (TE).
    Not: standartları doku simüle malzemelerle üretilen çünkü terim TE kullanılır.
  8. Bağlama nmol/mg TE ncı/mg dönüşüm tarafından radioligand (Denklem 1) özel faaliyetin göre hızlı.
    Equation(1)
  9. Belirli bağlama değerleri elde etmek için non-spesifik bağlama toplam bağlama çıkarma.
  10. Ortalama ortalama teknik kullanarak her biyolojik REPLICATE bağlama (Adım 5.6 elde edilen) her hayvan çoğaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri anatomik dağıtımını radiolabelled GHB analog [3H] ile görüntülenmiştir koronal, sagittal ve yatay bölüme (şekil 3 kesildi fare beynindeki HOCPCA ). Yüksek yüzey-in bağlama Hipokampus ve korteks gözlendi, alt striatum bağlamasında ve hiçbir bağlama beyincik içinde yüksek-benzeşme GHB siteleri9,10önceki bildirilen ifade desenleri karşılık gelen algılandı, 11,12. Burada gösterildiği gibi anatomik yapıları farklı parça uçak kullanarak görüntülenmeyecektir ve anatomik bütünlük Kresil Menekşe boyama tarafından desteklenmiyor olabilir. GHB yüksek afinite bağlayıcı siteleri için özellikle düşük radioligand bağlama, beyincik gibi bölgeleriyle sonraki dokusunun (şekil 3) boyama ile onaylanır. Koronal bölümler en sık edebiyat9,10' bulunur. Bölümler daha yüksek bir miktarda bir beyin elde edilebilir gibi nicel amaçlar için pratik vardır. Sagittal ve yatay bölümleri bağlama kemirgen beyin böylece büyük genel bakış sağlayan bir bölüm içindeki en boyunca görselleştirme avantajına sahip. Şekil 4yüksek afinite GHB bağlayıcı siteleri memeli beyinde evrimsel korunması göstermektedir. [3H] HOCPCA bağlayıcı siteleri fare, fare de olduğu gibi karşılaştırma türler arasında brüt beyin anatomisi etkinleştirme domuz beyin dokusu içinde tespit edildi. Genellikle, evrimsel koruma ve bölgesel dağıtım çalışmaları önemli ölçüde ilgi, bu durumda bir protein karakterizasyonu içinde bir roman hedef yardımcı olabilir ve böylece onun fizyolojik fonksiyon19hakkında endikasyonları verebilir.

Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri için bağlayıcı siteleri ama karşılaştırılabilir belirli etkinlikleri (şekil 5) farklı benzeşim görüntülemek GHB radioligands ile probed. [3H] HOCPCA daha önce gösterilen 74 Kd için piyasada bulunan radioligand [3H] üstündür nM NCS-382 697, bir Kd nM, hem de belirlenen pH 6.0 nicel autoradiography9. Böylece, [3H] HOCPCA önde gelen mükemmel bir sinyal-gürültü oranı çok daha yüksek hassasiyet ile donatılmış. [3H] NCS-382, daha yüksek radioligand daha düşük duyarlılık nedeniyle konsantrasyonları benzer bağlama düzeyini elde etmek için kullanılmalıdır ( şekil 5' te Axes karşılaştırın). [3H] karşılaştırıldığında GHB, hatta daha yüksek radioligand konsantrasyonları (30 nM) karşılaştırılabilir bağlama seviyeleri elde etmek gereklidir. Ağırlıklı olarak anlamlı derecede düşük benzeşimi bu radioligand20nedeniyle (Kben 4,5 µM ile) bu. Ancak, daha yüksek radioligand konsantrasyonu da belirsiz bağlama9,10 sonuç olarak daha düşük bir sinyal-gürültü oranı ile düzeyini artırır. Bu dizi deney yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bir yüksek-benzeşme radioligand sahip olmanın önemi vurgulamaktadır.

Yüksek-benzeşme GHB siteleri ön bölgelerde (60 pmol/mg17) çok yüksek düzeylere ifade edilir, farmakolojik doygunluk eğrileri parametrelerin belirlenmesi standart trityum hassas fosfor Imaging'i kullanma doğal olarak zor çünkü Tabaklar doygun görüntüleri riski nedeniyle. Bu nedenle, değerleri Kd [3için H] HOCPCA ve [3H] NCS-382 elde edilen ilk belirleyici Kben değerlerle homolog deplasman eğrileri ve sonra hesaplama Kd (şekil 6)9. Çoğu radioligands için alternatif izotop-seyreltme rutin homogenate bağlama deneyleri içinde yapılır gibi kullanmak olacaktır. Ayrıca, Kd değerleri farklı pH değerlerinde tespit edilmiştir. Görünüşe göre yüksek afinite GHB siteleri en iyi şekilde pH 6.0 (şekil 6A ve şekil 6D) etiketli, beri pH 7.4 için koşullar önemli ölçüde değişen tahlil ligand afinite etkisi. Böylece, Kd [3H] için HOCPCA pH 7,4 olduğunu yaklaşık 30 kez pH 6.0 sayısal olarak daha yüksek. PH daha da artırmak sonuçları [3H] kullanan bir uyarı olur belirsiz bağlama daha yüksek bir derece NCS-382 nerede belirli bağlama yalnızca düşük miktarda elde edilebilir pH 7,4 (şekil 6E). Bu aslında fizyolojik pH9tekrar olarak mümkün olduğunca yüksek yakınlık ile bir radioligand sahip güç gösteren, bu radioligand kullanarak farmakolojik parametrelerini belirlenmesi engeller.

Figure 1
Şekil 1: yapıları yüksek afinite GHB bağlayıcı siteleri hedefleme radioligands. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-Batı karboksilik asit ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-hidroksi-5H- benzocyclohept-6-ylidene Asetik asit (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 ve [3H] γ-hidroksibütrik asit ([3H] GHB)16 tritiated radioligands ile karşılaştırılabilir belirli aktivite (20-40 CI/mmol) yanı sıra [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ olarak 125ben] BnOPh-GHB)13 2000'in tahmini molar etkinlik ile CI/mmol21. GHB yapısal öğesi kırmızı ile vurgulanacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Vitro autoradiography Protokolü şematik bakış. (1) hayvan ötenazi, doku disseke ve ek kuru buzda donmuş. Doku sonra tezcan-mikroskop slaytlar monte edilmiş bir cryostat üzerinde kesitli ve (2) bölüm radioligand ile denge bağlama kadar inkübe. Non-spesifik bağlama belirlenmesi için çözümleri ile ilgili ama aynı kimyasal yapısının etiketsiz bir displacer eklenmiştir. (3) daha sonra ilişkisiz radioligand çamaşır tahlil arabelleği tarafından kaldırılır ve tuzları distile H2ile O. durulama tarafından ortadan kalkar Bölümler kuru olduğunda, paraformaldehyde (PFA) fiksasyon kalıcı olarak ligand-protein etkileşim kurmak için gerçekleştirilir. Bölümleri sonra plakaları Imaging fosfor maruz kalır. (4) yeterli pozlama süresi sonra plakaları dijital autoradiograms elde etmek için taranır. (5) sonuçta, görüntü analizi faiz (ROIs) bölgelerinde tanımların kullanılarak gerçekleştirilir ve bağlama sayılabilir. Gösterilen örnekte, fare korteks (solda) ve Hipokampus (orta) kısımlarında optik yoğunlukları (ODs) gösterilmiştir. Miktar bölümler [3H] microscale (sağda) ile birlikte açarak yapılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: 1 nM [3H] HOCPCA bağlama fare için temsilcisi autoradiograms beyin bölümleri. (A)Radioligand koronal için bağlama, kesit önemini göstermek için sagittal yatay ve dikey doku bölümleri anatomik yapıları görünürlüğünü uçak. Anatomik bölgeler, özellikle düşük/radioligand bağlama yok bölgeleri doğrulamak için (B) Kresil ilgili doku bölümlerini boyama Menekşe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: 1 nM [3H] HOCPCA bağlama farklı türlerin temsilcisi autoradiograms. (A)sıçan, fare (B) ve (C) domuz vitro autoradiograms brüt beyin anatomisi ile birlikte kortikal ve Hipokampal bölgelerde siteleri bağlama evrimsel koruma göstermek için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Fare korteks ve Hipokampus miktar yüksek afinite GHB bağlayıcı siteleri için bağlama GHB radioligands vitro autoradiography beyin tarafından farklı duyarlılık ile dilim. Toplam bağlama radioligands (A) [3H] için fmol/mg doku eşdeğerleri (TE) olarak bildirilen HOCPCA (1 nM) ve (B) [3H] NCS-382 (7 nM) ve (C) [3H] GHB (30 nM) (benzer belirli faaliyetleri). Spesifik olmayan bağlama 1 mM GHB veya 1 mM için herhangi bir (gösterilmez) radioligands HOCPCA huzurunda tespit edilmedi. Veriler her üç teknik çoğaltır gerçekleştirilen dört biyolojik çoğaltır ± SD demek gibi sunulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Kd ve B homolog rekabetçi deplasman [3H]maksimum değerlerle autoradiographic belirlenmesi temsilcisi sonuçlarını HOCPCA ve [3H] NCS-382 pH 6.0 ve pH 7.4 için fare kortikal bölümlerde pH etkisi radioligands yakınlık göstermektedir. (Kd ve Bmax hesaplanan aynı bileşik radioligand ve rakip kullanarak,K ilk belirlenmesi ile22değerler ). En iyi sinyal-gürültü oranı 1 nM [3H] HOCPCA bağlama pH 6.0 için(a)Autoradiograms. (B) tampon pH 7.4 için değiştirmek [3H] HOCPCA yoğun gerektirir (8 mil) önemli bağlama düzeyleri ulaşmak için. (C) Resulting günlük-konsantrasyon bağlama eğrileri; Demek ± SEM (D) 5 nM [3H] NCS-382 bağlama pH 6.0 sonuç düşük non-spesifik bağlamada ise (E) 40 nM [3H] NCS-382 pH 7.4 bağlama edinmek yetersiz. (F) Resulting günlük-konsantrasyon bağlama eğrileri; Demek ± SEM veri--dan 3-4 biyolojik çoğaltır her 3-5 teknik çoğaltır, yalnızca [3H] NCS-382 deneyler pH 7.4 ile sadece 2 biyolojik çoğaltır gerçekleştirilen gerçekleştirilen elde edildi. Her iki radioligands 1 mM GHB non-spesifik bağlama belirlenmesi için kullanıldı. Analiz ve Kd ve Bmaxhakkında ayrıntılar için bkz:9. Bu rakam uyarlanmış ve Elsevier izniyle önceki yayın9 yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autoradiographic bir tahlil kalitesini en sık radioligand duyarlılık tarafından belirlenir. Bilinen ligandlar kullanılabilirliğini veya özel etiketleme teknikler fizibilite ligandlar uygun belirli aktivite ile (Yani, radyoaktivite miktarı verim verilir seçili Radyoizotop önemli bir faktör olduğunu bir radioligand birimi mol) başına23ve sınırlı miktarda kimyasal bozulması. Çok sayıda bilinen ligandlar radioligands hangi çeşitli yararları infers trityum9,10,24,25,26', etiketli. Öncelikle, trityum (3H) bireysel toplu işlemleri uzun süreli depolama teşvik bir uzun yarılanma ömrü tarafından (12.43 yıl) ile karakterizedir. İkinci olarak, 3H-ligandlar olduğu gibi onların üst bileşikleri biyolojik olarak ayırt edilemez ligand-hedef etkileşimi radyonüklid tarafından bozuk değil. Tritium yayar düşük enerji β--yüksek Uzaysal çözünürlük kaynaklanan doku kısa yolculuklar sadece parçacıklar ve daha sonra daha fazla ayrım arasında anatomik yapıları4. Yine de, trityum etiketleme sadece orta derecede yüksek belirli görevleri getirebilecek üretilmektedir. Mevcut 3H-kaynakları kirlenmiş nedeniyle gerçeğini radyoaktif olmayan hidrojen ile bu. Genel olarak, yüksek belirli aktivite, daha az radioligand hassas algılama23verim için gereklidir. Ayrıca, bu 3düşünülmelidir H-ligandlar var 3H-etiket kararlılığını bağlı olarak su ile hidrojen alışverişi geçmesi olasılığı. Düşük ifade veya çok düşük özel etkinlik için telafi etmek için iyot-125 radyonüklid13kullanılabilir. İyot-125 maksimal belirli etkinliği olduğunu bu trityum daha yüksek yaklaşık 100-fold. Ancak, birkaç ek konuları iyot-125 ile çalışırken yapılması gerekir. Örneğin, iyot-125 ilavesi normalde ligand-hedef etkileşimleri etkileyen molekül içinde yapısal değişikliklere neden olmaktadır. İyot-125 etkisi 60 gün sürer gibi günlük çürüğü için düzeltme belirli aktivite ve miktar ligand-hedef etkileşimleri23için düşünülmelidir. 125 Ligandlar γ-fotonlar tüketici ürünleri üretir ve çok daha yüksek hassasiyet rağmen daha düşük çözünürlüklü görüntüler üretmek. Bu çözünürlük ve izotop gibi (aşağıda açıklanmıştır) maksimum enerji arasında ters ilişki kaynaklanmaktadır. Son olarak, trityum için karşılaştırıldığında, artan iyot-125 radyonüklid daha yüksek enerji nedeniyle işlerken özen gösterilmelidir.

Nüklit bağlı olarak doku bölümü kalınlığı çözünürlük etkileyebilir. Düşük enerjili β--trityum radyasyon sınırlar yaklaşık 5 mikron dağınıklıkları nedeniyle onun doku ulaşmak. Sonuç olarak, bölüm kalınlığı 5 µm27,28aştığında miktar doku kalınlığı tarafından akıttıkları. Buna karşılık, yüksek enerjili izotopların radyoaktif çürüme ligandlar algılama orta daha büyük bir mesafe ile aynı zamanda görüntü oluşumuna katkıda çünkü daha düşük resim çözünürlüğüne kaynaklanan büyük bir doku penetrasyonu vardır. Sonuç olarak, daha ince kesitler yüksek enerjili radyonükleidler1için daha yüksek çözünürlüğü teşvik.

Autoradiographic bir protokol kurulması bilgi en iyi bağlayıcı koşulları (örneğin, arabellek, pH ve sıcaklık) ve farmakolojik radioligand açısından benzeşim ve Kinetik parametrelerin gerektirir. Radioligand önce karakterize değil, keşif çalışmaları gerekli29vardır. En iyi radioligand konsantrasyon seçme destekli her ikisi için de radioligand benzeşme ve siteleri bağlama bereket. Normalde, 5 - 6 kez Kd yansıtan bir konsantrasyon tüm bağlayıcı siteleri doymuş30olduğundan emin olmak için kullanılır. Başka bir yaklaşım toplam-için-radioligand konsantrasyonları aşağıda Kd31 seçerek ve radioligand çözüm kurtarmak bağlama belirsiz en yüksek oranı verim amaçlamaktadır. Bu yaklaşım özellikle yüksek radioligand konsantrasyonları [3H] için büyük HOCPCA ve yüksek-benzeşme GHB autoradiograms, oversaturating şansını artırmak bağlama sitesi incelenecek dokuda son derece bol olduğu için yararlıdır bağlama siteleri9. Ayrıca, verimli bir şekilde etiket hedeflenen protein tüm nüfus için radioligand ideal tüm olası hedef biçimler için bağlama. Bazı düşük-benzeşme agonist Birleşik Devletleri'nde mevcut olabilecek bu yana özellikle reseptör autoradiography, agonistler kullanımı yalnızca toplam reseptörleri kısmi bir dizi ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, nötr antagonistleri en sık tüm reseptör Birleşik26,29benzeşim görüntüler.

Ayrıca, bağlama deneyleri genellikle denge bağlama koşullar altında yapılmaktadır. Bu nedenle, denge bağlama (Sabit radioligand konsantrasyonu, tampon ve sıcaklık) istenen deneysel koşullar altında ulaşmak için gereken süreyi Derneği deneylerde kapsamı içinde denge bağlamasını sağlamak için tespit edilmelidir 4,23,30deneme. Radioligand kuluçka sonra ilişkisiz radioligand tahlil arabelleği ile birkaç incubations tarafından yıkanır ve genellikle distile H2O.-oranları optimize sıcaklık ve zaman bağlı olarak ayarlayarak parazit sinyal durulama tarafından takip radioligand26,30,31ayrılma oranı.

Radioligands biyolojik olmayan malzemeler, Yani, bağlama görüntüleyebilir non-spesifik bağlama. Radioligand bağlama hedef dışında hücresel bileşenleri için belirsiz bağlama olarak tanımlanır. Radioligand bağlama toplam miktarı belirsiz bağlama katkısını radioligand aynı bağlama sitede hedefleyen bir rakip etiketsiz ligand huzurunda değerlendirilir. Radyoaktif olmayan bileşik (displacer) 10,000-fold fazla verilir gibi bağlama sitesi kaplar ve radioligand yalnızca hedef kapalı siteleri26,31,32bağlayabilirsiniz. En önemlisi, bu hem özel hem de non-spesifik bağlama23yerinden riskini düşürür bu yana etiketsiz bileşik radioligand daha farklı bir kimyasal yapısı olmalıdır. Spesifik olmayan bağlama bağlama membranlar için doğan oldukça lipofilik radioligands durumunda özellikle büyük bir sorun olabilir. Bazı durumlarda, geniş çamaşır yordamlar sigara-reseptör ilişkili radioligand kaldırın ve bu nedenle oranları29bağlama özel geliştirmek.

Bir tahlil arabellek seçerken, iyonik gücü ve pH ligand-hedef etkileşimi üzerindeki etkisini dikkate almak önemlidir. Kutup ligandlar ve siteleri bağlama hidrofilik bileşenleri arasındaki özellikle Elektrostatik etkileşimler arabellek iyonik gücü tarafından etkilenmiştir. Bu nedenle, takviyesi monovalent veya divalent iyonları ile etkili benzeşme sürekli23,33etkileyebilir. Okudu ligand-hedef etkileşim için en uygun arabellek oluşturma bilinmiyorsa, farklı ortak arabellekleri pilot deneylerde keşfedilmeyi. Arabellekleri Ayrıca askorbik asit ve enzimler29,34aşağılayıcı inhibitörleri gibi anti-oksidanlar ile takıma. Ayrıca, belirli gruplara bağlama site içindeki veya ligand kendisi iyonlaşma pH tarafından etkilenir ve denge bağlama sabit, Kinetik hızı sabitler ve non-spesifik bağlama23,33üzerinde önemli etkileri vardır. Örneğin, yüksek-benzeşme GHB sondalama farklı GHB radioligands sitesiyle güzel bağlama bu bağlama hedef (şekil 6) pH önemini göstermektedir. Ligand-reseptör etkileşim için optimum pH karakterize, aynı zamanda biyolojik önemi ile ilgili olarak hedef önemi hakkında ipuçları verebilir.

Başka bir önemli dijital autoradiography faktördür pozlama süresi, Yani, tabak Imaging fosfor radiolabelled doku bölümlerine açarak ölçülebilir autoradiograms ulaşmak için gereken zaman. Tahminlerini radyoaktivite örnek, enerji ve half-life izotopu hem de istenen sinyal-gürültü oranı miktarını temel alır. Özellikle, uzun süreli pozlama zaman sonuçlarında doymuş görüntüleri ve yüksek arka plan sinyal. Yükseltilmiş arka plan sinyal kaset kozmik radyasyon1,4önlemek için kurşun korumalı ortamlarda depolayarak azaltılabilir. Eğer suboptimal autoradiograms elde, yine de, örnek birden çok kez, ligand-hedef karmaşık sabittir ve radyonüklid half-life o bırakmak koşuluyla maruz kalabilirler.

Tabak Imaging fosfor yeniden kullanılabilir ve uzun bir ömrü var doğru Yaniele zaman bükme kaçınılmalıdır ve tabak kuru bir ortamda depolanması gereken. Tabak Imaging fosfor işlenmesi için hafif ve kozmik radyasyon onların duyarlılık tarafından yönlendirilir. Böylece, kalenin arka plan sinyal en aza indirmek için her kullanımdan önce silmek önemlidir. Radiolabelled doku bölümleri pozlama görüntüleme plakaları radyasyon korumalı kaset ışık tamamen yoksun yapılır. Beyaz ışık ile bile kısa temas birikmiş sinyal indirgeyerek plaka maruz kalma süresi sonunda tarayıcıya aktarırken, herhangi bir ortam ışığı da kaçınılmalıdır. Ayrıca, tabak hemen sinyal solmaya önlemek için numune çıkarıldıktan sonra taranan. Tabak Imaging fosfor kullanmanın bir dezavantajı eserler ve kalan 'hayalet görüntüleri' potansiyel görünümünü sonra tekrarlanan kullanımı1tabak var.

Tabak fosfor kristalleri ulaşmak düşük enerji radyasyon izin vermek için bir koruyucu filtre olmadan görüntüleme Tridium ile çalışma gerektirir. Tritium duyarlı fosfor görüntüleme plakaları bu nedenle daha hassas kirlenme veya hatalı işlenmesi nedeniyle hasar vardır. Kontamine trityum duyarlı plakaları temizlenemez ve değiştirilmesi gerekir. Fiksasyon PFA buharı ile ligand-hedef kompleks onun ömrü uzatma plaka, potansiyel kirlenme azaltır. Ayrıca, doku fiksasyon ardından susuzluktan, trityum hassas plaka neme duyarlı olduğundan çok önemli bir adımdır. Hassas doğası nedeniyle, trityum duyarlı levhalar diğer izotoplar1,4için kullanılmamalıdır. Buna ek olarak, iyot-125 gibi yüksek enerjili izotopların için tabaklara daha sağlam ve onların yüzey bile % 70 etanol ile silerek temizlenebilir.

Geleneksel olarak, radiosensitive film radyoaktif bozunma uzamsal kayıt için kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir olsa da, film autoradiography bazı sınırlamaları vardır. Geliştirme için tehlikeli kimyasallar ve bir karanlık oda ve gerekliliği yanı sıra röntgen filmi dar bir dinamik aralığına göre karakterizedir. Bu nedenle, radiolabelled bölümleri tekrar tekrar farklı pozlama süreleri ile ölçülebilir olmayan doymuş görüntüleri35elde etmek için ortaya çıkarmak gerekli olabilir. Ayrıca, röntgen filmi uzun süreli pozlama süreleri ile düşük enerji izotoplar, i.eetiketli numune için sonuçlanan sınırlı hassasiyet gösteriyor. Tritium çürümesi maruz kalma birkaç ay gerektirebilir. Özellikle en iyi tahlil koşulları belirlenmiş ilk1,35olman gereken zamanlardır düşük duyarlılık küçük doğrusal aralığı ile kombine teknik son derece zaman alıcı yapar.

Tabak Imaging fosfor gelişmesiyle birlikte, bu sınırlamalar birkaç ele35,36,37olmuştur. Görüntüleme plakaları geçici olarak radyoaktif bozunma, radioligand doku numune içinde kayma yerleşimi temsil eden görüntüleri saklamak için hizmet vermektedir. Photostimulable BaFBr:Eu2+ fosfor kristalleri yüksek enerjili radyasyon (Örneğin, x ışınları, gama ışınları ya da beta molekülleri) sonuçlarında AB2uyarma olarak örnek tarafından yayılan radyoaktif enerji yakalamak için kullanılır + AB için3+ ve fosfor serbest elektron sonucu bindirme örgü4,37. Görünür veya kızılötesi ışık görüntü plaka açığa tepki ters çevirir, Yani, kapana kısılmış elektron serbest bırakılır ve AB3+ AB2+ için dönüştürme sırasında ışıldama duyulur. Verilmiş ışık radyoaktivite miktarı ile doğru orantılıdır ve onun algılama bir photomultiplier tarafından bir dijital autoradiogram37oluşturulmasını sağlar. Bu sistem gün3ay pozlama süresi belirgin bir azalma eşlik duyarlılık artış sağlar. Bunun üzerine, doğrusal dinamik aralığı önemli ölçüde, hangi doygun görüntüleri riskini azaltır artar. Doğrusallık 4-5 büyüklük içinde verilir ve art arda doğrulandı3,35,36,37,38. Film autoradiography hala üstün Uzaysal çözünürlük sağlasa da, tarama teknolojisi çabaları arasında anatomik bölgeler3detaylı farklılaşma sağlayan 300 çözünürlüğünden 25 µm (piksel boyutu), için geliştirilmesi sonuçlandı. Genel olarak, fosfor görüntüleme plakaları dijital autoradiograms hem bir doğrusal uzaklığı artmıştır ve duyarlılık nedeniyle acquirement kolaylaştırılması. Düşük çekim hızı ve Basitleştirilmiş geliştirme tekniği önemli ölçüde azalmıştır zaman daha yüksek aktarıma izin veri analizi için yol açar.

Autoradiography için karşılaştırıldığında, benzeşme ve yoğunluğu gibi yararlı farmakolojik parametreleri de genellikle radioligands deneyleri bağlayıcı doku homogenate içinde uygulanması karakterizedir. Bu yöntem bir verimli biçimde2' deki bir sıvı mercek detektörlü β-yayılan radyoaktif bozunma ölçerek sonuçları üreten avantajı vardır. Örneğin, 96-de microtiter plakaları içinde çok iyi bir yaklaşım içinde gerçekleştirilen bu tür deneyleri konsantrasyon bağımlı ilişkileri daha çok sayıda ve kitaplıkları bileşiklerin testi ile taranması için yararlıdır. Bunun üzerine, bu kurulum ile doygunluk analiz yapma kez daha mı uygun bir risk yüksek radioligand konsantrasyonları ile doygun görüntülerin görüntüler autoradiography karşılaştırıldığında. Ancak, sorunun doygun görüntüleri (şekil 6)22Kd ve Ben fazla elde etmek için bir sabit düşük radioligand konsantrasyon ile radyoaktif olmayan ligandlar homolog deplasman gerçekleştirme kaçınmanızı sağlar. Doku yoğunluğu faiz protein homogenate bağlamasında hafife, ancak Homogenate bağlama ve autoradiography ligand afinite sabitler için benzer tahminler üretmek. Böylece, hücre zarının bozulma ile doku homojenizasyon eşlik eden reseptör kaybına neden olabilir ya da koşullar3,33bağlama değişmiş önerilmiştir. Ayrıca, hataları doku diseksiyon bitişik beyin bölgeleri dokudan kontamine homogenates üretebilir. Buna karşılık, küçük çekirdeği bile karmaşık bağlama kalıpları görüntülenmeyecektir ve türevlenebilir autoradiography3,33kayma anatomik çözünürlük nedeniyle.

İmmünhistokimya de ilgi bir proteinin dağıtım anatomik olarak görüntüler. Ayrık doku bileşenleri hücresel düzeyde ve hatta hücre altı düzeylerinde elektron mikroskobu kullanılarak tanımlandığı gibi görüntüler yüksek anatomik, üretebilen bir yöntemdir. İfade düzeyleri boyama yoğunluğu üzerinde göre değerlendirilir. Yine de, mutlak miktar ifade düzeylerinin uygun başvuru standartları39eksikliği nedeniyle zordur. Ayrıca, immünhistokimya kez reseptör araştırma bir sorun olduğunu bir seçici, iyi doğrulanmış antikor durumu bağlıdır.

Vitro autoradiography edâ karar vermeden önce birkaç önemli noktalar yapılması gerekmektedir. İlk olarak, post-mortem doku hazırlık tekrarlanan dondurma ve çözme yanı sıra kesit de dahil olmak üzere siteleri2bağlama koruma etkisi. Ayrıca, yöntem yüksek benzeşme ve seçicilik hedef için soru2' görüntüler yeterli bir radioligand durumu bağlıdır. Radioligand hedef kapalı siteleri için önemli bağlama görüntülenmelidir değil ve aynı zamanda olumlu bir Kinetik profil göstermelidir. Ligand-hedef tesisin deneme kapsam sırasında bozulmamış kalmak gerekir çünkü bu gereklidir. Ayrıca, uygun radyoaktif olmayan bileşikler bulunduğunda, radyonüklid getirilmesi kritik bir faktör haline gelebilir. Bu nedenle, faiz molekülünün uygun fonksiyonel gruplar için verimli radiolabelling, yeterince yüksek belirli aktivite ve kimyasal kararlılık40ile radioligands üretimini sağlayan donatılmış olmalıdır. Başka bir dezavantaj-in vitro autoradiography yöntemi yalnızca kullanmak bir kez bir hayvan. sağlanmıştır Daha zarif vivo içinde pozisyon emisyon tomografi (PET), tekrarlanan aynı hayvan ve doluluk ve dinamik bağlama özellikleri belirlenmesi tarama sağlayan gibi yöntemleri görüntüleme için uzantı var. Evde beslenen hayvan özellikle önceden klinik çalışmalar 42,43,44doz optimizasyonu ve daha yüksek memeliler41 incelenmesi için değerlidir.

Autoradiographic tekniğin birçok değişikliği farmakolojik hedefleri sağlıklı ve hastalıklı Birleşik yanı sıra uyuşturucu keşif ve geliştirme karakterizasyonu açısından hem de onun uygulamayı genişletebilir. İlk olarak, görüntüleme teknolojisi son gelişmeler gerçek zamanlı autoradiography gelişmesine yol açmıştır. Gaz dedektörleri α/β-parçacıkların görüntüleme tabak ya da film için ihtiyaç disintegrations, böylece hızlı dijital autoradiograms45üreten doğrudan ölçümü tarafından önlemek.

Ayrıca, vitro autoradiography çalışmalar G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) post-mortem doku anatomik dağıtımlarında hakkında bilgi üstünde işlevselliğini sağlar. Yöntem bu varyant guanozin trifosfat (GTP), Yani, [35S] guanozin 5'-γ-thiotriphosphate radioactively etiketli bir analog ile doku bölümlerin kuluçka içerir ([35S] GTPγS), ile birlikte bir radyoaktif olmayan agonist GPCR. Ne zaman agonist bağlar ve GPCR [35S] Incorporation bir yanıt aydınlığa çıkartıyor GTPγS lokalize ve sadece aktive reseptör nüfus2,46,47 yansıtan autoradiography sayısal .

Ex vivo autoradiography bir radioligand bölgesel bağlama sonra canlı bir deneysel hayvan için yönetim değerlendiriyor tekniği, başka bir sürümünü gösterir. Hayvan kurban, cryosectioning doku söz konusu ve autoradiograms autoradiographic maruz kalma sonucu aşağıdaki hangi vivo içinde2bağlama radioligand yansıtmak. Ex vivo autoradiography yaygın uyuşturucu bulma ve geliştirme programları içinde emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) bilgi farmakokinetik profildeki bir kurşun bileşik, Yani, kazanmak için istihdam . Özellikle tüm vücut autoradiography Uyuşturucu dağıtımı tüm organ ve dokulara hakkında bilgiler sağlar. Ancak, non-spesifik bağlama ve miktar belirlenmesi mümkün metabolizması ve radioligand bozulma nedeniyle vitro autoradiography kıyasla daha zordur ve uzakta yıkama için hiçbir şekilde ligand48ilişkisiz.

Autoradiography de ön test ve evde beslenen hayvan ligandlar4karakterizasyonu için kullanılır. Yüksek enerjili radyonükleidler karbon-11 ve flor-18 çoğunlukla evde beslenen hayvan ligandlar için kullanılır. Evde beslenen hayvan radioligands için önemli, non-invaziv bir uygulama çünkü bir oturma hayvan bağlama radioligand ölçülebilir 3 boyutlu görüntüleri11,40,49elde edilebilir.

Fosfor plakaları Imaging kullanarak vitro autoradiography ligand-hedef etkileşimleri farmakolojik karakterizasyonu için değerli tahlil yöntemi temsil eder. En iyi tahlil koşulları kurduktan sonra yöntem nispeten hızlı ve basit bir protokol istihdam tarafından tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Anatomik dağıtım ilgi bir protein sağlıklı ve hastalıklı öldükten sonra deneysel hayvan dokularında fizyolojik, farmakolojik ve patolojik rolünü çalışma sağlar onun yerli microenvironment içinde belirlenir hem de insanlar2,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgments

İş Lundbeck Vakfı (Grant R133-A12270) ve Novo Nordisk Vakfı (Grant NNF0C0028664) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Aleš Marek [3H] radioligand temini için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

Neuroscience sayı: 145 Radioligand radyoaktif autoradiography benzeşme ifade fosfor görüntüleme HOCPCA γ-hidroksibütrik asit GHB NCS-382 nicel Farmakoloji
Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter