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Chemistry

escherichiaकोलाई आधारित सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण: एक मजबूत, लचीला, और सुलभ मंच प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल

Published: February 25, 2019 doi: 10.3791/58882
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4,5,6,7, 2,3, 2,3
1Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology, Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल के चरण, लागत, और ई.कोलाई आधारित सेल निष्कर्षों को उत्पंन करने और 4 दिन या उससे कम के भीतर विट्रो प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में लागू करने के लिए आवश्यक उपकरणों का विवरण । व्यापक अनुप्रयोगों के लिए इस मंच के लचीला प्रकृति का लाभ उठाने के लिए, हम प्रतिक्रिया की स्थिति है कि अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है पर चर्चा की ।

Abstract

पिछले ५० वर्षों में, सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) एक परीक्षण ट्यूब के भीतर कोशिकाओं की transcriptional और शोधों क्षमता का दोहन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है । सेल की व्यवहार्यता को बनाए रखने की आवश्यकता को दूर करके, और सेलुलर बैरियर को नष्ट करके, cfps को परंपरागत रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटीन के बायोन्युफैक्चरिंग में उभरते अनुप्रयोगों के लिए मूलभूत किया गया है, साथ ही आवेदन रैपिड प्रोटोटाइप में चयापचय इंजीनियरिंग, और कार्यात्मक जीनोमिक्स । एक ई.कोलाई आधारित cfps मंच को लागू करने के लिए हमारे तरीके नए उपयोगकर्ताओं को इन आवेदनों में से कई का उपयोग करने की अनुमति । यहां, हम तरीकों का वर्णन करने के लिए समृद्ध मीडिया के उपयोग के माध्यम से निकालने तैयार, चकरा देना flasks है, और एक reproducible विधि ट्यून sonication-आधारित सेल lysis । इस उद्धरण तो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पादन में सक्षम ९०० μg/mL या सुपर फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अधिक (sfgfp) प्रायोगिक सेटअप से डेटा विश्लेषण करने के लिए सिर्फ 5 ज में, यह देखते हुए कि उपयुक्त अभिकर्मक स्टॉक पहले से तैयार किया गया है. अभिकर्मकों को प्राप्त करने की अनुमानित लागत $४,५०० है जो प्रति μg प्रोटीन की अनुमानित लागत पर हजारों प्रतिक्रियाओं का उत्पादन या $०.०१९ प्रति μl की प्रतिक्रिया को बनाए रखेंगे । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति तरीके प्रतिक्रिया सेटअप की आसानी दर्पण अभिकर्मक पूर्व घोला जा सकता है के अनुकूलन के कारण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों में देखा, लागत का एक अंश पर । आदेश में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए cfps मंच के लचीला प्रकृति का लाभ उठाने के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए, हम मंच है कि tuned किया जा सकता है और उपलब्ध संसाधनों और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिणामों के आधार पर अनुकूलित के पहलुओं की एक किस्म की पहचान की है वांछित.

Introduction

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) एक तकनीक है कि प्रोटीन उत्पादन के लिए नए अवसरों के एक नंबर खुला है के रूप में उभरा है, कार्यात्मक जीनोमिक्स, चयापचय इंजीनियरिंग, और अधिक पिछले ५० वर्षों के भीतर1,2. vivo प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों में मानक की तुलना में , cfps तीन प्रमुख लाभ प्रदान करता है: 1) मंच के सेल मुक्त प्रकृति प्रोटीन है कि संभावित विषाक्त या सेल3,4 के लिए विदेशी होगा के उत्पादन में सक्षम बनाता है ,5,6; 2) जीनोमिक डीएनए की निष्क्रियता और एक टेम्पलेट डीएनए का परिचय प्रोटीन (ब्याज) के उत्पादन के लिए प्रतिक्रिया के भीतर प्रणालीगत ऊर्जा के जीन (ओं) को इनकोडिंग करते हैं; और 3) मंच की खुली प्रकृति को संशोधित करने और वास्तविक समय7,8में प्रतिक्रिया की स्थिति और संरचना की निगरानी करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है । प्रतिक्रिया करने के लिए यह सीधी पहुँच विस्तार chemistries और उपन्यास प्रोटीन के उत्पादन के लिए रेडॉक्स शर्तों और चयापचय प्रक्रियाओं की ट्यूनिंग के साथ जैविक प्रणालियों के विस्तार का समर्थन करता है2,9, 10. डायरेक्ट एक्सेस भी उपयोगकर्ता अधिक तेजी से डिजाइन के लिए एक एकल बर्तन प्रणाली में गतिविधि assays के साथ cfps प्रतिक्रिया गठबंधन करने के लिए अनुमति देता है-निर्माण परीक्षण11चक्र । छोटी मात्रा बूंदों में या कागज आधारित उपकरणों पर cfps प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने की क्षमता आगे उच्च throughput खोज प्रयासों और रैपिड प्रोटोटाइप12,13,14,15 का समर्थन करता है ,16. इन लाभों और प्रणाली के प्लग और खेल प्रकृति का एक परिणाम के रूप में, cfps अद्वितीय है कि विवो 17 मेंsolubly व्यक्त करने के लिए मुश्किल है प्रोटीन के उत्पादन के रूप में जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म सक्षम है, 18,19,20, रोग का पतालगाना 21,22,23, मांग पर बायोन्युफैक्चरिंग18,24 ,25,26,27, और शिक्षा28,29, जो सभी के लचीलेपन और सेल मुक्त मंच की उपयोगिता दिखा ।

cfps सिस्टम प्रोकार्योटिक और यूकार्योटिक सेल लाइनों दोनों से क्रूड लाइजेट्स की एक किस्म से उत्पन्न किया जा सकता है । यह पसंद की प्रणाली में विविध विकल्पों के लिए अनुमति देता है, जिनमें से प्रत्येक ब्याज के आवेदन के आधार पर लाभ और नुकसान है । cfps सिस्टम भी तैयारी समय, लागत, और उत्पादकता में काफी भिंनता है । सबसे अधिक उपयोग सेल अर्क गेहूं रोगाणु से उत्पादित कर रहे हैं, खरगोश जालीदार, कीट कोशिकाओं, और escherichia कोलाई कोशिकाओं, बाद के साथ सबसे अधिक लागत प्रभावी तिथि करने के लिए किया जा रहा है, जबकि प्रोटीन के उच्चतम volumetric पैदावार का उत्पादन30 . जबकि अंय cfps प्रणालियों उनके जंमजात के बाद translational संशोधन मशीनरी के लिए फायदेमंद हो सकता है, उभरते अनुप्रयोगों ई.कोलाई आधारित मशीनरी का उपयोग कर साइट पैदा करने के अंतर को पाटने में सक्षम है-विशेष रूप से फ़ॉस्फॉल्लेटेड और मांग पर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन31,३२,३३,३४,३५.

cfps प्रतिक्रियाओं या तो बैच, सतत-विनिमय सेल मुक्त (cecf) या सतत प्रवाह सेल मुक्त (cfps) स्वरूपों में चलाया जा सकता है । बैच प्रारूप एक बंद प्रणाली जिसका रिएक्शन जीवनकाल reactants की मात्रा कम और प्रतिक्रिया के निरोधात्मक byproducts के संचय के कारण सीमित है । cecf और cfcf तरीकों प्रतिक्रिया के जीवनकाल में वृद्धि, और इस तरह बैच प्रतिक्रिया की तुलना में वृद्धि हुई volumetric प्रोटीन पैदावार में परिणाम. यह प्रोटीन संश्लेषण के byproducts प्रतिक्रिया पोत से हटा दिया है, जबकि नए reactants प्रतिक्रिया2के दौरान आपूर्ति की अनुमति से पूरा किया है । cfcf के मामले में, ब्याज की प्रोटीन भी रिएक्शन चैंबर से हटाया जा सकता है, जबकि cecf में, ब्याज की प्रोटीन एक अर्द्ध पारगम्य झिल्ली३६,३७के शामिल रिएक्शन चैंबर में रहता है. इन तरीकों को विशेष रूप से मुश्किल से व्यक्त प्रोटीन की गरीब volumetric पैदावार पर काबू पाने में मूल्यवान है ब्याज३८,३९,४०,४१,४२, ४३. cecf और cfcf दृष्टिकोण को लागू करने में चुनौतियां है कि 1) जब वे प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए जिंमेदार जैव मशीनरी के अधिक कुशल उपयोग में परिणाम, वे विशेष रूप से अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है कि समग्र लागत और 2 बढ़ जाती है) वे बैच प्रारूप४४की तुलना में अधिक जटिल प्रतिक्रिया setups और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । आदेश में नए उपयोगकर्ताओं के लिए पहुंच सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल इस के साथ साथ वर्णन पर ध्यान केंद्रित बैच प्रारूप पर 15 μl की प्रतिक्रिया मात्रा में वृद्धि के लिए विशिष्ट सिफारिशों के साथ milliliter स्केल.

इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों गैर विशेषज्ञों को सक्षम बुनियादी प्रयोगशाला कौशल के साथ (जैसे स्नातक छात्रों के रूप में) सेल विकास को लागू करने के लिए, निकालने की तैयारी, और बैच प्रारूप प्रतिक्रिया सेटअप एक ई.कोलाई आधारित cfps प्रणाली के लिए । इस दृष्टिकोण किट आधारित प्रतिक्रिया सेटअप की आसानी त्याग के बिना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की तुलना में लागत प्रभावी है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रयोगशाला में अनुप्रयोगों और क्षेत्र में सक्षम बनाता है । जब cfps को लागू करने का निर्णय लेने, नए उपयोगकर्ताओं को अच्छी तरह से स्टार्टअप निवेश के लिए पारंपरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना चाहिए, के रूप में cfps हर मामले में बेहतर नहीं हो सकता है । cfps तरीकों यहां वर्णित उपयोगकर्ता सीधे कार्यात्मक जीनोमिक्स, उच्च throughput परीक्षण, प्रोटीन है कि विवो अभिव्यक्ति में के लिए असभ्य हैं, साथ ही क्षेत्र के उत्पादन सहित, अनुप्रयोगों की एक किस्म को लागू करने के लिए सक्षम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एन्टीजन और शैक्षिक किट सहित आवेदन. इस तरह के चयापचय इंजीनियरिंग के रूप में अतिरिक्त आवेदन, प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थिति की ट्यूनिंग, रोग का पता लगाने, और स्केल-अप cecf या cfcf तरीकों का उपयोग अभी भी संभव है, लेकिन प्रतिक्रिया के आगे संशोधन के लिए cfcf मंच के साथ अनुभव की आवश्यकता हो सकती है शर्तों. हमारे तरीकों को समृद्ध मीडिया में विकास गठबंधन और चकित flasks, अपेक्षाकृत तेजी से और reproducible sonication के माध्यम से सेल lysis के तरीकों के साथ, एक सरलीकृत cfps प्रतिक्रिया सेटअप द्वारा पीछा किया कि अनुकूलित premixes४५का इस्तेमाल करता है । जबकि सेलुलर विकास के तरीकों को कुछ हद तक इस क्षेत्र में मानकीकृत हो गए हैं, सेल lysis के लिए तरीके व्यापक रूप से बदलती हैं । sonication के अलावा, आम lysis तरीकों एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग शामिल, एक homogenizer, मनका मनका, या लाइसोजाइम और अंय जैव रासायनिक और शारीरिक व्यवधान तरीकों४६,४७,४८, ४९. हमारे तरीकों का उपयोग करते हुए, लगभग 2 मिलीलीटर कच्चे सेल निकालने की कोशिकाओं के 1 एल प्रति प्राप्त कर रहे हैं । सेल निकालने की इस मात्रा का समर्थन कर सकते हैं ४१५ μl cfps प्रतिक्रियाओं, प्रत्येक उत्पादन ~ ९०० μg/एमएल टेंपलेट से रिपोर्टर sfgfp प्रोटीन प्लाज्मिड pJL1-sfgfp । इस विधि की लागत $0.021/μg of sfgfp उत्पादित ($. 019/μl की प्रतिक्रिया), श्रम और उपकरणों की लागत को छोड़कर (पूरक चित्रा 1). खरोंच से शुरू, इस विधि एक ही व्यक्ति द्वारा 4 दिनों में लागू किया जा सकता है और दोहराने cfps प्रतिक्रियाओं घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है (1 चित्रा) । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुरूप करने के लिए अभिकर्मक तैयारी के बड़े बैच के लिए मात्रा में बढ़ाया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला द्वारा कार्यांवित किया जा सकता है प्रशिक्षित गैर विशेषज्ञों जैसे स्नातक छात्रों के रूप में, यह केवल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल की आवश्यकता है । नीचे वर्णित प्रक्रियाओं, और साथ वीडियो विशेष रूप से व्यापक उपयोग के लिए ई. कोली cfps मंच की पहुंच में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है ।

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Protocol

1. मीडिया तैयारी और सेल विकास

  1. Day 1
    1. स्ट्रीक ई. कोलाई BL21 * (DE3) एक ग्लिसरोल स्टॉक से एक पौंड आगर प्लेट पर कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कम से 18 एच के लिए सेते हैं ।
    2. पौंड मीडिया की ५० मिलीलीटर तैयार करें और एक तरल चक्र पर समाधान को १२१ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऑटोक्लेव बनाएं । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  2. दिन 2
    1. पूरक जानकारी में वर्णित के रूप में 2x ytp मीडिया के ७५० मिलीलीटर और ०.४ एम डी-ग्लूकोज समाधान के २५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. एक autoclaved २.५ L चकित कुप्पी और डी ग्लूकोज समाधान में 2x ytp मीडिया डालो एक autoclaved ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल में । १२१ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक तरल चक्र पर दोनों समाधान आटोक्लेव ।
    3. यह सुनिश्चित करें कि दोनों बाँझ समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाते हैं यदि अगले दिन सेल विकास किया जा रहा है, तो संरोपण पर विकास दर को अधिकतम करने के लिए । inoculation तक समाधान गठबंधन नहीं है ।
      नोट: समाधान 1-2 d के लिए 4 ° c पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि आवश्यक हो, हालांकि 2x ytp मीडिया अत्यधिक संदूषण के लिए प्रवण है ।
    4. BL21 की एक रातोंरात संस्कृति शुरू (DE3) की एक कॉलोनी के साथ £ मीडिया के inoculating ५० मिलीलीटर BL21 (DE3) एक निष्फल पाश और तकनीक का उपयोग कर प्रदूषण से बचने के लिए ।
    5. ५० मिलीलीटर की जगह BL21 * (DE3) पौंड संस्कृति में ३७ डिग्री सेल्सियस २५० rpm इनकोबेटर मिलाते हैं और 15-18 एच के लिए रातोंरात बढ़ते हैं ।
    6. तैयार है और सभी 3 और 4 दिनों के लिए आवश्यक सामग्री जीवाणुरहित, सहित: दो 1 L सेंटीफ्यूज की बोतलें, 4x शीत ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों (वजन और तीन के रिकॉर्ड जनता), और कई १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों ।
  3. Day 3
    1. ५० मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति को निकालें BL21 * (DE3) से पौंड में मिलाते हुए इनकोबेटर और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर ओडी६०० को मापने पौंड मीडिया के साथ एक 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग. एक शुरू ओडी६०० के ०.१ के लिए मीडिया के 1 l में जोड़ने के लिए आवश्यक रातोंरात संस्कृति की मात्रा की गणना करें (उदाहरण के लिए, यदि एक 1:10 कमजोर पड़ने वाले एक ओडी६०० को ०.४ के रूप में पढ़ा जाता है, तो अनपतला ओडी६०० के 25 मिलीलीटर का इनॉकुलेट, 1 एल में रात भर की संस्कृति 2x ytp छ) ।
    2. पौंड संस्कृति के ५० मिलीलीटर के साथ गर्म 2x ytp मीडिया और डी-ग्लूकोज समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर से निकालें । बाँझ तकनीक का प्रयोग, ध्यान से 2x ytp मीडिया में डी ग्लूकोज समाधान डालना (चकित flask के पक्षों से परहेज).
      नोट: D-ग्लूकोज के अलावा 2x ytpg के 1 एल के लिए नुस्खा पूरा करता है ।
    3. बाँझ तकनीक को बनाए रखने, एक ०.१ आयुध डिपो६००पर 1 एल संस्कृति शुरू करने के लिए ५० मिलीलीटर संस्कृति की उचित राशि के साथ 2x ytpg समाधान के 1 एल संरोपण । तत्काल एक ३७ डिग्री सेल्सियस में इनओकेलेटेड 1 एल संस्कृति जगह २०० आरपीएम पर इनकोबेटर मिलाते हुए.
    4. पहला आयुध विकास के पहले घंटे के बाद६०० रीडिंग ले लो (अंतराल चरण ठेठ 1 ज लेता है) । संस्कृति को पतला न करें । जारी रखें od६०० माप लेने के लगभग हर 20-30 मिनट तक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है ०.६ ।
    5. ओडी६०० = ०.६ तक पहुँचने पर, 2x ytpg कल्चर में 1 mL (1 L संस्कृति में अंतिम सांद्रता = 1 मि.) की १ मिलीलीटर डालें ।
      नोट: आदर्श प्रेरण आयुध डिपो६०० ०.६ है; हालांकि, 0.6-0.8 की एक सीमा स्वीकार्य है । iptg द्वारा प्रेरण T7 आरएनए polymerase (T7RNAP) के अंतर्जात उत्पादन के लिए है ।
    6. प्रेरण के बाद, यह ३.० तक पहुँचता है जब तक लगभग हर 20-30 मिनट आयुध डिपो६०० उपाय.
      नोट: इस समय के दौरान अपकेंद्री को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें । अनुपूरक जानकारी में विस्तृत रूप में ठंडा S30 बफर तैयार करें. S30 बफ़र पहले से तैयार है, तो सुनिश्चित करें कि dtt उपयोग के दिन तक नहीं जोड़ा गया है ।
    7. एक बार ओडी६०० ३.० तक पहुँचता है (चित्रा 2a), एक बर्फ में एक ठंडा 1 L अपकेंद्री बोतल में संस्कृति डालना पानी स्नान. अपकेंद्री में एक संतुलन के रूप में उपयोग करने के लिए समान वजन के एक पानी से भरे 1 L अपकेंद्री बोतल तैयार करें ।
      नोट: absorbance मूल्यों साधन करने के लिए साधन से बदलती हैं । जबकि BL21 (DE3) की फसल के ओडी६०० एक संवेदनशील चर नहीं है, यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता का मूल्यांकन और एक समस्या निवारण उपाय के रूप में इस चर का अनुकूलन. बड़ा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर अपेक्षाकृत कम ओडी६०० रीडिंग में परिणाम कर सकते हैं छोटे cuvette आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की तुलना में.
    8. ५,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 1 एल बोतलें और गोली कोशिकाओं के लिए 10 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रिप ।
    9. धीरे से बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और यह संस्था के जैविक अपशिष्ट प्रक्रियाओं के अनुसार निपटान । बर्फ पर गोली प्लेस ।
    10. एक spatula का उपयोग कर, अपकेंद्री बोतल से सेल गोली परिमार्जन और यह एक ठंडा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    11. शंक्वाकार ट्यूब के लिए ठंडा S30 बफर के 30 मिलीलीटर जोड़ें और कम फटने (20-30 एस) और बर्फ पर आराम की अवधि (1 मिनट) के साथ vortexing द्वारा सेल गोली resuspend जब तक पूरी तरह से कोई हिस्सा के साथ resuspend ।
    12. एक बार गोली पूरी तरह से resuspended है, एक संतुलन के रूप में पानी के साथ एक और ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब का उपयोग करें और ५००० एक्स जी और 10 डिग्री सेल्सियस (पूर्व ठंडा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए सेंट्रेसेज ।
      नोट: यह कोशिकाओं को फसल कटाई जब आवश्यक 3 बहाकर के 1अनुसूचित जनजाति पूरा करता है ।
    13. बाहर सतह पर तैरनेवाला डालो और यह संस्था के जैविक अपशिष्ट प्रक्रियाओं के अनुसार निपटान । 20-25 मिलीलीटर ठंडा S30 बफर और 10 मिनट के लिए ५००० एक्स जी और 10 डिग्री सेल्सियस (पहले से ठंडा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ गोली resuspend ।
      नोट: यह 3 washes के 2nd पूरा करता है ।
    14. फिर, बाहर सतह पर तैरनेवाला डालो और यह संस्था के जैविक अपशिष्ट प्रक्रियाओं के अनुसार निपटान । वास्तव में जोड़ें 30 S30 बफर और भंवर की मिलीलीटर फिर गोली resuspend करने के लिए ।
    15. का उपयोग कर 3 पूर्व तौला, ठंडा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों और एक सीरोलॉजिकल पिपेट भराव एक बाँझ पिपेट के साथ, 3 शंक्वाकार ट्यूबों में से प्रत्येक में सस्पेंड गोली/S30 बफर मिश्रण के aliquot 10 मिलीलीटर ।
      नोट: 3 ट्यूबों में कोशिकाओं को विभाजित करना आवश्यक नहीं है, लेकिन बाद के चरणों में बढ़ी हुई सुविधा के लिए छोटे सेल छर्रों (~ 1 g) में इस कदम का परिणाम है ।
    16. अपकेंद्रिता सभी ट्यूबों, आवश्यक के रूप में उपयुक्त संतुलन का उपयोग कर, के लिए 10 मिनट में ५००० एक्स जी और 10 ° c (पूर्व ठंडा करने के लिए 4 ° c).
      नोट: यह अंतिम धोने कदम पूरा करता है ।
    17. बाहर सतह पर तैरनेवाला डालो और यह संस्था के जैविक अपशिष्ट प्रक्रियाओं के अनुसार निपटान । एक साफ ऊतक के साथ शंक्वाकार ट्यूब और टोपी के अंदर पोंछते ध्यान से अतिरिक्त S30 बफर निकालें; गोली को छूने से बचें ।
    18. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर ट्यूबों reweigh और प्रत्येक ट्यूब पर अंतिम गोली वजन रिकॉर्ड ।
      नोट: इस बिंदु पर प्रोटोकॉल रोका जा सकता है । छर्रों फ्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हो सकता है और एक साल तक के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए निकालने की तैयारी के लिए आवश्यक है ।

2. क्रूड सेल निकालने की तैयारी-4 दिन

  1. निकालने की तैयारी के लिए, प्रत्येक चरण के दौरान कोशिकाओं को बर्फ पर ठंडा रखें । पेलेट के सेल द्रव्यमान के 1 ग्राम प्रति कोल्ड S30 बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि dithiothreitol (डीटीटी) 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए S30 बफर के लिए पूरक किया गया है ।
    नोट: इस समय के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस के लिए microcentrifuge शांत हो जाओ ।
  2. कम फटने के साथ vortexing द्वारा सेल गोली resuspend (20-30 s) और शेष अवधि (1 मिनट) बर्फ पर पूरी तरह से resuspend तक । resuspension मुश्किल है, तो 30 मिनट के लिए बर्फ पर छर्रों defrost करने के लिए छोड़ दें ।
  3. स्थानांतरण १.४ एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में सस्पेंड कोशिकाओं की मिलीलीटर ।
  4. एक बीकर में एक बर्फ पानी स्नान में सस्पेंड कोशिकाओं के १.४ एमएल युक्त एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब रखें । ४५ s के लिए sonicate पर ५९ के बाद से 3 कुल चक्र के लिए बंद s, आयाम सेट के साथ ५०% पर । बंद करें और बंद अवधि के दौरान धीरे मिश्रण करने के लिए ट्यूबों पलटे । कुल में, प्रत्येक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब सस्पेंड कोशिकाओं के १.४ एमएल युक्त (चित्रा 3a & 3a) के लिए ऊर्जा का 800-900 J उद्धार ।
    नोट: यह चरण sonicator प्रकार और मॉडल का उपयोग करने के लिए संवेदनशील है और उपकरण इस प्रक्रिया के लिए सूचीबद्ध से अलग है, तो अनुकूलित किया जाना चाहिए । दो पूरक दृष्टिकोण पैमाने अप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस चरण के दौरान तैयार निकालने की मात्रा: 1) एकाधिक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों समानांतर में sonicated किया जा सकता है, और/2) बड़े संस्करणों शंकु ट्यूबों में sonicated किया जा सकता है (अप करने के लिए 15 मिलीलीटर की सेल resuspension प्रति ट्यूब) , पहले वर्णित के रूप में दिया ऊर्जा की मात्रा स्केलिंग 29,४५.
  5. तुरंत sonication के बाद पूरा हो गया है, जोड़ने के ४.५ μl 1 एम डीटीटी (एक अतिरिक्त 2 मिमी डीटीटी का सप्लीमेंट) में १.४ मिलीलीटर lysate और पलटो कई बार मिश्रण करने के लिए । बर्फ पर ट्यूब प्लेस । दोहराएं कदम २.४ और २.५ के लिए किसी भी अतिरिक्त ट्यूबों सस्पेंड कोशिकाओं के लिए आगे बढ़ने से पहले centrifugation ।
  6. १८,००० एक्स जी और 10 मिनट (चित्रा 3 सी) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रेज नमूने ।
  7. पिपेट एक नया १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला । गोली परेशान मत करो; उपज को अधिकतम करने के प्रयासों में गोली को बाधित करने की तुलना में शुद्धता बनाए रखने के लिए कुछ सुपरनेटन्ट छोड़ना बेहतर है ।
  8. २५० आरपीएम पर पिछले कदम से सतह पर तैरनेवाला सेते और ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर के मिलाते हुए मंच करने के लिए ट्यूब टेप करके (यह अपवाह प्रतिक्रिया है).
  9. १०,००० एक्स जी और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रेज नमूने ।
  10. गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण । भंडारण के लिए निकालने के कई १०० μl aliquots बनाएँ ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और निकालने तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है और cfps प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक तक एक वर्ष के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । न्यूनतम 5 फ्रीज-गल चक्र उत्पादकता (चित्रा 4) को निकालने के लिए हानि के बिना आया जा सकता है ।

3. सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण बैच प्रारूप प्रतिक्रियाओं

  1. गल समाधान ए और बी, डीएनए टेंपलेट, BL21 (DE3) निकालने (यदि जमे हुए), T7RNAP, और आणविक ग्रेड पानी की एक aliquot ।
    नोट: cfps रिएक्शन टेम्पलेट अनुपूरक जानकारीमें पाया जा सकता है । समाधान ए और बी व्यंजनों अनुपूरक जानकारी में प्रदान की जाती है और कई अभिकर्मकों के लिए विशिष्ट सांद्रता के अनुरूप करने के लिए cfps के लिए panox-सपा आधारित ऊर्जा प्रणाली का समर्थन है । cfps का समर्थन कर सकते है जो इन अभिकर्मक सांद्रता में प्रत्येक अभिकर्मक और स्वीकार्य भिंनता की भूमिका५०निर्धारित किया गया है । पूरक सूचना५१में एक T7RNAP शुद्धि प्रोटोकॉल पाया जा सकता है । पूरक T7RNAP volumetric पैदावार बढ़ा सकते है लेकिन आवश्यक नहीं है अगर T7RNAP सेल विकास के दौरान प्रेरित है । प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट (pJL1-sfgfp) किट में वॉश बफर का उपयोग करके दो बहाकर के साथ एक maxiprep किट का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है, एक के बाद प्रसंस्करण डीएनए-सफाई एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर (चित्रा 2b). रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स भी cfps प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. cfps प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक microfuge ट्यूबों की जरूरी राशि लेबल ।
    नोट: प्रतिक्रियाओं विभिन्न पोत आकार में किया जा सकता है, लेकिन एक छोटे पोत volumetric प्रोटीन पैदावार को कम कर सकते हैं (चित्रा 2c). एक ही आकार के बर्तन में एक प्रतिक्रिया स्केलिंग भी volumetric पैदावार को कम कर सकते हैं, ऑक्सीजन विनिमय कम करने के एक समारोह के रूप में, सतह क्षेत्र में मात्रा अनुपात में कमी के कारण. जब १०० μl ऊपर प्रतिक्रिया मात्रा में वृद्धि, यह फ्लैट नीचे अच्छी तरह से प्लेटें 31,३७,५२का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
  3. समाधान के २.२ μl जोड़ें A, २.१ μl of समाधान B, 5 μl of BL21 * (DE3) निकालें, ०.२४ μg of T7RNAP (16 μg/ml अंतिम एकाग्रता), ०.२४ एनजी of DNA टेम्पलेट (16 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता), और पानी के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए 15 μl.
    नोट: भंवर समाधान A और B अक्सर प्रतिक्रिया सेटअप के दौरान घटकों के अवसादन से बचने के लिए और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रतिक्रिया प्रत्येक समाधान के एक समरूप aliquot प्राप्त करता है । निकालने vortexing से बचें, बजाय मिश्रण करने के लिए ट्यूब पलटने.
  4. के बाद सभी अभिकर्मकों प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया है, एक ट्यूब मिश्रण और नीचे या धीरे vortexing है कि अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण एक एकल 15 μl मनका १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब के तल पर संयुक्त है सुनिश्चित करते हुए ।
  5. 4 ज, या 30 ° c रातोंरात के लिए मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर में प्रत्येक प्रतिक्रिया प्लेस ।
    नोट: सफल प्रतिक्रियाओं गुणात्मक रूप से cfps प्रतिक्रिया मिश्रण (चित्रा 3 डी) के भीतर sfgfp उत्पाद के हरे रंग के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है । ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति एसडीएस-पेज (पूरक चित्रा 2) द्वारा भी पुष्टि की जा सकती है ।

4. रिपोर्टर प्रोटीन का quantification, [sfgfp]

  1. लोड ४८ μl का ०.०५ M hepes, pH 8, में एक अच्छी तरह से परिमाणन के लिए आवश्यक (आमतौर पर प्रतिक्रिया ट्यूब प्रति तपसिल में प्रदर्शन).
  2. इनकोबेटर से प्रतिक्रियाओं को हटा दें । पिपेट ऊपर और नीचे प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए, तो ०.०५ एम hepes, पीएच 8 के ४८ μl में प्रतिक्रिया के 2 μl हस्तांतरण । पिपेट ऊपर और नीचे फिर से मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से.
  3. एक बार सभी प्रतिक्रियाओं लोड और मिश्रित कर रहे हैं, फ्लोरोमीटर में ९६ अच्छी तरह से थाली जगह और sfgfp समापन बिंदु प्रतिदीप्ति को मापने.
    नोट: sfgfp प्रतिदीप्ति परिमाणन के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य क्रमशः ४८५ एनएम और ५१० एनएम, कर रहे हैं ।
  4. एक पहले से जनरेट किया गया मानक वक्र का उपयोग कर, [sfgfp] प्राप्त प्रतिदीप्ति रीडिंग से निर्धारित करें ।
    नोट: प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम sfgfp एकाग्रता की एक मानक वक्र पैदा करने के लिए निर्देश अनुपूरक जानकारी में प्रदान की जाती हैं (अनुपूरक चित्रा 3). साधन संवेदनशीलता भिन्न हो सकते हैं के बाद से उपयोगकर्ताओं को उनके साधन के लिए एक मानक वक्र स्थापित करने की आवश्यकता होगी.

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Representative Results

हम एक sonication आधारित ई. कोलाई निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल है कि एक चार दिन की अवधि में पूरा किया जा सकता है प्रस्तुत किया है, चित्रा 1 प्रत्येक दिन पर प्रक्रियात्मक टूटने का प्रदर्शन के साथ । विभिन्न रुके हुए बिंदुओं के साथ प्रत्येक दिन में पूरा किया जा सकता है कि चरणों के लिए आघातता है, लेकिन हम इस कार्यप्रवाह को निष्पादित करने के लिए सबसे प्रभावी होने के लिए मिल गया है । इसके अतिरिक्त, दोनों सेल छर्रों (चरण 1.3.18) और पूरी तरह से तैयार निकालने (चरण २.१०) में स्थिर रहे हैं-८० डिग्री सेल्सियस के लिए एक साल के लिए, उपयोगकर्ता की अनुमति के लिए प्रत्येक का बड़ा स्टॉक बनाने के लिए एक बाद में समय पर उपयोग के लिए बचाने के लिए17. न केवल निकालने स्थिर लंबे समय अवधि से अधिक है, लेकिन यह भी उत्पादकता का एक महत्वपूर्ण नुकसान के बिना कम पांच फ्रीज गल चक्र से गुजरना कर सकते हैं (चित्रा 4). फ्रीजर संग्रहण स्थान सीमित है, तो यह निकालने की बड़ी aliquots एकाधिक उपयोगों के लिए संग्रहीत करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, हम कई छोटे aliquots (~ १०० μl) जब भी संभव निकालने की सलाह देते हैं ।

हर नए निकालने की तैयारी के साथ, हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ता को निकालने के उस बैच के लिए मैग्नीशियम की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के क्रम में एक मैग्नीशियम टाइट्रेट करता है. उपयोगकर्ताओं ब्रैडफोर्ड परख द्वारा सेल निकालने के कुल प्रोटीन एकाग्रता में बैच करने के लिए बैच परिवर्तनशीलता यों तो कर सकते हैं । उच्च प्रदर्शन निष्कर्षों के लिए, हम आम तौर पर कुल प्रोटीन सांद्रता देखें 30-50 मिलीग्राम/एमएल, और इस रेंज के भीतर कुल प्रोटीन सांद्रता और सेल निकालने के प्रदर्शन के बीच कोई स्पष्ट संबंध नहीं है । इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए मैग्नीशियम सांद्रता ट्यून करें कि प्रोटीन और न्यूपिक एसिड कार्यक्षमता प्रत्येक निकालने बैच के लिए परका हैं. मैग्नीशियम का स्तर उचित डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन अत्यधिक स्तर इन प्रक्रियाओं५३के लिए हानिकारक हो सकता है । आदेश में इस निर्भरता को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक सह-अनुमापन मैग्नीशियम का प्रदर्शन किया है और मात्रा निकालने के लिए इष्टतम संयोजन है कि आवश्यक निकालने की मात्रा को कम करता है, जबकि एक उत्पादक प्रतिक्रिया को बनाए रखने (चित्रा 5) । इस प्रयोग से, हम 5 μl निकालने की अनुशंसा करते हैं और 10 मिमी मिलीग्राम2 + 30 मिलीग्राम/एमएल के कुल प्रोटीन सामग्री के साथ निकालने के लिए, आदेश में १,००० μg/एमएल sfgfp प्राप्त करने के लिए ।

cfps के साथ हमारे अनुभव भी हमें प्रोटोकॉल है कि प्रणाली की समग्र उत्पादकता को हानि के बिना अलग किया जा सकता है के भीतर कदम निर्धारित करने की अनुमति दी है, और दूसरों कि एक उच्च प्रदर्शन cfps प्रणाली के लिए अभिन्न हैं । सबसे विशेष रूप से, सेल फसल के अंतिम ओडी६०० cfps प्रतिक्रिया के अंतिम उत्पादन को काफी प्रभावित नहीं करता है, और कोशिकाओं को २.७-४.० ओडी६००से कहीं भी काटा जा सकता है । यह वृद्धि के आरंभिक घातीय चरण का प्रतिनिधित्व करता है जहां प्रति कोशिका रिबोकुछ सांद्रता सबसे अधिक है और स्थानांतरीय मशीनरी तीव्र विकास का समर्थन करने के लिए सबसे अधिक सक्रिय है । यह प्रेक्षण उपयोगकर्ताओं को अपनी प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने की सुविधा देता है । हम लगभग ३.० od६०० पर संचयन की अनुशंसा करते हैं ताकि एक ओडी६०० पर कोशिकाओं को कैप्चर करने के लिए समय संचयन पूर्ण हो (चित्रा 2a) द्वारा ३.३ के करीब । वेरिएबल जो cfps पैदावार को प्रभावित करते हैं, उनमें डीएनए गुणवत्ता, रिएक्शन पोत आकार, और प्रतिक्रिया में मौजूद कोशिका निकालने और मैग्नीशियम आयन की सापेक्ष मात्रा शामिल है । हमने पाया है डीएनए गुणवत्ता के लिए उल्लेखनीय बैच-बैच भिंनता है । इस को हल करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ताओं को एक midi या मैक्सी prep के माध्यम से डीएनए को शुद्ध, एक अतिरिक्त डीएनए क्लीनअप कदम के बाद या तो डीएनए शुद्धिकरण कॉलम maxiprep में इस्तेमाल किया, या एक अतिरिक्त डीएनए क्लीनअप किट का उपयोग कर के बाद शुद्धि. यह cfps प्रतिक्रियाओं और अधिक मजबूत प्रोटीन उत्पादन (चित्रा 2b) में परिणाम के लिए डीएनए गुणवत्ता में reproducibility में सुधार । प्रतिक्रिया पोत भी volumetric पैदावार को प्रभावित करता है, इस तरह कि अलग पोत मात्रा में समान प्रतिक्रिया setups के प्रोटीन उत्पादन ४०% तक अलग कर सकते हैं । यह theorized किया गया है कि बड़े जहाजों में देखा volumetric उपज में बढ़ावा देने की प्रतिक्रिया मिश्रण की एक वृद्धि की सतह क्षेत्र के कारण है, बेहतर ऑक्सीजन विनिमय (चित्रा 2c) के लिए अनुमति देता है, और दूसरों को आगे चलाकर volumetric पैदावार को बढ़ावा दिया है बड़े फ्लैट-नीचे प्लेटों में cfps प्रतिक्रियाओं, जो हम १०० μl17,31,३७,५२पर प्रतिक्रियाओं के लिए सलाह देते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : संस्कृति विकास, सेल निकालने, सेटअप और cfps प्रतिक्रियाओं के परिमाणन के उत्पादन के लिए समयरेखा । उपयोगकर्ता इस चार-दिवसीय कार्यप्रवाह के माध्यम से अपने शोध अनुप्रयोगों के लिए cfps प्लेटफ़ॉर्म कार्यान्वित कर सकते हैं. अभिकर्मक तैयारी इस प्रयोग के पहले दौर के लिए प्राथमिक समय और लागत निवेश का प्रतिनिधित्व करता है और अभिकर्मकों के शेयरों की स्थापना के बाद काफी हद तक घटता है । इसके अतिरिक्त, सेल छर्रों और तैयार सेल निकालने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है पर एक वर्ष से अधिक-८० ° c, उपयोगकर्ता तेजी से परिणाम के लिए विभिन्न चरणों में समयरेखा शुरू करने के लिए अनुमति. उपयोगकर्ता इस कार्यप्रवाह की टाइमलाइन को संशोधित करने के लिए विभिन्न चरणों पर भी रोक सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : cfps के लिए परिवर्तनीय शर्तों और volumetric प्रतिक्रिया पैदावार पर प्रभाव । A. विभिन्न OD६०० रीडिंग पर संचयन BL21 (DE3) कोशिकाओं पर आधारित उत्पादकता तुलना निकालें । इस भूखंड के आधार पर, हम ३.३ के एक ओडी६०० पर फसल कटाई की सलाह देते हैं ताकि लक्ष्य प्रोटीन का कम से कम १००० μg/ १.५ मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 15 μl स्केल पर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था । B. दो डीएनए maxiprep के साथ और पोस्ट-शुद्धि डीएनए सफाई के बिना धोने प्रोटोकॉल की तुलना. pJL1-sfgfp plasmids एक या दो बहाकर के बाद एक पीसीआर शुद्धि किट द्वारा शुद्धि सफाई के बाद एक maxiprep के साथ चला गया । प्रोटीन अभिव्यक्ति की ~ ९०० μg/एमएल हासिल करने के लिए, हम maxiprep washes की संख्या की परवाह किए बिना एक के बाद शुद्धि डीएनए सफाई प्रदर्शन कर सुझाव देते हैं । १.५ मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 15 μl स्केल पर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था । C. 15 μl cfps प्रतिक्रियाओं 2 मिलीलीटर से ०.६ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों से लेकर विभिंन जहाजों में प्रदर्शन किया । "neg" कोई डीएनए टेम्पलेट प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया था, जहां एक नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है । सभी त्रुटि पट्टियां प्रत्येक शर्त के लिए तीन स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं के 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिनमें से प्रत्येक को triplicate में मात्रा निर्धारित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : प्रमुख प्रक्रियात्मक setups और उत्पादक निकालने बनाने के लिए परिणाम । A. sonication के दौरान गर्मी उत्पन्न होती है, जबकि नमूना की शीतलन सुनिश्चित करने के लिए बर्फ के पानी के स्नान का एक उचित सेटअप । B. १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब सस्पेंड सेल गोली पूर्व (बाएं) और पोस्ट (दाएं) sonication युक्त । परिणामस्वरूप lysate एक गहरा रंग सस्पेंड सेल गोली की तुलना में प्रदर्शित करना चाहिए । C. १८,००० एक्स जी अपकेंद्रीकरण के बाद सेल lysate के सतह पर तैरनेवाला और गोली के उचित जुदाई । D. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 4 एच के बाद cfps प्रतिक्रियाओं । १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब पर सही (सफल प्रतिक्रिया) sfgfp रिपोर्टर प्रोटीन के दृश्य प्रतिदीप्ति ~ ९०० μg/एमएल में दिखाता है । नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब बाईं ओर, टेम्पलेट डीएनए की कमी और एक असफल प्रतिक्रिया का अनुकरण, कोई प्रतिदीप्ति के साथ एक स्पष्ट समाधान प्रदर्शित करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

Figure 4
चित्रा 4 : cfps निकालने के लिए 5 फ्रीज-गल चक्र पर प्रोटीन अभिव्यक्ति में बदलें । एक ही विकास से तैयार निकालने पांच फ्रीज तरल नाइट्रोजन फ्लैश ठंड बर्फ पर गल द्वारा पीछा किया के माध्यम से गल चक्र चला गया । sfgfp व्यक्त करने के लिए उत्पादकता निकालने में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन पांच फ्रीज-गल चक्र पर देखा गया. १.५ मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 15 μl स्केल पर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था । "neg" कोई डीएनए टेम्पलेट प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया था, जहां एक नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है । सभी त्रुटि पट्टियां प्रत्येक शर्त के लिए तीन स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं के 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिनमें से प्रत्येक को triplicate में मात्रा निर्धारित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : अलग के साथ प्रतिक्रियाओं के लिए cfps [मिलीग्राम2+] और निकालने के संस्करणों बनाम [sfgfp]. [एमजी2 +] से लेकर 8 मिमी से 14 मिमी के साथ 2 मिमी वेतन वृद्धि और निकालने की मात्रा 3 μl से 7 μl करने के लिए 1 μl वेतन वृद्धि के साथ हुई. रंग कोड का प्रतिनिधित्व करता है [sfgfp] उच्च से उत्पादित (लाल) कम करने के लिए (बैंगनी). उच्च प्रोटीन उत्पादन को बनाए रखते हुए अभिकर्मक दक्षता को अधिकतम करने के लिए, हम 5 μl निकालने और 10 मिमी मिलीग्राम2 का उपयोग करने की सलाह देते हैं + अर्क के लिए कि एक कुल प्रोटीन सामग्री है ~ 30 मिलीग्राम/एमएल, के रूप में ब्रैडफोर्ड परख द्वारा निर्धारित । समोच्च भूखंड उत्पन्न करने के लिए मूल अंक प्रत्येक शर्त के लिए तीन स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं के समापन बिंदु प्रतिदीप्ति बंद आधारित थे, जिनमें से प्रत्येक triplicate में मापा गया था. १.५ मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 15 μl स्केल पर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 1: प्रोटीन की कीमत प्रति माइक्रोग्राम उत्पादित और प्रति माइक्रोग्राम प्रतिक्रिया के छह सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्लेटफार्मों भर में । हमारे मंच की तुलना में पांच अलग सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण किट/प्लेटफार्मों बदलती उत्पादकता और मूल्य निर्धारण के साथ है । हमारे sonication आधारित cfps मंच अधिक लागत प्रभावी है दोनों में $/μg प्रोटीन के और $/μl सबसे वाणिज्यिक किट की तुलना में प्रतिक्रिया के और प्रतिक्रिया सेटअप के लिए एक किट की आसानी प्रदान करता है, जबकि शेष अन्य शैक्षणिक cfps प्लेटफार्मों के लिए तुलनीय लागत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 2: एसडीएस-सीएफपीएस में sfgfp अभिव्यक्ति का पृष्ठ । (+ डीएनए) और sfgfp के लिए बिना (-डीएनए) डीएनए टेम्पलेट के साथ सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं 27 केडीए (काला तीर) पर मनाया sfgfp की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने के लिए एक 12% sdspage जेल पर चला रहे थे । पारंपरिक एसडीएस-पृष्ठ तकनीकों का इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक जेल पर लोड नमूना ब्रैडफोर्ड परख सेल निकालने में कुल प्रोटीन के परिमाणन पर आधारित कुल प्रोटीन के 18 μg शामिल थे । प्रतिदीप्ति तीव्रता मापन और हमारे मानक वक्र के आधार पर, हम अनुमान लगाते हैं कि "+ DNA" लेन में sfgfp का ०.४२ μg होता है. इन नमूनों को प्राप्त करने के लिए, cfps प्रतिक्रियाओं में एक 15 μl पैमाने पर चला रहे थे १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब volumetric पैदावार चित्रा 3cके अनुरूप उत्पादन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 3: cytation पर sfgfp के लिए मानक वक्र 5. यह वक्र ऊपर उल्लिखित विधियों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था । इस पांडुलिपि के लिए एकत्र सभी डेटा को समापन बिंदु प्रतिदीप्ति रीडिंग से [sfgfp] में μg/एमएल इस मानक वक्र का उपयोग कर परिवर्तित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण जैव रासायनिक प्रणालियों के तेजी से प्रोटोटाइप बायोमानुफैक्चरिंग से लेकर आवेदनों की एक किस्म के लिए एक शक्तिशाली और सक्षम करने के लिए प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है । आवेदनों की चौड़ाई की निगरानी, हेरफेर, और वास्तविक समय में सेलुलर मशीनरी को बढ़ाने के लिए क्षमता के द्वारा समर्थित है । इस मंच प्रौद्योगिकी के विस्तार के प्रभाव के बावजूद, व्यापक अनुकूलन के तरीकों के कार्यांवयन में तकनीकी बारीकियों के कारण धीमी गति से बनी हुई है । इस प्रयास के माध्यम से, हम नई प्रयोगशालाओं में इस तकनीक की स्थापना के लिए सादगी और स्पष्टता प्रदान करने का लक्ष्य रखते हैं । इस छोर की ओर, एक ई.कोलाई आधारित सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण मंच के लिए हमारे प्रोटोकॉल चार दिनों के एक स्टार्टअप समय के भीतर प्रयोगशाला प्रशिक्षित गैर विशेषज्ञों द्वारा, ऐसे स्नातक छात्रों के रूप में प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1) । इसके अतिरिक्त, एक बार अभिकर्मकों का एक शेयर और निकालने का उत्पादन कर रहे हैं, बाद में cfps बैच प्रतिक्रियाओं स्थापित किया जा सकता है, incubated, और सिर्फ 5 एच में मात्रा निर्धारित. एक एकल, 1 एल सेल विकास ४१५ μl cfps प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त निकालने में परिणाम कर सकते हैं, जबकि अन्य सेल मुक्त अभिकर्मकों के एकल बैच तैयारी प्रतिक्रियाओं के हजारों का समर्थन कर सकते हैं । अभिकर्मक तैयारी भी बढ़ाया जा सकता है अगर एक भी बड़ा स्टॉक की जरूरत है । cfps प्रतिक्रियाओं एक उच्च throughput तरीके से सेटअप किया जा सकता है, समानांतर में स्थितियों की एक किस्म के परीक्षण के लिए एक ९६-well प्लेट या पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करके । volumetric पैदावार कम हो जाएगा जब छोटे जहाजों का उपयोग के रूप में चित्रा 2cमें देखा । cfps प्रतिक्रियाओं को भी microliters से कुल प्रतिक्रिया मात्रा के मिलीलीटर के दसियों को बढ़ाया जा सकता है ताकि एक शर्त के लिए कुल प्रोटीन उपज में वृद्धि हुई है । जब मात्रा ऊपर स्केलिंग, प्राथमिक विचार है कि volumetric प्रतिक्रिया पैदावार कमी के रूप में सतह क्षेत्र के लिए मात्रा अनुपात प्रतिक्रिया कम हो जाती है३७,५२. क्रम में पैमाने अप करने के लिए, जबकि प्रोटीन अभिव्यक्ति के समान volumetric पैदावार को बनाए रखने, उपयोगकर्ताओं को कई प्रतिक्रिया वाहिकाओं में प्रतिक्रिया की मात्रा विभाजित करना चाहिए और/ 15 μl-१०० μl से लेकर प्रतिक्रिया तराजू के लिए, समानांतर में कई 15 μl प्रतिक्रियाओं की सिफारिश की जाती है । मात्रा में १०० μl से अधिक की प्रतिक्रियाओं के लिए, फ्लैट-नीचे 24-वेल प्लेट्स की सिफारिश की जाती है, और ६०० μl से अधिक रिएक्शन वॉल्यूम के लिए 12-वेल प्लेट्स की सिफारिश की जाती है । इस तरह की प्रतिक्रिया की मात्रा और वाहिकाओं के pairings पैमाने अप पर volumetric प्रतिक्रिया पैदावार में निरंतरता प्रदान17,31,३७,५२। इन खंडों से परे स्केलिंग समानांतर में थाली के कई कुओं का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है । इस प्रारूप का उपयोग करते हुए, प्रतिक्रिया 10 मिलीलीटर कुल मात्रा के लिए बढ़ाया जा सकता है । प्रतिक्रिया की मात्रा का अनुकूलन-प्रतिक्रिया पोत संयोजन प्रतिक्रिया की उत्पादकता का त्याग किए बिना बायोमानुफैक्चरिंग के अनुप्रयोगों का समर्थन कर सकते हैं ।

जब इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन, वहां कुछ महत्वपूर्ण विचार है कि प्रभाव volumetric प्रतिक्रिया पैदावार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खराब प्रदर्शन निकालने के साथ जुड़े संकेतक हैं । उचित lysis सुनिश्चित करने के लिए और कार्यात्मक transcription/अनुवाद मशीनरी के विकृतन को रोकने के लिए, यह lysis के दौरान उत्पादित गर्मी को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । sonication के दौरान तेजी से गर्मी से फैलने के दौरान एक बर्फ पानी स्नान में सेल resuspension विसर्जित (चित्रा 3a) । प्रभावी कोशिका lysis का एक संकेतक सेल lysate के पूर्व sonicated नमूनों की तुलना में एक गहरा उपस्थिति का उद्भव है (चित्रा 3b) । उपयोगकर्ता लचीलापन के लिए, sonicator और जांच चित्रा 3a में दिखाया १०० μl से वॉल्यूम की एक सीमा के लिए अनुकूलनीय है सस्पेंड कोशिकाओं के 15 मिलीलीटर । इसे पूरा करने के लिए, उपयोगकर्ता कोशिकाओं की वांछित मात्रा के lysis के लिए दिया जूल की संख्या समायोजित कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, निकालने की बड़ी मात्रा दो पूरक दृष्टिकोण के माध्यम से तैयार किया जा सकता है. उपयोगकर्ताओं को समानांतर में कई ट्यूबों sonicate कर सकते हैं, और/या सेल resuspension की बड़ी मात्रा sonicate, आनुपातिक रूप से मात्रा के साथ ऊर्जा की मात्रा स्केलिंग के रूप में पहले वर्णित29,४५। एक और कदम है कि निकालने की गुणवत्ता इंगित करता है कि कोशिका lysis के बाद अपकेंद्रीकरण कदम है । पोस्ट सेल lysis, हम १८,००० एक्स जी पर centrifugation की सिफारिश सतह पर तैरनेवाला के बीच एक स्पष्ट विभाजन प्रदान करने के लिए (transcription/अनुवाद मशीनरी, खंडित जीनोमिक डीएनए जो अब नहीं कार्य करता है टेंपलेट transcription/ इस तरह के सेल झिल्ली और उपजी प्रोटीन के रूप में अवांछित सेलुलर घटकों) (चित्रा 3c). हमने पाया है कि १८,००० एक्स जी पर अपकेंद्रीकरण जुदाई में सुधार, कम गति पर spins की तुलना में सुधार reproducibility में जिसके परिणामस्वरूप १२,००० एक्स जी. सुविधा के लिए, हम अनुशंसा करते हैं एक मेज टॉप रेफ्रिलेटेड अपकेंद्री का उपयोग कर, १२,००० एक्स जी की एक न्यूनतम प्राप्त करने में सक्षम. यह कदम भी सामांयतः ३०,००० एक्स जी, जो अगर उपयुक्त उपकरण उपलब्ध है पर विचार किया जाना चाहिए पर किया जाता है५४,५५,५६,५७,५८, ५९ , ६०. निकालें प्रदर्शन इस कदम है कि उचित जुदाई हासिल की है पर centrifugation गति से प्रभावित नहीं है । जब वांछित सतह पर तैरनेवाला हटाने, यह सबसे अच्छा है किसी भी बादल सामग्री है कि सतह पर तैरनेवाला और गोली के बीच की सीमा पर मौजूद से बचने के बाद से इस संक्रमण निकालने की उत्पादकता कम हो जाएगा । अधिक उत्पादक निष्कर्षों में सतह पर तैरनेवाला परिणामों की शुद्धता के लिए लक्ष्य है और नए उपयोगकर्ताओं के लिए प्राप्त निकालने की कम मात्रा के लायक है ।

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जब हम तरीकों प्रस्तुत किया है reproducible और ंयूनतम विशेषज्ञता के साथ वैज्ञानिकों द्वारा निष्पादित किया जा सकता है, वहां बैच के लिए बैच और प्रतिक्रिया करने वाली प्रतिक्रिया भिंनता हो सकता है । यह lysate पोस्ट-sonication६१के proteomic संरचना में भिन्नता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता है कि हम मनाया जाता है आम तौर पर T7RNAP और मैग्नीशियम सांद्रता के अनुकूलन के साथ पूरकता पर कम है । exogenous इसके अलावा T7RNAP के इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति का समर्थन करने के लिए cfps प्रतिक्रियाओं के बीच आम है, और हम पाते हैं कि T7RNAP के दो स्रोतों-BL21 में अंतर्जात अभिव्यक्ति * (DE3) और पूरक T7RNAP 16 μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए-सुधार नए उपयोगकर्ताओं४५,४६के लिए बैच-से-बैच reproducibility । अनुभव के साथ, उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगों को संशोधित करने के लिए केवल एक ही स्रोत का उपयोग कर सकते हैं T7RNAP यदि वांछित. निकालने के एक नए बैच और मिलीग्राम की उचित समायोजन की कुल प्रोटीन सामग्री का quantification2 + एकाग्रता भी करने के लिए बैच को कम करने के लिए मदद कर सकते हैं-volumetric प्रोटीन अभिव्यक्ति पैदावार में बैच भिन्नता. प्रोटीन अभिव्यक्ति में भिन्नता भी ब्याज के प्रोटीन की आकार और संरचना में मतभेद के कारण हो सकता है, जीन का कोडोन उपयोग और ब्याज के जीन के अपने इसी राइबोसोम बाध्यकारी साइट, साथ ही अभिव्यक्ति वेक्टर के प्रकार का इस्तेमाल किया६२ ,६३. इन कारणों के लिए, कुछ प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में मॉडल प्रोटीन sfgfp व्यक्त नहीं कर सकते, cfps प्रतिक्रियाओं से कम volumetric पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप ।

प्रस्तुत cfps तकनीक की सीमाएं शामिल है कि यह सीधे सेल के सभी अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है मुक्त, चयापचय इंजीनियरिंग और अभिव्यक्ति की स्थिति की ट्यूनिंग के रूप में, प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त संशोधनों के बिना । हालांकि, हम मानते हैं कि यह प्रोटोकॉल नई प्रयोगशालाओं में cfps प्लेटफॉर्म स्थापित करने और उनकी प्रयोगशालाओं में परिचयात्मक सेल-फ्री प्रतिक्रियाओं को लागू करने की क्षमता के साथ गैर-विशेषज्ञों को उपलब्ध कराने के लिए एक आधार प्रदान करेगा । प्रारंभिक कार्यान्वयन के बाद, शोधकर्ताओं ने क्षेत्र में अन्य साहित्य के आधार पर अधिक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अपने स्वयं के संशोधनों बनाने के लिए मंच के साथ प्रयोग कर सकते हैं.

cfps मंच लागत $0.021/μg प्रोटीन (श्रम और उपकरणों की लागत को छोड़कर), हमारी प्रणाली competitively प्रतिक्रिया सेटअप में आसानी से समझौता किए बिना वाणिज्यिक किट के साथ कीमत बना रही है । अभिक्रिया के प्रति μl की तुलनात्मक लागतों का आकलन समान रुझान दर्शाते हैं (पूरक चित्र 1) । हम सभी अभिकर्मकों, और एक sonicator जैसे विशेष उपकरणों के लिए एक अतिरिक्त $३,२०० के लिए ~ $४,५०० होने के लिए स्टार्टअप लागत का अनुमान है । इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए व्यक्ति घंटे जमीन से सभी अभिकर्मक प्रस्तुत करने के लिए ~ 26 ज होने का अनुमान है । हालांकि, एक बार अभिकर्मकों के बड़े शेयरों को तैयार किया गया है, श्रम पर मांगों को काफी कम है । इसके अतिरिक्त, मंच के साथ अनुभव के रूप में प्राप्त की है, हम अनुशंसा करते हैं सेल विकास के आकार को स्केलिंग, निकालने की तैयारी, और समय दक्षता को अधिकतम करने के लिए अभिकर्मक तैयारी. स्टार्टअप लागत को देखते हुए, हम अनुशंसा करते हैं अनुप्रयोगों के लिए cfps प्लेटफ़ॉर्म में सिंथेटिक जीव विज्ञान, उच्च-थ्रूपुट प्रयासों, और प्रोटीन अभिव्यक्ति शर्तों के साथ संघर्ष के कारण पारंपरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लेटफॉर्म्स के साथ असंगत हैं सेल के जैव रसायन और व्यवहार्यता की कमी । इन विशेष मामलों में जहां वांछित तकनीक cfps मंच द्वारा सक्षम है, पर vivo अभिव्यक्ति में cfps की अधिक से अधिक लागत जायज है ।

cfps मंच के निरंतर विकास के लिए इस तरह के एंजाइमेटिक रास्ते, उत्पादन और पारंपरिक रूप से असभ्य प्रोटीन के लक्षण वर्णन के चयापचय इंजीनियरिंग के रूप में जैव प्रौद्योगिकी के प्रयासों के लिए व्यापक उपयोगिता प्रदान करने की संभावना है, nonstandard एमिनो एसिड निगमन और अप्राकृतिक प्रोटीन अभिव्यक्ति, स्तरित चिकित्सा विनिर्माण, और स्टेम शिक्षा६४,६५,६६के लिए कक्षा में प्रयोगशाला से परे विस्तार । इन प्रयासों को आगे cfps मंच के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए जारी प्रयासों के द्वारा समर्थित किया जाएगा । सेल निकालने की संरचना की एक बेहतर समझ में सुधार प्रतिक्रिया पैदावार और प्रतिक्रिया की स्थिति में लचीलापन की ओर जारी शोधन के लिए नेतृत्व करेंगे६१,६७,६८.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष है ।

Acknowledgments

लेखक Dr. जेनिफर vanderkelen, एंड्रिआ laubscher, और तकनीकी सहायता के लिए टोनी ट्रेटो, wesley काओ, layne विलियंस, और क्रिस्टोफर hight सहायक विचार विमर्श के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक भी बिल और लिंडा फ्रॉस्ट कोष, जैव प्रौद्योगिकी धरण जैव प्रौद्योगिकी में आवेदन के लिए केंद्र अनुसंधान बंदोबस्ती अनुदान, काल पाली अनुसंधान, विद्वानों, और रचनात्मक गतिविधियों अनुदान कार्यक्रम (rsca २०१७) से अनुदान समर्थन स्वीकार करते हैं, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (nsf-१७०८९१९) । mzl कैलिफोर्निया राज्य विश्वविद्यालय के स्नातक अनुदान स्वीकार करता है । mcj स्वीकार करता है सेना के अनुसंधान कार्यालय W911NF-16-1-0372, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान mcj-१४१३५६३ और mcj-१७१६७६६, वायु सेना के अनुसंधान प्रयोगशाला उत्कृष्टता अनुदान FA8650-15-2-5518 के केंद्र, रक्षा खतरे में कमी एजेंसी अनुदान HDTRA1-15-10052/P00001, डेविड और lucile packard फाउंडेशन, केमिली dreyfus शिक्षक-विद्वान कार्यक्रम, ऊर्जा मांक अनुदान DE-SC0018249, मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (RGP0015/2017), डो संयुक्त जीनोम संस्थान etop अनुदान के विभाग, और शिकागो सामुदायिक ट्रस्ट में समर्थन के लिए searle कोष से समर्थन के साथ शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs

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रसायन विज्ञान अंक १४४ सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण cfps इन विट्रो प्रोटीन अभिव्यक्ति उच्च थ्रूपुट प्रोटीन संश्लेषण TX-TL सिंथेटिक जीव विज्ञान सेल मुक्त चयापचय इंजीनियरिंग cfps
<em>escherichia</em>कोलाई आधारित सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण: एक मजबूत, लचीला, और सुलभ मंच प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल
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Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).

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