Summary

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

Published: April 13, 2019
doi:

Summary

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

세포 내에서 핵 위치 하는 것은 여러 세포 프로세스 개발 및 재생에 중요 합니다. 핵 위치의 가장 흥미로운 예제 골격 근육 분화 동안 발생합니다. 근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 증식과 분화를 받 다 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성. Myofibers 내에서 정확한 핵 위치 하는 것이 적절 한 근육 재생 및 기능에 대 한 필요 합니다. Myoblast 차별화와 myofiber 형성 평가 하는 일반적인 절차는 고정된 세포 면역 형광 검사, 시간이 지남에 핵 운동 및 셀 동작의 연구를 방해에 의해 분석에 의존 합니다. 여기, 라이브 셀 이미징에 의해 myoblast 차별화와 myofiber 형성의 분석 하는 방법을 설명합니다. 차별화 및 퓨전 중 핵 역동성 및 myoblast 행동 (즉, 궤적)의 높은 처리량 양적 특성을 얻기 위해 자동화 된 핵 추적에 대 한 소프트웨어를 제공 하 고.

Introduction

골격 근육 몸 질량1의 35%-40%에 달하는 인체에서 가장 큰 조직 이다. 인공위성 세포는 근육 줄기 세포, 해부학 적 특징 확산 myoblasts (조직적 조상 세포)을 일으키 다, (플라즈마 막 아래 근육 섬유의 기저 lamina에 juxtaposed), 그들의 위치는 결국 차별화 및 기존 myofibers에 통합 그리고/또한 형태 새로운 myofibers2,,34퓨즈. 그들의 발견 및 그들의 생물학 연구에서 근육 발달 및 재생에 중요 한 통찰력을 주도하 고 있다.

격리 하 고 myotubes로 myoblasts 분화 프로토콜 많은 년 전에 개발 되었습니다 하 고 골격 근육 감 별 법5,,67공부에 아직도 널리 이용 된다. 그러나, 이러한 방법의 대부분 고정된 셀의 분석에 의존 하 고, 따라서 완전히 myoblast 퓨전 myofiber 성숙 등 매우 역동적인 과정을 탐구 하는 과학자를 허용 하지 않는 정적 프로시저를 나타냅니다. 가장 눈에 띄는 예는 단단히 통제, 처음에 myofiber의 중심 핵과 이며, 다음, myofiber 성숙8,9후 주변에 있는 핵 위치입니다. 라이브 영상 추가 같은 독특한 현상에 대 한 통찰력을 얻을 수 가장 적합 한 기술입니다.

여기, 우리 과학자 myoblast 차별화 및 myotube 형성 시간 경과 현미경으로 기록 하 고 myoblast 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행할 수 있도록 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 차별화와 퓨전 중 핵 역동성과 myoblast 행동의 높은 처리량 양적 특성을 제공합니다. 프로토콜은 나누어 4 개의 다른 부분, 즉 (1) 컬렉션 (2) 마우스의 hindlimbs에서 근육의 기계 및 효소 소화, (3) myoblast 확산 및 감 별 법, (4)으로 구성 된 기본 myoblasts의 격리 핵 myoblast 차별화의 첫 번째 16 h 내 추적 영상 라이브.

다음 절차에서는 myoblasts H2B GFP 마우스에서 격리 되며 doxycycline H2B GFP 표현, 앞에서 설명한10유도 1 µ g/mL로 치료. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 하거나 transfect 세포 Pimentel 외에 의해 설명 된 대로, 핵에서 형광 단백질을 표현 하기 위해 야생-타입 마우스에서 분리 가능 하다. 9.

Protocol

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 산 라파엘 레 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 1입니다. 마우스 hindlimb 근육의 해 부 압력가 마로 소독 하 여 핀셋과가 위 (직선 및 곡선)을 소독. 준비 하 고 실험을 시작 하기 전에 모든 미디어 (매체 차단, 소화 매체, 매체, 확산 및 매체 차별화) (0.22 μ m)을 필터링 ( 재료의 표참조). 35 mm 페…

Representative Results

자동으로 myoblast 차별화 라이브 영상에서 중 핵 움직임을 따라, 핵 우선적으로 표시 되어야 합니다 놓여있는지. Intercalating DNA 분자를 사용 하는 가능한 이러한 분자 확산과 기본 myoblasts13의 방해 때문에 중요 하다. 예를 들어, 확산 및 감 별 법 또는 Hoechst (그림 1) 없이 교양 기본 myoblasts에서 분석 되었습니다 했습니다. 확산 (<strong clas…

Discussion

근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 확산 그리고 감 별 법2,3,를 받아야 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성 되는 4. Myoblast 차별화를 평가 하기 위해 일반적인 절차 myoblasts 매체를 차별화 하 고 MyHC, 차별화, 마커 및의 얼룩에 얼룩이 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 다른 시…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 AFM-텔 레 톤 E.V. (#21545)에 의해 고 스타지오네 산 라파엘 레 (OSR) 씨 그랜트 S.Z. (ZAMBRA5X1000)에 의해 지원 되었다. 파스퇴르의 이미지 분석 허브에서 박사 장 이브 Tinevez 공개적으로 그의 “간단한 추적기” MATLAB 루틴을 공유에 대 한 인정 이다.

Materials

chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

References

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Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

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