Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar
Summary
Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Nükleer içindeki hücreleri konumlandırma geliştirme ve yenileme içinde birden çok hücresel süreçler için önemlidir. Nükleer konumlandırma en ilginç örnek kas iskelet farklılaşma sırasında oluşur. Kas lifleri (myofibers) kas öncül hücreleri (myoblasts) kas kök bu yayılma ve farklılaşma geçmesi hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir. Doğru nükleer myofibers içinde konumlandırma uygun kas rejenerasyon ve işlevi için gereklidir. Sabit hücreleri tarafından incelendi nükleer hareketi ve hücre davranış çalışmanın zaman içinde engellemektedir ayirt myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu değerlendirmek için genel yordamı kullanır. Burada, canlı hücre görüntüleme tarafından myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir yüksek-den geçerek nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış (yani, yörünge) sırasında farklılaşma ve füzyon elde etmek nükleer otomatik izleme için bir yazılım sağlar.
Introduction
Kas iskelet % 35-40 beden kitle%1toplam insan vücudundaki en büyük dokudur. Uydu hücrelerdir kas kök hücre, anatomik olarak karakterize Proliferasyona myoblasts (myogenic progenitör hücre) ortaya çıkmasına, (kas liflerinin Bazal lamina altından plazma zarı için bitişik), onların konuma göre hangi sonunda ayırt etmek ve varolan myofibers entegre ve/veya sigorta formu yeni myofibers2,3,4‘ e. Onların keşif ve biyolojilerinin çalışma sürüyor kas geliştirme ve yenileme önemli anlayışlar için açmıştır.
Protokolleri yalıtmak ve myoblasts myotubes ayırt etmek için yıllar önce geliştirilmiş ve hala yaygın olarak kas iskelet farklılaşma5,6,7incelemek için kullanılır. Ancak, bu yöntemlerin çoğu sabit hücreleri analizine dayanan ve sonuç olarak, bilim adamları tam olarak myoblast fusion ve myofiber olgunlaşma gibi son derece dinamik süreçler keşfetmek izin vermez statik yordamlar temsil eder. En çarpıcı örnek nükleer konumlandırma, hangi sıkıca başlangıçta myofiber merkezinde çekirdek ile düzenlenir ve, sonra sonra myofiber olgunlaşma8,9çevre bulunan olmasıdır. Canlı görüntüleme daha da kendine özgü bir fenomen anlayışlar elde etmek için en uygun bir tekniktir.
Burada, bilim adamları tarafından hızlandırılmış mikroskopi myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu kaydetmek için ve kantitatif analizleri myoblast çekirdeği otomatik izleme üzerinden gerçekleştirmek için sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem yüksek üretilen iş bir nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış sırasında farklılaşma ve füzyon sağlar. Protokol dört farklı parçalar, yani kas fareler, (2) hindlimbs üzerinden (1 topluluğu mekanik ve Enzimatik sindirim, (3) myoblast yayılması ve farklılaşma ve (4) oluşan birincil myoblasts yalıtım ayrılmıştır çekirdeği ilk 16 h myoblast farklılaşma içinde izlemek için görüntüleme yaşıyor.
Aşağıdaki yordamda, myoblasts H2B GFP fareler izole ve 1 µg/mL olarak yukarıda açıklanan10H2B GFP ifade ikna etmek için Doksisiklin ile tedavi. Alternatif olarak, myoblasts çekirdeği floresan bir protein hızlı diğer transgenik fareler gelen izole veya çekirdek, floresan bir protein hızlı farelerde vahşi-tip üzerinden Pimentel ve ark tarafından açıklandığı gibi izole hücreler transfect mümkündür. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kas lifleri (myofibers) kas kök yayılması ve farklılaşma2,3tabi bu hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon kas öncüleri hücre (myoblasts) tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir, 4. Myoblast farklılaşma değerlendirmek için orta farklılaştırılması ve MyHC, bir işareti farklılaşma ve, boyama boyama ayirt gerçekleştirmek için farklı zaman noktalarda hücreleri tamir myoblasts Kültür ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser AFM-Telethon E.V. (#21545) için ve Ospedale San Raffaele (OSR) tohum Grant için S.Z. (ZAMBRA5X1000) tarafından desteklenmiştir. Dr. Jean-Yves Tinevez Institut Pasteur görüntü analiz merkezden genel olarak onun “Basit izci” MATLAB rutinleri paylaşımı için kabul edilmektedir.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
