Summary
العظم والعظام هي الانسجه الخاصة الضامة الكريات العظمية المشتقة من سلاله أحاديه الضامة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم. يصف هذا البروتوكول كيفيه عزل خلايا نخاع العظم بحيث يتم الحصول علي كميات كبيره من العظم العظمي مع الحد من مخاطر الحوادث الموجودة في الطرق التقليدية.
Abstract
العظم والعظام هي الخلايا الكبيرة ، نوى ، والعظم-ارتشاف السلالة الاحاديه الضامة التي تتشكل من خلال انصهار البويضات الاحاديه أو السلائف الضامة. ارتشاف العظم المفرط هو واحد من أهم أليات الخلوية التي تؤدي إلى امراض العظم ، بما في ذلك هشاشة العظام ، التهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي. تتمثل الوظيفة الفسيولوجية الرئيسية للعظام في امتصاص كل من مكون هيدروكسيباتيت المعدني والمصفوفة العضوية للعظام ، مما يولد مظهر الارتشاف المميز علي سطح العظام. هناك عدد قليل نسبيا من العظم العظمي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى في الجسم ، وخاصه في عظام الكبار. وقد ركزت الدراسات الاخيره علي كيفيه الحصول علي أكثر نضجا العظام في وقت اقل ، والتي كانت دائما مشكله. وقد تطورت العديد من التحسينات في تقنيات العزلة والثقافة في المختبرات من أجل الحصول علي أكثر نضجا العظام. هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الاجراء التقليدي ، وذلك باستخدام جهاز خاص وبسيط. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما من نخاع العظم الفئران ، والتي يتم تحديدها بواسطة الأساليب الكلاسيكية.
Introduction
التوازن العظام هو عمليه الفسيولوجية المعقدة التي ينظمها العظم resorbing العظام والعظام تشكيل عظم1. التوازن بين النشاط العظمي والعظام التي توسطت من خلال عظم والعظم ، علي التوالي ، هو ضروري للغاية للحفاظ علي صحة العظام والتوازن ، وذلك لان الاضطرابات في التوازن العظام قد يؤدي إلى امراض العظام ، مثل كما غير طبيعي نمو العظام أو فقدان كثافة العظام. كخلايا ارتشاف العظام الفريدة من نوعها ، فان العظم الكبدي مهم في الامراض المتعلقة بتدمير العظام غير الطبيعي ، بما في ذلك ترقق العظم ، والتهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي2،3.
يتم تقسيم تطور الثقافة العظمية بشكل رئيسي إلى مرحلتين. وقد شكلت الأساليب التي وضعتها Boyde et al.4 والدوائر وآخرون5 المرحلة الاولي في الثمانينات من القرن الماضي. انها حصلت علي وفره نسبيا العظم من عظام المواليد الجدد ، والتي هي فتره أعاده عرض السريع. يتم الإفراج عن العظم عن طريق تفتيت وتحريك العظام في وسط خاص. ومع ذلك ، فان الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب منخفضه الكمية والنقاء. وكانت المرحلة الثانية تطوير الثقافات طويلة المدى للتشكيل العظمي ، وذلك باستخدام خلايا السلالة المكونة للدم المستمدة من نخاع العظم6. السايتوكينات ، مثل 1α ، 25-ديهيدروكسيفيتامين D3 ، بروستاستارين E2 (pge-2) ، وهرمون الغدة الدرقية (pge) ، والتي تضاف إلى الوسط الثقافي ، والعمل من خلال نظام الخلايا العظمة/اللحمية لتحفيز تشكيل العظم7،8 . ومع ذلك ، فان نقاء وكميه العظام التي يتم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة لا يمكن ان تلبي احتياجات البحوث البيولوجيا الجزيئية الحديثة. ثم ، اكتشاف عامل التحفيز مستعمره الضامة (م-السائل الدماغي الشوكي) والمنشط مستقبلات لعامل النووية-κb يجند (rankl) جعل العظمية أسهل9،10،11، وطريقه استخدام M-السائل الدماغي الشوكي RANKL لتحفيز مباشره تشكيل العظم يستخدم علي نطاق واسع في جميع انحاء العالم. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض التفاصيل في المنهجية التي تحتاج إلى تحسين.
وفي الوقت الحالي ، فان طريقه الاستزراع العظمي الأكثر استخداما ، كما وصفتها مارينو وآخرون12 و Pei et al.13، غالبا ما تتطلب أزاله الانسجه المحيطة حول العظم وتستخدم ابره معقمه لمسح تجويف النخاع مع وسائل الاعلام المكتملة. هناك بعض العيوب لهذه العملية ، بما في ذلك حقيقة ان (1) أزاله الانسجه المحيطة حول العظام يتطلب الكثير من الوقت والتقنية الجراحية كبيره ، (2) العظام هشه ويمكن ان يؤدي إلى تدفق نخاع العظم ، (3) قد يكون تجويف نخاع العظم صغيره جدا لدافق ، و (4) هناك خطر أصابه ابره العصا. لتجنب هذه المشاكل ، ونحن الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي علي العظام لنخاع العظم بدلا من ابره-تنظيف نخاع العظم. هنا ، ونحن نقدم طريقه مستقره وأمنه التي تعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الإجراءات التقليدية. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع الطرق التي تنطوي علي الحيوانية الموصوفة هنا من قبل المؤسسة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من جامعه نانجينغ للطب الصيني.
1. الاعداد
- اعداد عده طوليا قطع 1 مل نصائح ماصه (1 سم) والعديد من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 mL. وضع نصائح ماصه وأنابيب الطرد المركزي في 103 كيلو باسكال و 121 درجه مئوية لمده 20 دقيقه والتاكد من انها عقيمه.
- اعداد علبه من الثلج والعديد من الاطباق المعقمة للحفاظ علي الانسجه المعزولة اثناء اجراء العزل.
2. اعداد الثقافة المتوسطة
- اعداد الثقافة الكاملة المتوسطة. استخدام الحد الأدنى من الفا المتوسطة الاساسيه (α-ميم) الذي يحتوي علي الحل النهائي من 1 ٪ من البنسلين/ستربتوميسين و 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية.
- تصفيه الوسائط من الخطوة 2.1 باستخدام فلتر 0.22 μm.
- اعداد المتوسط التعريفي نخاع العظم. ل 50 mL من الحل ، أضافه 125 μL من M-السائل الدماغي الشوكي في تركيز 10,000 ng/mL (جدول المواد) إلى 49.875 مل من متوسط ثقافة كامله (من الخطوة 2.2) لجعل الحل النهائي من 25 نانوغرام/مل M-السائل الدماغي الشوكي.
- اعداد المتوسطة الحث العظمي. ل 50 mL من الحل ، أضافه 500 μL من RANKL في تركيز 10,000 ng/mL (جدول المواد) إلى 49.5 مل من المتوسطة التعريفي نخاع العظم (من الخطوة 2.3) لجعل الحل النهائي من 25 نانوغرام/مل M-السائل الدماغي الشوكي و 100 Ng/ML rankl.
3. عزل الخلايا المشتقة من نخاع العظم
-
القتل الرحيم
- موت ببطء أربعه الفئران Sprague Dawley من قبل CO2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم ، وتزج بهم في 75 ٪ الايثانول لمده 1 دقيقه.
ملاحظه: التاكد من ان الماشية من نفس الجنس ومن عمر مماثل. ينصح الحيوانية التي تتراوح أعمارهم بين 2 إلى 3 أسابيع. يتم اعداد اثنين من الفئران لطريقه الطرد المركزي ، في حين ان الاثنين الآخرين للأسلوب التقليدي.
- موت ببطء أربعه الفئران Sprague Dawley من قبل CO2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم ، وتزج بهم في 75 ٪ الايثانول لمده 1 دقيقه.
-
الطريقة التقليدية
- وضع الكائنات علي لوحه مطهر في موقف ضعيف. اجراء شق صغير (حوالي 1 سم) في عظم الفخذ القريب لقشر الجلد ، وذلك باستخدام مقص معقم.
- تشريح الإناث والانحياز. قطع أجزاء الاتصال الثنائية حول مفاصل الورك والركبة والكاحل لعزل الانحياز والانوثه بعناية وبرفق. قطع جزء من الانسجه حول العظم. تكون شامله. لا تكسر الانحياز والانوثه خلال العملية برمتها.
- ضع العظام المنظفة في طبق مع 5 مل من الوسط الثقافي الكامل. اقطع العظم الطويل بمقص معقم واستخدم ابره حقنه 1 مل لمسح تجويف النخاع بعناية مع 10 مل من الوسائط الكاملة حتى يتحول تجويف النخاع إلى اللون الأبيض.
- نقل تعليق الخلية من الخطوة 3-2-3 إلى أنبوب 50 mL ، ومن ثم ، تصفيته مع مصفاه 70 μm لأزاله الانسجه المتبقية.
- أضافه 5 مل من خليه الدم الحمراء تحلل العازلة (جدول المواد) إلى تعليق الخلية. احتضان الخلايا لمده 8 دقائق علي الجليد. ثم ، الطرد المركزي الخلايا في 250 x g ل 5 دقيقه لتسفر عن بيليه الخلية.
- يستنشق قباله المتوسطة وأعاده تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام الكاملة. عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية واحسب الوقت المستغرق علي الخطوات من هذا القسم (المقطع 3.2).
-
طريقه محسنه
- وضع الكائنات علي لوحه مطهر في موقف ضعيف. اجراء شق صغير (حوالي 1 سم) في عظم الفخذ القريب مع مقص معقم لقشر الجلد.
- تشريح الإناث والانحياز. قطع بشكل صحيح من جزء من الانسجه حول العظام (لا حاجه لأزاله تماما). لا تكسر الانحياز والانوثه خلال العملية برمتها.
- شطف التحيز و فخذ مع 12 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني) وقطع لهم في النصف. ضع الانحياز الصغير والأنثوي في طرف ماصه 1 مل (من الخطوة 1.1) ، والذي يتم وضعه بعد ذلك في أنبوب الطرد المركزي وهو طرد 3x في 1,000 x g ل 45 s عند 4 درجه مئوية.
- بعد الطرد ، قم بازاله طرف الماصة الذي يحتوي علي العظم ، واترك نخاع العظم في الأنبوب. أضافه 200 μL من وسائل الاعلام الكاملة في أنبوب الطرد المركزي وتكرار الأنابيب لتفكك نخاع تماما.
- نقل تعليق الخلية من الخطوة 3.3.4 إلى أنبوب 50 mL ، ومن ثم ، تصفيته مع مصفاه 70 μm لأزاله الانسجه المتبقية.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات ، واحسب الوقت المستغرق علي الخطوات من هذا القسم (المقطع 3.3).
4. تنقيه بواسطة التدرج الكثافة طرد
- ضبط تعليق الخلية من الخطوة 3.2.6 أو 3.3.5 الخطوة إلى 2 مل مع α-ميم.
- اعداد واحد معقم أنبوب الطرد المركزي المطهر وأضافه 8 مل من حل فصل الخلية (جدول المواد) إلى الأنبوب.
- أضافه تعليق الخلية من الخطوة 4.1 إلى حل فصل الخلية. التمسك غيض ماصه إلى السطح الداخلي للأنبوب والحفاظ علي 45 درجه إلى السطح الداخلي. بعد أضافه التعليق ، سيظهر حد واضح بين طبقه الخلايا وحل الفصل.
ملاحظه: تتطلب العملية عناية فائقه ويجب القيام بها ببطء. - الطرد المركزي الحل الطبقات في جهاز الطرد المركزي الأفقي في 500 x g لمده 30 دقيقه. بعد طرد ، يستنشق قباله الطبقة الثانية غائم ، والذي يحتوي علي الخلايا المستهدفة ، من اعلي إلى أسفل.
ملاحظه: إلغاء تسارع وتباطؤ الطرد المركزي قبل طرد. هناك سته طبقات بعد طرد; الطبقة الاولي هي طبقه مخفف ، والطبقة الثانية هي طبقه الخلايا الاحاديه ، والطبقة الثالثة هي طبقه من كريات وحيده النوى ، والطبقة الرابعة هو الفصل السائل الشفاف طبقه واحده ، والخامس هو طبقه الخلايا الحبيبية ، والطبقة السادسة هي الخلية الحمراء طبقه. - انقل الخلايا المستهدفة إلى أنبوب جديد. أضافه 5 مل من تلفزيوني لغسل الخلايا 3x. بعد كل غسل ، الطرد المركزي الخلايا المستهدفة في 250 x g لمده 5 دقائق لإنتاج بيليه الخلية.
- أعاده التعليق علي بيليه الخلية مع المتوسطة التعريفي نخاع العظم وحساب الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية. أضافه 5-8 مل من المتوسط التعريفي نخاع العظم من الخطوة 2.3 للحصول علي حل الخلية النهائية من 300,000 خلايا/مل. أضافه 1 مل لكل بئر من لوحه 24 بئر.
5-الثقافة والتمايز
- بعد احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة ، يستنشق بلطف قباله المتوسطة وأضافه 1 مل من المتوسطة الحث العظمي لكل بئر. اجتت لوحه برفق ووضعها في حاضنه في 37 درجه مئوية.
- تغيير المتوسطة الحث العظمي كل 48 h. اثناء القيام بذلك ، تغيير 0.8 mL من المتوسطة في البئر ويهيج لوحه بلطف.
ملاحظه: وينبغي ملاحظه العظم الكبير ، والنوى ، والعظام في البئر تحت المجهر المقلوب ، عاده حول الأيام من 4 إلى 6.
6. تارتراتي--مقاومه الفوسفاتيز تلطيخ حمض
ملاحظه: مولتينوكليت العظم العظمي سيكون حاضرا بعد 4 – 6 أيام إذا كان الاستقراء (القسم 5) ناجحا.
- اعداد حل مثبت من خلال الجمع بين 4 مل من 37 ٪ الفورمالديهايد ، 32.5 مل من الأسيتون ، و 12.5 ml من محلول سيترات. تخزين الحل المثبت في 4 درجه مئوية.
- اعداد محلول الفوسفاتيز حمض تارتراتي مقاومه (فخ) وصمه عار (جدول المواد) عن طريق أضافه 50 μl من نيتريت الصوديوم ، 50 μl من العقيق السريع GBC الحل الأساسي ، 50 μl من نفثول AS-BI الفوسفات حل ، 200 μl من محلول خلات ، و 100 μl من محلول طرطرات في 4.55 مل من الماء منزوع الأيونات التي يتم تسخينها إلى 37 درجه مئوية. ثم ، مزيج بلطف عن طريق عكس لمده 1 دقيقه ، والسماح لها الوقوف لمده 2 دقيقه.
- بعد التحريض الناجح للعظام ، يستنشق قباله المتوسطة ، ويغسل بلطف الآبار 3x مع تلفزيوني.
- جلب الحل المثبت إلى درجه حرارة الغرفة (RT). أضف 2 مل من المحلول المثبت إلى الآبار لمده 30 ثانيه ، ولا تسمح للخلايا بالجفاف.
- يستنشق المحلول المثبت ، يغسل برفق 3x مع الماء منزوع الأيونات التي يتم تسخينها إلى 37 درجه مئوية ، ومن ثم ، يستنشق الماء.
- أضافه 2 مل من فخ وصمه عار الحل ل 1 ح في 37 درجه مئوية والحفاظ علي العينة في الظلام.
- بعد 1 ساعة ، يستنشق وصمه عار ، ويغسل برفق العينة مع الماء منزوع الأيونات التي يتم تسخينها إلى 37 درجه مئوية ، ومن ثم ، يستنشق الماء.
- المضادة للبقع الخلايا لمده دقيقه واحده في محلول الهيلوكسيلين. بعد تلطيخ ، يستنشق محلول الهيلوكسيلين ويغسل بلطف الخلايا 3x مع الماء منزوع الأيونات.
- ستظهر الصورة العظمية للصورة باستخدام المجهر الضوئي الساطع ، سيظهر اللون الأرجواني لخلايا "فخ +" مع ثلاثه أو أكثر من النوى.
7. فحص العظم ارتشاف باستخدام تولودين الأزرق تلطيخ
-
المعالجة المسبقة للشرائح العظام
- قطع قشره عظم الفخذ البقري الطازجة إلى شرائح سميكه 2 سم علي طول المحور الطولي من قبل منشار ميكروالكتريك. ثم ، وقطع وطحن شرائح مع المطاحن الانسجه الصلبة في 80 μm.
- اغسل الشرائح في كوب مع الماء منزوع الأيونات والموجات فوق الصوتية 100 هرتز لمده 1 ساعة ، وكرر 3x.
- تزج شرائح في 75 ٪ الكحول لمده 2 ساعة. ثم ، يستنشق قباله الكحول وفضح كل جانب من الشرائح إلى الضوء فوق البنفسجي ل 1 ح علي منصة نظيفه.
- قبل زراعه الخلايا ، تزج الشرائح في وسط الثقافة لمده لا تقل عن 2 ساعة.
-
تولودين الأزرق تلطيخ
- ضعي شرائح العظم المعالجة مسبقا في طبق 24 بئر. ازرع الخلايا كما هو مذكور في الخطوة 4.6 وحمل الخلايا كما هو مذكور في القسم 5.
- بعد ظهور العظم (بعد 4 – 6 أيام) ، اغسل الشرائح بمقدار 1 مل من هيدروكسيد الأمونيوم 0.25 متر ، وقم بإعطاءها 3 اضعاف لمده 5 دقائق لكل منها لأزاله الخلايا الحية للسماح بتحليل حفر الارتشاف علي شرائح العظم. ثم ، أزاله هيدروكسيد الأمونيوم ووصمه عار الشرائح مع 1 مل من 1 ٪ (wt/vol) الحل الأزرق تولودين لكل شريحة لمده 2 دقيقه.
- غسل الشرائح مع تلفزيوني. حدد بشكل عشوائي خمس طرق عرض وقم باجراء تحليل نصف كمي لمنطقه الارتشاف باستخدام برنامج تحليل الصور.
8. مسح المجهر الكتروني
- بادئه شرائح العظام من الخطوة 7.2.1 مع 1 مل من غلوتارالدهيد 2.5 ٪ لكل شريحة ل 2 ح في RT ، ومن ثم ، والشرائح 3x لمده 3 دقائق لكل منهما مع هيدروكسيد الأمونيوم 1 م لأزاله الخلايا وأزاله هيدروكسيد الأمونيوم.
- غسل شرائح العظام 3x لمده 12 دقيقه لكل منها مع تلفزيوني.
- إصلاح شرائح العظام مع 1 ٪ حمض اوسميتش ل 2 ح في RT.
- أداء الجفاف الانحدار الايثانول ، مع 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 95 ٪ الايثانول ، لمده 15 دقيقه لكل التدرج ، ومن ثم ، استبدال الايثانول مع خلات ايزوميل لمده 15 دقيقه.
- معطف الشرائح مع البلاديوم الذهب ، ومن ثم ، تحليل عن طريق مسح المجهر الكترون.
9. تلطيخ المناعي من مستقبلات كالسيتونين
ملاحظه: مولتينوكليت العظم العظمي سيكون حاضرا بعد 4 – 6 أيام إذا كان الاستقراء ناجحا (القسم 5).
- يستنشق قباله المتوسطة ويغسل بلطف 3x جيدا مع تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا لمده 10 دقيقه مع 4 ٪ بارافورمالدهيد ، الذي هو precooled إلى 4 درجه مئوية.
- أضافه 1 مل من تلفزيوني مع 0.3 ٪ السطحي غير الايونيه في بئر لمده 30 دقيقه علي الجليد. ثم ، يستنشق قباله التلفزيوني مع 0.3 ٪ السطحي غير الايونيه وأضافه 1 مل من تلفزيوني مع 5 ٪ لكل بئر لمده 30 دقيقه علي الجليد.
- يستنشق من ال [ببس] وحضنت الاغشيه مع [انتي-كسيتونين] مستقبل ([انتي-بالنقر]) في 1:100 تخفيف في [ببس] في 4 [ك] بين عشيه وضحيها.
- يستنشق قباله الحل ، واحتضان الاغشيه مع اليكسا-488-مترافق الأضداد المضادة لأرنب مفتش في 1:1000 التخفيف في النظام التلفزيوني العام لمده 1 ساعة في RT.
- يستنشق قباله الحل ويغسل بلطف الخلايا 3x مع تلفزيوني. المضادة للبقع النوى مع Hoechst 33342 وصمه عار لمده 3 دقائق في RT.
- يستنشق قباله الحل ، ويغسل بلطف الخلايا 3x مع تلفزيوني. لاحظ كثافة النقر بالظهور بواسطة المجهر الفلوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الغرض من البروتوكول لعزل وتنقيه اعداد كبيره من السلائف العظمية الاخيره مريح وتحفز العظم بنجاح. من خلال المكمل مع M-السائل الدماغي الشوكي و RANKL, وشهدت العظام العملاقة في الأيام 5 – 6. تم تحديد تشكيل العظم العظمي بنجاح عن طريق تلطيخ فخ (الشكل 1A). واعتبرت الخلايا الكبيرة والأرجواني والخلايا الايجابيه فخ مع نوى متعددة (عاده ≥ ثلاثه نوى). من خلال هذه الطريقة ، كان من المعتاد الحصول علي 800 العظام ، والتي تحتوي علي ما يصل إلى 30 نوى في العظم العظمي ، في لوحه 24 بئر (الشكل 1B). بالمقارنة مع الطريقة التقليدية ، وتحسين طريقه حفظ ما يقرب من 20 دقيقه في التقدم العزلة كله (الشكل 1C).
استخدام شرائح العظام لتقييم نشاط ارتشاف العظام هو الطريقة النموذجية في المختبر. ومن خلال تلطيخ اللون الأزرق تولودين ، تم تصور منطقه الارتشاف علي انها خضراء فاتحه (الشكل 2 ا) وتم حسابها. وقد لوحظ بوضوح هيكل وخصائص حفر العظام عن طريق مسح المجهر الكتروني (الشكل 2 ب).
ان نسبه النقر إلى الظهور ، وهي واحده من علامات الخلايا الخاصة بالعظم العظمي ، أمر بالغ الاهميه لتحديد الترسبات العظمية ودراسة تشكيل العظم الكبدي. التعبير الإيجابي للنقر يحدد بوضوح العظم ويميزها عن النواة الضامة. تم اكتشاف النقر بالظهور بواسطة اختبارات المناعي. وأشار اللون الأخضر إلى التعبير عن نسبه النقر إلى الظهور وأشار الأزرق إلى النوى (الشكل 3).
الشكل 1: الخلايا المستخرجة من النخاع العظمي. (ا) صوره تمثيليه لتلطيخ فخ. الرسم البياني المجهري في التكبير 10x يوضح العملاقة متعددة, نوى اوستيوتوكيدوم التي هي فخ ايجابيه ولوحظت في التكبير 20x. يظهر مثال لنواه داخل نوى العظم الأخير بواسطة السهم الأحمر. (ب) الرسم البياني المجهري الميداني في التكبير 10x يثبت ان عددا كبيرا من العظم الموجبة فخ الايجابيه كانت موجودة. مثال لنوى العظمية الكبيرة التي تم تحديدها بواسطة الخط الأحمر المتقطع. (ج) مقارنه الوقت المستغرق في طريقتي العزل. تم تنفيذ جميع العمليات من قبل نفس المجموعة من المجربين. تمثل البيانات الوسائل ± الانحراف المعياري. * P < 0.05 ، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اختبارات ارتشاف العظم بواسطة شرائح العظم. (ا) الرسم البياني المجهري في الحقل الساطع عند التكبير بدقه 4x يوضح منطقه ارتشاف العظم ، وهو ملون باللون الأخضر بواسطة البقعة الزرقاء تولودين ، وهو مستدير الشكل ، أو بيضاوي ، أو سجق. يظهر مثال لمنطقه ارتشاف العظم بالسهم الأحمر. (ب) الحفر التي لوحظت مع مسح المجهر الكتروني بالتكبير 500x. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف تعبير نسبه النقر إلى الظهور في العظم يدوم باستخدام تلطيخ المناعي. وتظهر اللوحة اشاره واضحة بالنقر إلى الظهور حول الخلايا. (ا) الخلايا الايجابيه للنقر. (ب) النوى. (ج) مدمجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة علي الحصول علي ودراسة العظم الكبدي في المختبر هو مهارة حاسمه وأساسيه لأي باحث يرغب في دراسة استقلاب العظام ، والتي قد تساعد علي فهم أليات الامراض التي تمتص العظام وتطوير العوامل العلاجية الجديدة. وقد وصفت هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استنادا إلى الأساليب السابقة.
باستخدام نصائح ماصه وأنابيب الطرد المركزي للحصول علي نخاع العظم ، فانه يقلل إلى حد كبير من وقت العملية من الحصول علي نخاع العظم وعبء العمل من موظفي المختبرات مقارنه بالطرق التقليدية. وفي غضون ذلك ، تتجنب الطريقة خطر فقدان نخاع العظم أو أصابه العصا بالابره. في دراسة سابقه ، تم طلاء الخلايا المستخرجة من نخاع العظم مباشره بعد العزلة12،13. استخدمت طرد تدرج الكثافة لتحديد الخلايا الاحاديه لنخاع العظم وفقا للاختلافات في معاملات التسوية. في العملية من كثافة تدرج طرد, الاضافه من الخلية فصل أوساط ينبغي كنت أنجزت برفق وبعناية علي طول الجدار, [أين وردر تو] جعلت الحدود واضحة. ومع ذلك ، فان هذه التقنية محدوده بوظيفة جهاز الطرد المركزي وما إذا كان يتم اعدادها مع بارامترات التسارع والتباطؤ. كثافة البذر هو الشرط الرئيسي لزراعه العظم. عده مرات ، فشل البروتوكول بسبب كثافة البذر غير صحيح عند طلاء الخلايا. لذلك, تقريبا 300,000 خلايا لكل [24-ول] لوحه جيدا أوصيت في هذا بروتوكول. وهذا البروتوكول مناسب أيضا للحصول علي أنواع مختلفه من الخلايا المشتقة من نخاع العظم في الجرذان أو الكائنات الأخرى (مثل الفئران والأرانب والدجاج).
الطريقة الأكثر كلاسيكية لتقييم نشاط العظم هو فحص الحفرة الارتشاف. ويشيع استخدام قشره العظم البقري لفحص الحفرة الارتشاف لان مصادرها متاحه علي نطاق واسع. مع مساعده من نظام التقطيع الحديثة ، يمكننا الحصول علي شرائح العظام رقيقه بسهوله أكبر. ولفحص الحفرة الارتشاف ثلاثه عوامل. لتوليد بنجاح حفره ارتشاف في الشرائح ، يجب ان تعامل الشرائح بدقه كما هو موضح لdefatting في البروتوكول. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تنشيط الفئران العظام لتشكيل حفر ارتشاف في بيئة حمضيه قليلا ، وسوف وظيفة ارتشاف أساسا "إغلاق" عندما ترتفع درجه الحموضة فوق 7.214،15. التالي ، فمن الجدير بالذكر ان فتح باب الحاضنة في كثير من الأحيان خلال التقدم في التجارب قد يؤدي إلى اضطرابات من الأس الهيدروجيني والقيم الشركة2 ، حتى التاثير علي وظيفة ارتشاف العظم16. وأخيرا ، يجب ان تبقي شرائح العظام في الجزء السفلي من الآبار وينبغي عدم نقل أو تطفو حتى عند تغيير المتوسطة ، من أجل تجنب تهيج.
النقر إلى الظهور هو عضو واحد من الفئة الثانية من الاسره الفرعية لمستقبلات G-البروتين-الغشائية التي تحتوي علي 7-الغشاء الذي يحتوي أيضا علي هرمون الغدة الدرقية ومستقبلات سيكريتين17. الاضافه إلى تلطيخ البقع وفحص الحفرة الارتشاف ، يتم تحديد العظم العظمي بواسطة المورفولوجية والوظيفة ، ويحدد النقر الإيجابي للعظم الكبدي في علم المناعة. الآن ، يمكننا أيضا استخدام تلطيخ الفلورسنت من الحلقة الاكتين وقياس الوصلات المتقاطعة بيريدينولين في ماده طافي لتحديد العظم.
علي الرغم من ان مختلف الباحثين لديهم العديد من الأسر مع التقنيات التجريبية والكمية الاجماليه للخلايا في نخاع العظم مؤكده ، حصلنا علي خلايا نخاع العظم في وقت أقصر ، نسبيا ، وفي النهاية ، والحصول علي كميات كبيره من كامل العظام متفاوتة من نخاع العظم الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81473692) إلى يونغ ما. ويشكر المؤلفون جميع موظفي مركز البحوث الطبية في الكلية الاولي للطب السريري في جامعه نانجينغ للطب الصيني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M.
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R.
- Quinn, J. M., et al.
