Summary
Skelettartiger Muskel Differenzierung ist ein sehr dynamischer Prozess, der besonders auf nukleare Positionierung stützt. Hier beschreiben wir eine Methode um Kerne Bewegungen von live Cell Imaging während Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung verfolgen und eine quantitative Charakterisierung der Kerne Dynamik durch Extrahieren von Informationen aus automatisches Tracking durchzuführen.
Abstract
Nukleare Positionierung innerhalb der Zellen ist wichtig für mehrere zelluläre Prozesse in Entwicklung und Erneuerung. Die faszinierendste Beispiel für nukleare Positionierung tritt während der Skelettmuskulatur Differenzierung. Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen gebildet durch die Fusion von Muskel Vorläuferzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung zu unterziehen. Richtige nukleare Positionierung innerhalb Myofibers ist erforderlich für die ordnungsgemäße Muskelregeneration und Funktion. Des gemeinsamen Verfahrens Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung Bewertung stützt sich auf feste Zellen analysiert durch Immunfluoreszenz, die das Studium der atomaren Bewegung und Zelle Verhalten im Laufe der Zeit behindert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Analyse von Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung von live Cell Imaging. Wir bieten eine Software für die automatisierte nuklearen Verfolgung eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten (d. h. die Flugbahn) während der Differenzierung und Fusion zu erhalten.
Introduction
Skelettmuskulatur ist das größte Gewebe im menschlichen Körper, in Höhe von 35 % - 40 % des Körper-Masse-1. Satellitenzellen sind Muskelstammzellen, anatomisch zeichnet sich durch ihre Position (gegenübergestellt, der Plasmamembran, darunter die Basallamina der Muskelfasern), die wuchernden Myoblasten (myogen Vorläuferzellen) hervorrufen, die schließlich unterscheiden und in bestehende Myofibers integrieren bzw. Sicherung in Form neuer Myofibers2,3,4. Ihre Entdeckung und den Fortschritt in der Studie von ihrer Biologie führte zu bedeutende Einblicke in Muskelaufbau und Regeneration.
Protokolle zu isolieren und zu differenzieren Myoblasten in Myotubes wurden vor vielen Jahren entwickelt und sind noch weit verbreitet, Skelettmuskel Differenzierung5,6,7zu studieren. Jedoch sind die meisten dieser Methoden statischen Verfahren, die verlassen Sie sich auf die Analyse von festen Zellen und folglich erlauben keine Wissenschaftler, hochdynamische Prozesse, wie z. B. Myoblast Fusion und Myofiber Reifung zu erforschen. Das markanteste Beispiel ist nuklearen Positionierung, welche streng reguliert, mit Kernen zunächst in der Mitte der Myofiber und, dann, befindet sich an der Peripherie nach Myofiber Reifung8,9. Live Bildgebung ist die am besten geeignete Technik um weitere Einblicke in dieses eigenartige Phänomen zu erhalten.
Hier beschreiben wir eine Methode, die Wissenschaftler Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung von Time-Lapse Mikroskopie aufzuzeichnen und Quantitative Analysen über die automatische Verfolgung der Myoblast Kerne ausführen zu können. Diese Methode bietet eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten während der Differenzierung und Fusion. Das Protokoll vier verschiedene Teile, nämlich (1) die Sammlung von Muskeln aus der Hintergliedmaßen von Mäusen, (2) die Isolierung der primären Myoblasten gliedert sich in die mechanische und enzymatische Verdauung, (3) Myoblast Proliferation und Differenzierung (4) besteht Live-imaging, Kerne innerhalb der ersten 16 h der Myoblast Differenzierung zu verfolgen.
In der folgenden Prozedur Myoblasten von H2B-GFP Mäusen isoliert und mit 1 µg/mL von Doxycyclin induzieren H2B-GFP Ausdruck, wie zuvor beschrieben10behandelt. Alternativ ist es möglich, die Myoblasten aus anderen transgenen Mäusen isolieren, die ein fluoreszierendes Protein im Zellkern ausdrücken oder isolierten von Wildtyp Mäusen ein fluoreszierendes Protein im Zellkern, zum Ausdruck bringen, wie von Pimentel Et al. beschrieben Zellen zu transfizieren. 9.
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Protocol
Alle Verfahren, die tierische Themen wurden durch die San Raffaele institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Präparation der Maus Megalosauridae Muskeln
- Pinzetten und Scheren (gerade und gebogene) durch Autoklavieren zu sterilisieren.
- Vorbereiten und Filtern (0,22 µm) alle Medien (blockierende Medium, Medium, Verdauung, wuchernden Medium und Medium zu unterscheiden) vor Beginn des Experiments (siehe Tabelle der Materialien).
- Setzen Sie 5 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 35 mm Petrischale für Muskel-Sammlung.
- Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder mithilfe von CO2 zu und sterilisieren Sie die Haut mit Ethanol. Entfernen Sie die Haut von der Hinterbeine und der oberen Gliedmaßen mit Schere und Pinzette, um die Isolation der Muskeln zu erleichtern.
Hinweis: Muskeln können von Neugeborenen oder Erwachsenen Mäusen isoliert werden. Neugeborene Mäuse haben eine erhöhte Anzahl von Satelliten-Zellen im Vergleich zu Erwachsenen Mäusen. Die Gesamtzahl der Satellitenzellen, die aus einer einzigen Erwachsenen Maus isoliert werden können ist jedoch ausreichend, um die unten beschriebenen Experiment durchführen. - Tibialis, Soleus Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL), Gastrocnemius, Quadrizeps und Trizeps zu isolieren, und steckte sie in die Petrischale mit PBS. Lassen Sie die Schale auf Eis. Entfernen Sie sehnen und Fett mit sterilisierten Schere und Pinzette sorgfältig.
2. Isolierung der primären Myoblasten
Hinweis: Alle Verfahren für die Zellkultur sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Entfernen Sie die Muskeln von PBS. Schneiden Sie und zerkleinern Sie die Muskeln mit sterilen gebogene Schere, bis eine einheitliche Masse entsteht. Setzen Sie die Muskel-Stücke in einer 50 mL-Tube.
- Die Muskel-Stücke 10 mL des Mediums Verdauung hinzu und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter starkem rühren (250 min-1) in einem Wasserbad, um die Muskulatur enzymatisch zu verdauen.
- Fügen Sie 10 mL Dulbecco des Adlers 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin und Gentamicin 1 % (blockierende Mittel), die Verdauung zu stoppen-haltigem Medium (DMEM) geändert.
- 40 X g für 5 min zentrifugiert und den Überstand in ein 50 mL-Tube sammeln. Speichern Sie das Pellet auf Eis.
Hinweis: Nach der Zentrifugation enthält der überstand einige Satelliten-Zellen, Blutkörperchen, Endothelzellen und Fibroblasten, während das Pellet Stücke von unverdauten Muskel- und Bindegewebe enthält. Um die Anzahl der isolierten Zellen zu erhöhen, muss zusätzliche Schritte der Verdauung wie unten beschrieben das Pellet unterzogen werden. - Zentrifugieren dem Überstand bei 650 X g für 5 min. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen das Pellet in 1 mL DMEM mit 10 % FBS. Halten Sie die resuspendierte Pellet auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,5 2 X für den Rest des Geschosses im Schritt 2.4 erhalten und fügen Sie anschließend resuspendierte Pellets zum ersten resuspendierte Pellet konserviert auf Eis.
- Übergeben Sie die resuspendierte Pellets durch einen 70 µm-Filter und dann durch einen 40 µm-Filter. 15 mL DMEM mit 10 % FBS und Zentrifuge bei 650 X g für 5 min hinzufügen.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL der roten Blutzelle Lysis Puffer, zum Abbau der roten Blutkörperchen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 40 mL PBS zu stoppen die lyse der roten Blutkörperchen und Zentrifugieren bei 650 X g für 5 min. Überstands entfernen und erneut das Pellet in 5 mL DMEM mit 10 % FBS.
- Als preplating Schritt Platte Zellen in 20 mL Medium der Verbreitung in einer 150 mm unbeschichtet Petrischale. Nach 1 h Inkubation in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) das Medium zu sammeln.
Hinweis: Fibroblasten, Befestigung an der Platte werden dann verworfen, während Satellitenzellen in der Schwebe bleiben. - Wiederholen Sie Schritt 2,9 3 x und im letzten Schritt preplating, sammeln Sie das Medium, das die Satelliten-Zellen in der Suspension enthält.
- Zentrifuge bei 650 X g für 5 Minuten.
- Während die Zellen Zentrifugieren sind, Mantel zwei 150 mm Petrischalen mit Kollagen (10 mL einer 0,1 % igen Lösung in 0,1 M Essigsäure). Dies zu tun, das Kollagen auf die Platte legen, 5 min inkubieren, entfernen es. Lassen Sie die Platte für 30 min trocknen.
- Verwerfen des Überstands in Schritt 2.11 erhaltenen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 mL Verbreitung Medium (Table of Materials). Platte der Zellen auf zwei 150 mm Kollagen-beschichteten Petrischalen (20 mL pro Teller) und halten Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2) im Medium der Verbreitung für 2 – 3 Tage mit 1 µg/mL von Doxycyclin, H2B-GFP Expression induzieren.
Hinweis: In diesem Schritt können die Verbreitung von Myoblasten, eine höhere Anzahl von Zellen für weitere Tests zu erhalten. Zelldichte bleibt sehr niedrig, um eine spontane Ausdifferenzierung der Myoblasten in Myotubes zu vermeiden.
3. Myoblast Proliferation und Differenzierung assays
Hinweis: Wenn Myoblast Dichte hoch ist, einige Zellen initiieren Dehnung, und dann ist es notwendig, die Zellen geteilt. Im Allgemeinen ist es möglich, Zellen 2 x-3 x zu teilen, ohne Auswirkungen auf den Phänotyp.
- Entsorgen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS, fügen Sie 2 mL Trypsin (1 X), und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer Zelle Inkubator für 5 min. Check unter die Lupe genommen und, wenn Rundzellen zu lösen, fügen 5 mL DMEM mit 10 % FBS, die Trypsin zu inaktivieren. Die Anzahl der Zellen (in der Regel ist es möglich, ca. 1 x 106 Zellen/Maus zu erhalten).
Hinweis: Inkubation mit Trypsin für 5 min ist in der Regel genug, um die wuchernden Myoblasten lösen. - Unterziehen Sie die Zellen auf eines der unten beschriebenen Assays.
-
Verbreitung-assay
- 50.000 Zellen/Brunnen in 1 mL/auch der Verbreitung von mittlerer eine Kollagen-beschichtete 12-Well-Platte-Platte und inkubieren Sie die vergoldeten Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2). Beheben Sie und zählen Sie die Zellen 24, 48 oder 72 h.
Hinweis: Das Medium wird alle 48 h ersetzt, um Nährstoff Erschöpfung zu vermeiden.
- 50.000 Zellen/Brunnen in 1 mL/auch der Verbreitung von mittlerer eine Kollagen-beschichtete 12-Well-Platte-Platte und inkubieren Sie die vergoldeten Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2). Beheben Sie und zählen Sie die Zellen 24, 48 oder 72 h.
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Differenzierung-assay
- Bestreichen Sie eine 12-Well-Platte mit 350 µL Differenzierung mittlere enthaltenden Basalmembran Matrix (1: 100). Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 30 min und entfernen Sie das Medium.
- Platte 200.000 Zellen/Brunnen mittelfristig Differenzierung in der Matrix-beschichtete Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2) bis sie an der Platte haften (2 h sind in der Regel genug für die Zellen haften und Differenzierung zu starten).
- Um Differenzierung zu beurteilen, führen Sie beflecken für Myosin heavy Chain und Kerne als zuvor beschriebenen11. Alternativ führen Sie live-Imaging-Analysen, wie unten beschrieben.
-
Verbreitung-assay
4. Live-Darstellung der Myoblast Differenzierung und nukleare tracking
- Für live Cell imaging habe die Zellen, in Abschnitt 3.2.2 erhalten und in einem 12-Well-Platte unter einem confocal Mikroskop, ausgestattet mit einem Inkubationssystem weiterhin die Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2vernickelt.
- Verwenden Sie eine trockene Objektiv 20 X (0,7 NA) Gesichtsfelder bekommen mit Hunderten von Zellen genug Myofiber Bildung zu überwachen. H2B-GFP Zellen können mit einem niedrigen 488 nm Argonlaser abgebildet werden.
Hinweis: Ein offenes Loch sorgt dafür, dass die Bildtiefe (~ 10 µm) die Dicke der Zelle enthält, so dass Zellen im Fokus in das Experiment gehalten werden. Mit einem konfokalen Mikroskop ist vorteilhaft, da es das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes verbessert, obwohl Weitfeld-Mikroskopie auch verwendet werden könnte. Myofiber Bildung kann durch den Übertragungskanal überwacht werden. - Bilder von 16-Bit- und 1.024 x 1.024 Pixel pro Bild alle 6 min. 16 h zu erwerben. Für jede erworbene Position eine multiframe.tif-Datei erzeugen (siehe Beispiel in der Zusätzlichen Dateien).
Hinweis: Dieses Protokoll ist kommerzieller Software, verbunden mit dem Mikroskop (Table of Materials) benutzt worden; Verwenden Sie die entsprechende Software, um das gleiche Ziel zu erreichen, wenn andere Mikroskope mit. - Laden Sie die Software als eine ZIP- Datei zusätzlichezur Verfügung gestellt.
Hinweis: Die Routinen sind Skripte, die in MATLAB ausgeführt werden müssen. Die Software ist eine Adaption eines veröffentlichte Software12 optimiert für das Tracking der Kerne bei Myotube Bildung. Diese Software ist in zwei Teile geteilt: das erste man identifiziert die Kerne in jedem Frame durch Segmentieren sie, während die zweite "Tracks" (Trajektorien) von Kernen Bewegung erzeugt. Der vollständige Code für nukleare Segmentierung und Tracking und eine schrittweise Anleitung zum Einstieg sind in den Zusätzlichen Dateienzur Verfügung gestellt. - Entpacken Sie die Zipdatei und speichern Sie sie in einen gewünschten Pfad auf den heimischen Computer (PC) im Einsatz. Führen Sie alle die folgenden Passagen auf einem PC mit der notwendigen Software bereits installiert. Beachten Sie, dass die ZIP-Datei besteht aus drei Ordner, wie weiter unten erwaehnt.
Hinweis: Segmentierung Routinen enthält die Funktionen für die Segmentierung ausgeführt werden. Tracking-Routinenenthält stattdessen notwendigen Funktionen für das Tracking. Tracking-Beispiel Segmentierung bietet grundlegende Skripte und Dateien mit dem System vertraut zu machen. Die Software verwendet für die Segmentierung und Verfolgung von den Kernen läuft einwandfrei in MATLAB, R2015a oder spätere Versionen. - Um die Kerne aus der TIF-Datei zu segmentieren, benennen Sie die Datei, z. B. NameFile.tif.
- Öffnen Sie die Beispiel Segmentierung Tracking -Ordner, und klicken Sie auf DoSegmentation.m. Dies öffnet das Befehlsfenster in MATLAB.
- Überprüfen Sie die Aktuellen Ordnerfenster auf der linken Seite zu sehen, alle Elemente im Ordner " Beispiel der Segmentierung Tracking ". Doppelklicken Sie auf DoSegmentation.m.
Hinweis: Detaillierte Informationen über die Änderungen, die im Skript erfolgen finden Sie in der Datei StepbyStep.txt. Es ist zwingend erforderlich, um das Skript zu ändern, so dass die Variable Filenameinput NameFile.tif und Folderinput ist der Ordner, wo die TIF-Datei enthalten ist. - Führen Sie das Skript (durch einen Klick auf die grüne Schaltfläche " Ausführen "). Das Ergebnis der Segmentierung wird als eine file.mat (SegmentedNameFile.mat), gespeichert werden, während die Segmentierung der Kerne in der Ausgabe Abbildung visualisiert werden kann.
Hinweis: Parameter für die Segmentierung, beschrieben in dem Skript können bei Bedarf geändert werden. Die Qualität der Segmentierung kann überprüft werden, mit dem Skript CheckSegmentation.m (siehe die StepbyStep.txt-Datei). Auf dieser Grundlage, wenn die Qualität der Segmentierung schlecht ist (nur ein paar Kerne erkannt), passen Sie die Parameter der Segmentierung, deutlich im DoSegmentation.m Skript, und wiederholen Sie den Vorgang.
- Um die Tracks (d. h. die Flugbahnen der einzelnen Kerne in der Zeit) zu erzeugen, mit den nuklearen Positionen in der Segmentierung erhalten das Skript GenerateTracks.m in denselben Arbeitsordner. Achten Sie darauf, die richtige Segmentierung Datei als Eingabe hinzufügen erhaltenen vor (siehe die StepbyStep.txt-Datei für weitere Informationen).
Hinweis: Als Ausgang, erhält der Benutzer eine Datei TrackedNameFile.mat, mit einer Matrix für die X-Koordinaten und einer anderen Matrix für die y-Koordinaten der generierten Tracks. - Bewertung der Qualität der Titel mit CheckTracking.m (siehe die StepbyStep.txt-Datei für weitere Informationen). Mithilfe der Ausgabe Abbildung dieser letzten Passage jede Position der Kerne in der Zeit zu visualisieren. Überprüfen Sie auf der linken Seite für grüne Kreuze, die jeder segmentierten Kern angeben. Um einen bestimmten Kern auszuwählen, verwenden Sie die untere Bildlaufleiste. Beachten Sie, dass der ausgewählten Kern eingekreist werden in rot, während auf der rechten Seite die Flugbahn der markierten Zelle kann gefolgt werden rechtzeitig (über der oberen Scrollbar).
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Representative Results
AKW-Bewegung automatisch während Myoblast Differenzierung in der live-Bildgebung zu folgen, sollte die Kerne bevorzugt Eindringmittel beschriftet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass mit verschuppen DNA-Moleküle nicht machbar ist, da diese Moleküle die Proliferation und Differenzierung von primären Myoblasten13stören. Als Beispiel wurden Proliferation und Differenzierung in primären Myoblasten kultiviert, mit oder ohne Hoechst (Abbildung 1) analysiert. Es ist offensichtlich, dass (Abbildung 1A, B) Proliferation und Differenzierung (Abbildung 1, Mitte) in Myoblasten kultiviert mit Hoechst 33342 stark beeinträchtigt sind. Umgekehrt Myoblasten von H2B-GFP Mäusen isoliert und kultiviert mit Doxycyclin haben Kerne mit grünen Fluoreszenz und ebenso zur Myoblasten isoliert von Wildtyp Mäusen (Abbildung 1, rechts und links Platten, beziehungsweise) zu unterscheiden.
Live Cell Imaging mit primären Myoblasten, die mit dem Ausdruck der H2B-GFP-Protein ermöglicht die Verfolgung von Kerne während der Differenzierung (Abbildung 2 und ergänzende Video 1). Bilder von Übertragung und GFP-Kanälen auf die initiale (Abbildung 2A) und letztes Mal, die Punkte (Abb. 2 b) während der Differenzierung der H2B-GFP Myoblasten können Wissenschaftler identifizieren, Myotubes und infolgedessen die Kerne, die am Ende zusammengeführt Integration in eine Myotube (z. B. den Zellkern im blauen Kreis) oder Kerne, die nicht zu einem Myotube (z. B. den Zellkern im roten Kreis) verschmelzen zu tun.
Um Informationen über die Kerne/Zellbewegungen aus den live Cell imaging Daten zu extrahieren, ist es möglich, die mitgelieferte Software zu verwenden, um die Flugbahnen der Atomkerne zu verfolgen. Die Software nutzt das Bild aus dem H2B-GFP-Kanal (die Kerne; Abbildung 3A) Erstellen Sie eine Maske und die Kerne in jedem Frame segment. Für nukleare Segmentierung in einem Frame ist ein "konservativer" Schwellenwert ausgewählt Otsu Methode auf dem Bild nach Gauß Filterung14. Als nächstes Objekte sind etwa segmentiert; um eine feinere Segmentierung zu erhalten, wird jedes Objekt erneut mit einer Schwelle, basierend auf dem Durchschnitt in den Begrenzungsrahmen maskiert. Eine Wasserscheide-Transformation wird dann verwendet, um nahe Objekte (Abb. 3 b) zu trennen. In unseren Händen eine Wasserscheide Transformation ist nicht gelungen, die meisten in der Nähe Kernen zu trennen (Abb. 3 b, * Einschub). Daher wir Bereich verwendet, um größere Objekte im Bild auswählen und anwenden einer neuen Wasserscheiden-Transformation (Abb. 3 b, ** Einschub), das ist in der Lage, in der Nähe Kernen zu trennen. Mit diesem Ansatz sind die meisten der Kerne im Bild (Abbildung 3) gekennzeichnet.
Um die Kerne zu verfolgen, haben wir durch die Integration der Tracking-Routinen von Tinevez15veröffentlicht die Routinen verbessert. Kurzum, verbindet der Tracking-Algorithmus Kerne erkannt in aufeinanderfolgenden Rahmen mit dem Ziel der Minimierung der Summe der Abstände zwischen der Position des einzelnen Kerns in einem Frame und die Position von den gleichen Kern in den nächsten ein, mit dem "ungarischen-Algorithmus" für eine solche Minimierung16. Der Schritt wird wiederholt, um unverknüpfte Kerne zu verbinden, die eine bestimmte maximale Anzahl von Frames entfernt. Ein Grenzwert für die maximale Entfernung zwischen der Position eines Objekts in einem Frame und dem andern steht fest. Für die hier vorgestellten Daten geben eine maximale Anzahl von fünf Frames und einer maximalen Entfernung von 20 Pixel pro Schritt eine hohe Anzahl von richtigen Tracks (Abbildung 3D). Wichtig ist, können wir diese Routinen verwenden, um die Qualität der Nachführung. Es ist auch möglich, dieses Skript verwenden, um Zellen zu finden, die eine bestimmte Verhalten, zum Beispiel bilden (oder nicht) haben eine Myofiber, und anschließend analysieren die dynamischen Eigenschaften des Satzes von Zellen von Interesse.
Die angewandte Software generiert die Gleise mit den x- und y-Koordinaten für jede Zelle im Rahmen n, 
, für Hunderte von Zellen (Abbildung 3D). Wir können solche Informationen verwenden, um Informationen über Kerne Bewegung zu extrahieren. Als Beispiel der Gesamthubraum zwischen der erste Frame (n = 0) und der letzte Frame N wird wie folgt definiert.
Verschiebung von einer Flugbahn = || 
||
Hier, "|| · ||" steht für die Norm des Vektors (Abb. 4A).
Die Geschwindigkeit von jedem Kern in Frame n lautet wie folgt.
Dann können wir die Länge der Flugbahn für eine bestimmte Zelle wie folgt definieren.
Länge der Bahn =
Als ein Beispiel, wie diese einfache Parameter bereits relevanten Informationen geben können berechneten wir die Länge der Kerne Bahnen der Myoblasten inkubiert, mit oder ohne Hoechst. Es scheint, dass die Gesamtlänge der Bahnen etwas höher für Zellen mit Hoechst, befleckt ist, obwohl der Unterschied nicht signifikante (Abbildung 4 b). Aber wenn wir den Gesamthubraum während ein Zeitraffer berechnet, beobachtet wir, dass Gesamthubraum von Zellen befleckt mit Hoechst deutlich kleiner als die des ungefärbten Zellen (Abbildung 4 war). Dies bedeutet, dass die Bewegung der gefärbten Zellen eine niedrigere Direktionalität hat. Um diese Hypothese weiter zu stärken, quantifiziert wir die Ausrichtung der Bewegung einer Zelle durch Berechnung den Winkel der Geschwindigkeit in jedem Frame (Abb. 4A).
Wir quantifiziert auch die Variation des Winkels zwischen den Frames.
Die Gesamtwinkel Variation entlang einer Flugbahn kann dann wie folgt definiert werden.
Winkel-Variante Gesamt =
Wie vorhergesagt die Gesamtwinkel Variation für die ungefärbten Zellen deutlich kleinere Zellen befleckt mit Hoechst (Abbildung 4) gegenüber. Daher, diese einfache Maßnahme der Richtwirkung, gewonnen aus einer einfachen Berechnung zufolge der Myoblasten mit Hoechst befleckt sind weniger anfällig für die Richtung ihrer Vertreibung pflegen widerspiegelt ihre beeinträchtigte Fähigkeit bei der Bildung Myotubes (Abbildung 1).
Kurz gesagt, live Cell imaging Daten generiert, wie hier beschrieben bieten einen quantitativen Zusammenhang zwischen atomaren Dynamik und die Fähigkeit, Form Myotubes und können als Eingabe für eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast verwendet werden Verhalten während der Differenzierung und Fusion.
Abbildung 1: Inkubation mit Hoechst stört die Proliferation und Differenzierung der Myoblasten. (A) repräsentative Bilder von primären Myoblasten gebeizt mit Hoechst nach 24 h im Medium der Verbreitung (linken) oder für 24 h im Medium der Verbreitung mit Hoechst (rechte Abbildung) und (B) die relative Quantifizierung kultiviert. Daten sind der Mittelwert ± SEM und die statistische Signifikanz wurde bewertet mit der Student t-test. P < 0,05. (C) repräsentative Bilder von primären Wildtyp Myoblasten, kultiviert für 24 h bei der Unterscheidung von Medium ohne (linken) oder Hoechst (mittlere Panel), mit der H2B-GFP Myoblasten für 24 h bei der Unterscheidung von Medium (rechte Abbildung) kultiviert und gebeizt Hoechst (blau) mit einem Antikörper Anti-Myosin heavy Chain (MyHC; rot). Der Maßstabsbalken = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Live-Darstellung der H2B-GFP Myoblasten während Differenzierung. Zusammengeführte Bilder des Getriebes und GFP Kanäle bei (A) die erste (t = 0 h) und (B) letztes Mal Punkte (t = 16 h) während die Differenzierung der H2B-GFP Myoblasten (20 X Objektiv). Einige Beispiele für Myotubes sind mit schwarzen Pfeile im Bedienfeld " B" markiert. Der Maßstabsbalken = 50 µm. (C) Magnified punktiert Bereiche von Platten A und B in dem ist es möglich, einen einzigen Kern zu identifizieren, die Integration in eine Myotube (in blau) landet oder nicht (rot) bei t = 0 h, t = 8 h und t < / C12 > = 16 h. Der Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Segmentierung der H2B-GFP Myoblasten während der Differenzierung. (A) Beispiel für einen Rahmen von der Zeitabläufe, die Kerne von ca. 400 Zellen zeigen. (B) Beispiel für Kerne Maskierung und Segmentierung. Helle Objekte sind segmentiert, mit einer globalen und lokalen Schwelle, und Wasserscheiden-Transformation wird angewendet, um in der Nähe Kernen zu trennen. Nahe gelegenen Kerne könnte schwierig sein, Segment (* Einschub), so dass eine zweite Wasserscheide-basierte Segmentierung in Objekten von großen Flächen, eine höhere Anzahl von Kernen zu segmentieren durchgeführt wird (** Einschub). (C) erkannt, dass nukleare Positionen (rote Kreuze), die später in der Tracking-Algorithmus verwendet. (D) Tracks mit der Tracking-Algorithmus, der die Summe der Abstände zwischen den einzelnen Objektposition in zwei aufeinander folgenden Frames minimiert erzeugt. Möglicher Maximalwert von solchen Abstand für jedes Objekt ist als Input zur Verfügung gestellt, die Wissenschaftlern erlaubt, Kerne getrennt durch mehr als einen Frame zu verknüpfen. Der Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Quantitative Analysen der Kerne Dynamik aufzudecken die beeinträchtigte Fähigkeit der Myoblasten inkubiert mit Hoechst zu Zelle Direktionalität. (A) Beschreibung der Parameter-Messungen. Es ist möglich, die Geschwindigkeit eines Zellkerns zu definieren, indem man die Position in zwei aufeinander folgenden Frames. Die Flugbahn-Winkel und der Winkel-Variante können dann leicht von den Positionen berechnet werden wie im Programm angegeben. (B) Vertrieb von Trajektorien Länge, Gesamthubraum (C) und (D) Variation des Winkels Flugbahnen der Myoblasten inkubiert ohne Hoechst (grüne Linie) oder mit Hoechst (blaue Linie). Die beiden Distributionen unterscheiden sich nicht wesentlich, während der Gesamthubraum deutlich höher ist, und die Variation des Winkels wesentlich niedriger bei ungefärbten Zellen ist (einseitige Kolmogorov-Smirnov Test *p < 0,05 und **p < 0,005). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Video 1: Live-Darstellung der H2B-GFP Myoblasten während Differenzierung. Bildgebung des H2B-GFP Myoblasten kultiviert im Medium von der ersten unterscheiden (t = 0 h) zum letzten Mal Punkte (t = 16 h) mit Getriebe und GFP-Kanäle (20 X Objektiv). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen, die gebildet werden, durch die Fusion von Vorstufen Muskelzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung2,3unterzogen werden, 4. Um Myoblast Differenzierung zu beurteilen, besteht das gemeinsame Verfahren der Myoblasten in Medium zu unterscheiden und Fixierung der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen Immunfluoreszenz-Färbung für MyHC, ein Marker für Differenzierung und Färbung der Kultivierung Kerne mit verschuppen DNA-Moleküle (z. B. Hoechst)5. Diese Methode ist nützlich, Myoblast Differenzierung zu bewerten, durch die Messung verschiedener Parameter wie die Differenzierung Index (Anzahl der MyHC-positiven Zellen/Gesamtzahl Zelle) oder der Fusion-Index (Anzahl der Myotubes mit mindestens zwei Kerne Zelle/Gesamtzahl) . Allerdings sind Myoblast Fusion und Myotube Bildung hochdynamische Prozesse, die auf die Motilität der Kerne8angewiesen. In der Tat ist die nukleare Positionierung innerhalb Myofibers für richtige Muskelregeneration und Funktion17erforderlich. Die Mobilität von Myoblasten und ihre Kerne könnte erweisen sich als ein kritischer Parameter, Myoblast Differenzierung zu bewerten und zu neuartigen bei muskulären Erkrankungen aufdecken. Daher ist es entscheidend für die Entwicklung neuartiger Verfahren zur Zelle Verhalten und AKW-Bewegung während Myoblast Differenzierung und Myofiber Gestaltung zu studieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, die Wissenschaftler, Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung von live Cell Imaging zu folgen und Quantitative Analysen von die automatische Verfolgung der Kerne durchführen können. Der Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, während der Differenzierung der fluoreszierenden Kernen der Myoblasten, isoliert von H2B-GFP Mäuse, ohne jede Zelle Transfektion oder zusätzliche Färbung zu verfolgen. Die H2B-GFP-Mäuse sind im Handel erhältlich und somit leicht zugänglich. Alternativ ist es möglich, die Myoblasten aus anderen transgenen Mäusen isolieren, die ein fluoreszierendes Protein im Zellkern ausdrücken oder um die Zellen zu transfizieren isoliert von Wildtyp Mäusen ein fluoreszierendes Protein im Zellkern als zuvor beschriebenen9 auszudrücken . Diese verschiedenen Optionen weiter erweitern die Einsatzmöglichkeiten der hier vorgestellten Methode.
Das aktuelle Protokoll stützt sich auf die Kultur der primären Myoblasten, und folglich eine hohe Variabilität in den folgenden experimentellen Verfahren, auch aufgrund des möglichen Vorhandenseins von nonmyogenic Zellen nach der Isolierung von Muskeln18 beobachtet werden könnte . Um diese Einschränkung zu umgehen, ist es möglich, Myoblasten von Zelle Sortierung wie zuvor beschrieben19zu isolieren. Ein weiterer kritischer Punkt in die hier beschriebene Methode ist die Schwierigkeit, einen perfekten Tracking der Kerne zu generieren, wenn Zellen nah beieinander, wie z. B. bei Myotube Bildung sind. Jedoch die hier besprochenen Softwareroutinen können Wissenschaftler überprüfen Sie die Qualität der Nachführung und, falls erforderlich, um eine Teilmenge von Zellen von Interesse für eine spätere Analyse auszuwählen. Weitere Verbesserung der Software möglicherweise erforderlich, eine vollständige Charakterisierung der nuklearen Dynamik während Myofiber Bildung bereitzustellen.
Zusammenfassend ist diese Methode sinnvoll, quantitative Einblick in Kernen Dynamik während Myoblast Differenzierung durch den Vergleich der verschiedener Bedingungen, wie wir mit Hoechst Inkubation berichtet. Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit, aussagekräftige, dynamische Daten von Zeitraffer Experimente zu extrahieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das AFM-Telethon e.v. (#21545) und durch das Ospedale San Raffaele (OSR) Samen Zuschuss an S.Z. (ZAMBRA5X1000) unterstützt. Dr. Jean-Yves Tinevez aus dem Bild-Analyse-Hub des Institut Pasteur ist anerkannt für die gemeinsame Nutzung öffentlich seine "Einfache Tracker" MATLAB-Routinen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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