Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/58895
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 3, 1,2,4
1Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction, Institute of Traumatology & Orthopedics, Nanjing University of Chinese Medicine, 2TCM Nursing Intervention Laboratory of Chronic Disease Key Laboratory, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Department of Traumatology and Orthopedics, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine

Summary

אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.

Abstract

האוסטאופנות הינן גדולות, בנות בנות, ותאי-ספיגת עצמות של שושלת היוחסין המקרופאג מונוציט, הנוצרות על ידי היתוך של מונוציטים או מקרופאג פראוסמנים. ספיגת עצם מוגזמת הוא אחד המנגנונים הסלולריים המשמעותיים ביותר המובילים למחלות מחלות נגד חרדה, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו אוסטאופוליזיס periprosthetic. הפונקציה הפיסיולוגית העיקרית של האוסטאופתית היא לקלוט גם את רכיב המינרלים של ההידרוקסיטיט ואת המטריצה האורגנית של העצם, וליצור את המראה הספיגת האופייני על פני העצמות. יש מעט מאוד אוסטאוקיים בהשוואה לתאים אחרים בגוף, במיוחד בעצמות למבוגרים. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו כיצד להשיג osteoclasts וגרים יותר בזמן פחות, אשר תמיד היה בעיה. מספר שיפורים בטכניקות הבידוד והתרבות פותחו במעבדות על מנת להשיג האוסטאופי בוגרים יותר. כאן, אנו מציגים שיטה המבודדת מח עצם בפחות זמן, עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי, באמצעות מכשיר מיוחד ופשוט. עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של osteoclasts בדיל מלא של מח עצם החולדה, אשר מזוהים על ידי שיטות קלאסיות.

Introduction

הומאוסטזיס העצם הוא תהליך פיזיולוגי מורכב מוסדר על ידי עצם-ספיגת בינג העצמות האוסטאופתית והעצם יוצר אוסטאופתית1. איזון בין פעילות osteoblastic האוסטטית בתיווך באמצעות אוסטאופיות ואוסטאופתנמשך, בהתאמה, הוא חיוני מאוד לשמירה על בריאות העצם הומאוסטזיס, כי רטבאליות הומאוסטזיס העצם עלול להוביל למחלות עצם, כגון כמו צמיחה עצם נורמלי או אובדן של צפיפות העצם. כמו תאים לספיגת עצם ייחודי, האוסטאופתיים חשובים מחלות הקשורות להשמדה העצם נורמלי, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו perioly, ו הפריתותבת2,3.

התפתחות התרבות האוסטאופתיים מחולקת בעיקר לשני שלבים. השיטות שנקבעו על ידי Boyde et al.4 וצ'יימברס ואח '5 הלחין את השלב הראשון בשנות השמונים. הם השיגו שופע אוסטאופי עשיר יחסית מעצמותיו של בעלי חיים היילוד, שהיא תקופת השיפוצים המהירה. האוסטאופתות משתחררים על ידי מקטעים ומערבב את העצמות במדיום מיוחד. עם זאת, התאים שהושגו בשיטה זו נמוכים בכמות ובטוהר. השלב השני היה פיתוח של תרבויות ארוכת טווח של היווצרות אוסטאוקלסט, באמצעות תאים השושלת המטתית נגזר מח העצם6. ציטוקינים, כגון 1α, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D3, proגלנדין E2 (pge-2), ו הורמון יותרת התריס (pge), אשר מתווספים לתוך המדיום תרבות, לפעול באמצעות מערכת של התאים האוסטאופתיים/סטרומה כדי לעורר את היווצרות אוסטאוקלסט7,8 . עם זאת, הטוהר וכמות האוסטאופה המתקבלים על ידי שיטה זו אינם יכולים לענות על הצרכים של מחקר הביולוגיה המולקולרית המודרנית. לאחר מכן, התגלית של גורם מעורר מקרופאג המושבה (M-שדרתי) ו קולטן activator עבור גורם גרעיני-κB ליגנד (rankl) להפוך osteoclastogenesis קל יותר9,10,11, ואת השיטה של שימוש בשיטת M-שדרתי ו Rankl לעירור ישיר היווצרות אוסטאוקלסט נמצא בשימוש נרחב ברחבי העולם. עם זאת, יש עדיין כמה פרטים במתודולוגיה כי יש צורך לשפר.

כיום, שיטת התרבות הנפוצה ביותר הנפוץ ביותר, כפי שמתואר על ידי מרינו ואח '12 ו-פיי et al.13, לעתים קרובות דורש הסרת הרקמה הסובבת סביב העצם ומשתמשת במחט מחוטאת כדי לשטוף את חלל מח המוח עם מדיה שהושלמה. ישנם כמה החסרונות לתהליך זה, כולל העובדה (1) הסרת הרקמה המקיפה סביב העצם דורש זמן רב וטכניקה כירורגית גדולה, (2) העצמות הם שבירים יכול להוביל מח עצם תזרים, (3) חלל מח העצם עשוי להיות זעיר מדי כדי סומק, ו (4) יש סיכון של פציעה מקל מחט. כדי למנוע בעיות אלה, אנו מצנטריפוגה את הצינורות המכילים את העצמות של מח עצם במקום מחט-לרוקן את מח העצם. כאן, אנו מציגים שיטה יציבה ובטוחה אשר מבודד מח עצם בפחות זמן עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי. יחד עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של אוסטאוקלטורים מובחנים מלאים בתוך מבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות הכרוכות בבעלי החיים המתוארים כאן מאושרות על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת נאנג'ינג של הרפואה הסינית.

1. ההתקנה

  1. הכינו מספר longitudinally גזור 1 מ ל הצינורות (1 ס מ) ו מספר שפופרות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. שים את עצות הפיפטה ואת צינורות המיקרוצנטריפוגה ב-103 kPa ו-121 ° c עבור 20 דקות וודא שהם עקרים.
  2. הכינו קופסת קרח ומספר מנות סטריליות כדי לשמר את הרקמות הבודדות במהלך תהליך הבידוד.

2. הכנת מדיום לתרבות

  1. הכן את מדיום התרבות השלמה. השתמש בינוני חיוני מינימלי אלפא (α-הגברת) המכיל פתרון הסופי של 1% של פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% סרום בפרה העובר (FBS).
  2. סנן את המדיה משלב 2.1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
  3. הכינו את מח העצם אינדוקציה מדיום. עבור 50 mL של הפתרון, להוסיף 125 μL של מ. א. שדרתי בריכוז של 10,000 ng/mL (טבלת חומרים) כדי 49.875 mL של בינונית תרבותית מלאה (משלב 2.2) כדי לבצע פתרון סופי של 25 Ng/mL M-שדרתי.
  4. הכן את המדיום האינדוקציה האוסטאוקלסט. עבור 50 mL של הפתרון, להוסיף 500 μL של RANKL בריכוז של 10,000 ng/mL (הטבלה של חומרים) כדי 49.5 mL של בינונית האינדוקציה מח עצם (משלב 2.3) כדי לבצע פתרון סופי של 25 Ng/ml M-שדרתי ו-100 Ng/ML rankl.

3. בידוד תאים שמקורם בעצם מבמח

  1. מתת חסד
    1. המתת החסד ארבעה חולדות הג הג ידי CO2 שאיפת ואחריו פריקה צוואר הרחם, ולטבול אותם ב 75% אתנול עבור 1 דקות.
      הערה: ודא שבעלי חיים הם מאותו מין ומגיל דומה. מומלץ לחיות מגיל 2 עד 3 שבועות. שני עכברושים מוכנים לשיטה הצנטריפוגלי, ואילו השניים האחרים הם בשביל השיטה המסורתית.
  2. שיטה מסורתית
    1. מניחים את החיות על לוח חיטוי במצב פרקדן. לעשות חתך קטן (כ 1 ס מ) על עצם הירך הקרוב לקלף את העור, באמצעות מספריים סטרילית.
    2. . לנתח את העצמות ולעשות שטיפה חותכים את חלקי החיבור הדו סביב מפרקי הירך, הברך והקרסול כדי לבודד את הפטיטיה והפטורים בזהירות ובעדינות. לחתוך חלק מרקמות סביב העצם; היות יסודית אין לשבור את הטיטיה ואת הפמורי במהלך כל התהליך.
    3. מניחים את העצמות הנקיות לתוך תבשיל עם 5 מ ל של מדיום התרבות השלמה. לחתוך את העצם הארוך עם מספריים סטרילי ולהשתמש 1 מזרק mL מחט לשטוף את חלל מח המוח בזהירות עם 10 מ ל של התקשורת המלאה עד החלל מח מוח הופך לבן.
    4. להעביר את ההשעיה התא משלב 3.2.3 לצינור 50 mL, ולאחר מכן, לסנן אותו עם מסננת 70 יקרומטר כדי להסיר את הרקמה הנותרת.
    5. הוסף 5 מ ל של מאגר הפירוק של תא דם אדום (טבלת חומרים) להשעיה של התא. מודב את התאים 8 דקות על הקרח. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 250 x g עבור 5 דקות כדי להניב את הגלולה התא.
    6. מוריד את המדיום ומשהה מחדש את התאים ב -10 מ ל של מדיה מלאה. ספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וחשב את הזמן המושקע בצעדים מסעיף זה (סעיף 3.2).
  3. שיטה משופרת
    1. מניחים את החיות על לוח חיטוי במצב פרקדן. הפוך חתך קטן (כ 1 ס מ) לעצם הירך הקרוב ביותר עם מספריים סטריליים לקלף את העור.
    2. . לנתח את העצמות ולעשות שטיפה כראוי לחתוך את החלק של הרקמות סביב העצם (אין צורך להסיר לחלוטין). אין לשבור את הטיטיה ואת הפמורי במהלך כל התהליך.
    3. שטפו את הטטיה והפמורי עם 12 מ ל של תמיסת מלח (PBS) וחותכים אותם לשניים. מניחים את tibias טיה והפמורי לתוך טיפ 1 מ ל הפיפטה (משלב 1.1), אשר לאחר מכן לשים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה והוא centrifuged 3x ב 1,000 x g עבור 45 s ב 4 ° c.
    4. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העצה הצינורות המכילים את העצם, ולהשאיר את מח העצם בתוך הצינור. הוסף 200 μL של מדיה מלאה לתוך הצינורית המיקרוצנטריפוגה וחזור על הפעולה כדי להתפרק ביסודיות את מח העצם.
    5. להעביר את ההשעיה התא משלב 3.3.4 לצינור 50 mL, ולאחר מכן, לסנן אותו עם מסננת 70 יקרומטר כדי להסיר את הרקמה הנותרת.
    6. ספור את התאים באמצעות הטציטומטר, וחשב את הזמן המושקע בצעדים מסעיף זה (סעיף 3.3).

4. טיהור מצנטריפוגה מעבר לדחיסות

  1. כוונן את השעיית התא משלב 3.2.6 או שלב 3.3.5 עד 2 מ ל עם α-גברתי.
  2. הכינו צינור צנטריפוגלי אחד סטרילי ומוסיפים 8 מ ל של פתרון הפרדת התאים (טבלת חומרים) לצינור.
  3. הוסף את השעיית התא משלב 4.1 לפתרון הפרדת התאים. יש לדבוק בעצת הפיפטה למשטח הפנימי של הצינור ולשמור על 45 ° לפני השטח הפנימי. לאחר הוספת ההשעיה, מגבלה ברורה תופיע בין שכבת התאים ופתרון ההפרדה.
    הערה: הפעולה דורשת טיפול מצוין וצריכה להתבצע באיטיות.
  4. צנטריפוגה את הפתרון שכבתית בצנטריפוגה אופקית ב 500 x g עבור 30 דקות. לאחר צנטריפוגה, מעונן עם שכבה שנייה מעוננים, המכילה את תאי היעד, מלמעלה למטה.
    הערה: בטלו את ההאצה והאטה של הצנטריפוגה לפני צנטריפוגה. יש שש שכבות לאחר צנטריפוגה; השכבה הראשונה היא השכבה הדילול, השכבה השנייה היא השכבה המונולוציטים, השכבה השלישית היא השכבה של תאים מונוליתיים, השכבה הרביעית היא הפרדה שקופה נוזלית שכבה אחת, החמישית היא שכבת התאים הגרעינית, והשכבה השישית היא התא האדום שכבה.
  5. העבר את תאי היעד לשפופרת חדשה. הוסף 5 מ ל של PBS לשטוף את התאים 3x. אחרי כל כביסה, צנטריפוגה את תאי היעד ב 250 x g עבור 5 דקות כדי להניב את הגלולה התא.
  6. השהה מחדש את הגלולה התא עם בינונית אינדוקציה מח עצם ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר. הוסף 5 – 8 מ ל של מח עצם אינדוקציה בינוני משלב 2.3 להשיג פתרון התא הסופי של 300,000 תאים/mL. הוסף 1 מ ל לכל טוב של צלחת 24.

5. תרבות ובידול

  1. לאחר הדגירה של התאים בשעה 37 ° צ' עבור 24 שעות, בעדינות להדוף את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של המדיום האינדוקציה אוסטאוקלסט לכל טוב. מתפרעים את הצלחת בעדינות ומכניסים אותו לאינקובטור ב-37 ° c.
  2. לשנות את בינונית האינדוקציה אוסטאוקלסט כל 48 h. בעודו עושה זאת, לשנות 0.8 mL של המדיום בבאר ומתפרעים את הצלחת בעדינות.
    הערה: יש לצפות בבאר שמתחת למיקרוסקופ הפוך, בדרך כלל בסביבות היום 4 – 6.

6. tartrate חומצה עמידים בפני השפעת פוספאטאז

הערה: לאחר 4 – 6 ימים, במידה והאינדוקציה (סעיף 5) מוצלחת.

  1. הכינו את התמיסה הקבע על ידי שילוב 4 מ ל של 37% פורמלדהיד, 32.5 מ ל של אצטון, ו-12.5 mL של תמיסה ציטראט. אחסן את התמיסה הקבע ב-4 ° c.
  2. להכין את החומצה העמידה tartrate (המלכודת) פתרון הכתם (טבלה של חומרים) על ידי הוספת 50 μl של נתרן nitrite, 50 μl של הפתרון הבסיסי מהיר של גארנט gbc, 50 μl של נפתלי כ-BI פוספט פתרון, 200 μl של פתרון אצטט, ו-100 μl של tartrate פתרון לתוך 4.55 mL של מים מוכי הוא קדם התחמם 37 ° c. ואז, לערבב בעדינות על ידי היפוך עבור 1 דקות, ולתת לו לעמוד 2 דקות.
  3. לאחר אינדוקציה מוצלחת של osteoclasts ומכה את המדיום, ולשטוף בעדינות את הבארות 3x עם PBS.
  4. הביאו את התמיסה הקבע לטמפרטורת החדר (RT). הוסף 2 מ ל של פתרון קבע לבארות עבור 30 s, ואל תאפשר לתאים להתייבש.
  5. מנושף את התמיסה הקבע, שוטפת בעדינות את התלת-ממד עם מים מפוהים הקדם עד 37 ° c ולאחר מכן, מטפי את המים.
  6. הוסף 2 מ ל של פתרון כתם השמנה עבור 1 h ב 37 ° צ' ולשמור את המדגם בחושך.
  7. אחרי 1 h, מטפי את הכתם, ולשטוף בעדינות את המדגם עם מים מפוהים כי הוא קדם עד 37 ° c, ולאחר מכן, ומכה את המים.
  8. מנגד את התאים במשך 1 דקות בתמיסה של המטאוקסילין. לאחר כתמים, מכתים את התמיסה המטאוקסילין בעדינות לשטוף את התאים 3x עם מים מפוהים.
  9. האוסטאופסט התמונה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד, והשמנה+ תאים עם שלושה גרעינים או יותר יופיע סגול.

7. שיטת ספיגת עצם באמצעות Toluidine כחול כתמים

  1. טיפול מקדים בפרוסות העצם
    1. חותכים את קליפת העצם הטרייה הירך לתוך 2 ס"מ פרוסות עבה לאורך ציר האורך על ידי מסור מיקרואלקטו. ואז, לגזור ולטחון את הפרוסות עם מטחנות רקמה קשה לתוך 80 μm.
    2. לשטוף את הפרוסות בגביע עם מים מאוהים ו-100 הרץ אולטרסאונד 1 h, וחזור על 3x.
    3. לטבול את הפרוסות לתוך 75% אלכוהול עבור 2 h. ואז, מרוקן את האלכוהול ולחשוף כל צד של פרוסות לאור אולטרה סגול עבור 1 h על פלטפורמה נקייה.
    4. לפני נטיעת התאים, לטבול את הפרוסות במדיום התרבות לפחות 2 h.
  2. מכתים כחול טולואין
    1. מניחים את פרוסות העצם שטופלו מראש לתוך צלחת 24. לשתול את התאים כפי שהוזכר בשלב 4.6 ולגרום לתאים כפי שהוזכר בסעיף 5.
    2. לאחר הופעתו של אוסטאוקלזום (אחרי 4 – 6 ימים), לשטוף את הפרוסות עם 1 מ ל של 0.25 M אמוניום הידרוקסיד, ו sonicate אותם 3x עבור 5 דקות כל אחד כדי להסיר את התאים החיים כדי לאפשר ניתוח של בורות ספיגת על פרוסות העצם. ואז, להסיר את הידרוקסיד אמוניום ולהכתים את הפרוסות עם 1 מ ל של 1% (wt/vol) פתרון כחול טולדין לכל פרוסה עבור 2 דקות.
    3. שטוף את הפרוסות עם ה-PBS. בחר באופן אקראי חמש תצוגות ובצע ניתוח כמותי למחצה של אזור הספיגת התוכנה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

8. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

  1. הוסף את פרוסות העצם משלב 7.2.1 באמצעות 1 מ ל של 2.5% גלוטאלדהיד לפרוסה עבור 2 h ב RT, ולאחר מכן, sonicate את הפרוסות 3x עבור 3 דקות כל אחד עם 1 הידרוקסיד אמוניום כדי להסיר את התאים ולהסיר את הידרוקסיד אמוניום.
  2. לשטוף את פרוסות העצם 3x עבור 12 דקות כל אחד עם PBS.
  3. תקן את פרוסות העצם עם 1% חומצה osmic עבור 2 h ב RT.
  4. ביצוע התייבשות אתנול מדרגה, עם 50%, 70%, 80%, 90%, ו 95% אתנול, עבור 15 דקות עבור כל מעבר צבע, ולאחר מכן, להחליף את אתנול עם אצטט isoamyl עבור 15 דקות.
  5. העילו את הפרוסות בעזרת פלאדיום זהב, ולאחר מכן מנתחים על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני.

9. כתמים אימונולואורנסאוציציציללקיקיטונין

הערה: לאחר 4 – 6 ימים, במידה והאינדוקציה מוצלחת (סעיף 5).

  1. מוריד את המדיום בעדינות לשטוף את הבאר 3x עם PBS.
  2. תקן את התאים עבור 10 דקות עם 4% פאראפורמלדהיד, אשר מקורר עד 4 ° c.
  3. הוסף 1 מ ל של PBS עם 0.3% nonionic החומרים בבאר עבור 30 דקות על הקרח. לאחר מכן, משלחים את ה-PBS עם 0.3% nonionic הסטנט ולהוסיף 1 mL של PBS עם 5% FBS לכל טוב עבור 30 דקות על הקרח.
  4. מנושף את ה-PBS ואת הקרומים עם קולטן נגד קלציטונין (anti-קליקים) בדילול 1:100 ב-PBS ב-4 ° c בלילה.
  5. מנושף את הפתרון, ומארג את הקרומים עם אלקסה-488-מצומדת נגד הארנבת נגד הארנב ב-1:1000 דילול ב-PBS עבור 1 h ב RT.
  6. מנושף את הפתרון בעדינות לשטוף את התאים 3x עם PBS. מנוגד את הגרעינים עם Hoechst 33342 כתם עבור 3 דקות ב RT.
  7. לשטוף את הפתרון, ובעדינות לרחוץ את התאים 3x עם PBS. שימו לב לעוצמת הקליקים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת הפרוטוקול הייתה לבודד ולטהר מספרים גדולים של מקדים אוסטאופהאחרונים בנוחות ולגרום לאוסטאופתך בהצלחה. על ידי להשלים עם M-שדרתי ו RANKL, האוסטאופה ענק נראו בימים 5 – 6. היווצרות osteoclasts זוהה בהצלחה על ידי כתמים מלכודת (איור 1A). תאים גדולים וסגולים נחשבו תאים מלכודת חיובית עם מספר רב של גרעינים (בדרך כלל ≥ שלושה גרעינים). באמצעות שיטה זו, זה היה אופייני להשיג 800 האוסטאופתים, המכיל כמה שיותר 30 גרעיני לכל אוסטאופאוקלסט, בצלחת 24-באר (איור 1B). בהשוואה לשיטה המסורתית, השיטה המשופרת נשמרה כ -20 דקות בהתקדמות הבידוד כולה (איור 1C).

שימוש בפרוסות עצם כדי להעריך את הפעילות של ספיגת עצם אופייני לשיטת החוץ הגופית. באמצעות כתמים כחולים טולדין, אזור הריאוזיה היה דמיינו כירוק בהיר (איור 2a) וחישב. המבנה והמאפיינים של בורות העצמות נצפו בבירור על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (איור 2B).

קליקים, אחד הסמנים התא המסוים הספציפי, הוא קריטי כדי לזהות osteoclast וללמוד את היווצרות של אוסטאופאוקיים בעצם. הביטוי החיובי של קליקים מזהה בבירור osteoclasts חזיק ומבדיל אותם מ מקרופאג polykaryons. קליקים התגלתה על-ידי. האימונולואורסנס שאומר הצבע הירוק מציין את הביטוי של קליקים והכחול הצביע על הגרעינים (איור 3).

Figure 1
איור 1: אוסטאופלסטובגנזה מ מח עצם-תאים נגזרים. (A) דמות ייצוגית של כתמים מלכודת. מיקרוגרף ברייטפילד בהגדלה של 10x מדגים מספר עצום של מונים, הנמצאים במרחק של השמנה וחיוביות ונצפו בהגדלה של 20x. דוגמה לגרעין בתוך אוסטאוקלסט של הארגון מוצג על ידי החץ האדום. (ב) מיקרוגרף השדה הברייטגרפי בהגדלה של 10x מוכיח כי קיימים מספר רב של סוגי אוסטאופי השמנה חיוביים. דוגמה לאוסטאוקלסט גדול ורב, המוקף בקו אדום מקווקו. (ג) השוואת הזמן המושקע בשתי שיטות הבידוד. כל המבצעים בוצעו על ידי אותה קבוצת ניסויים. הנתונים מייצגים את המשמעות של סטיית תקן של ±. * P < 0.05, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עצם הריזיה על ידי פרוסות עצם. (א) מיקרוגרף ברייטפילד ב-4x ההגדלה ממחיש את אזור ספיגת העצם, הוא מוכתם באור ירוק על ידי הכתם הכחול טולדין, והוא עגול, סגלגל, או נקניק בצורת. דוגמה לאזור ספיגת העצם מוצג על-ידי החץ האדום. (ב) הגדלת מיקרוסקופ אלקטרוני עם סריקת אלקטרון ב-500x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון הביטוי הקליקים באוסטאופה שנמשך באמצעות כתמים אימונולוקטורציאני. החלונית מציגה אות קליקים ברור מסביב לתאים. (A) קליקים-תאים חיוביים. (ב) גרעינים. (C) ממוזג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת להשיג וללמוד אוסטאופאוקיים בתחום החוץ הוא מיומנות קריטית ויסודית עבור כל חוקר המבקש ללמוד מטבוליזם העצם, אשר עשוי לעזור להבין את המנגנונים של מחלות העצם קליטת ולפתח סוכנים טיפוליים חדשניים. המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שינויים המבוססים על שיטות קודמות.

באמצעות טיפים וצינורות מיקרוצנטריפוגה כדי להשיג מח עצם, זה הפחית ברובו את זמן הפעולה של קבלת מח עצם ואת עומס העבודה של אנשי מעבדה לעומת שיטות מסורתיות. בינתיים, השיטה מונעת את הסיכון של אובדן מח עצם או המחט מקל פציעה. במחקר קודם, התאים הנגזרים מח עצם מצופים מיד לאחר בידוד12,13. צפיפות הצבע צנטריפוגה שימש לבחירת מונוציטים מח העצם בהתאם להבדלים במקדמים ההתנחלות. בתהליך הצנטריפוגה מעבר לצפיפות, יש לבצע בעדינות ובזהירות את מדיית ההפרדה התאית לאורך הקיר, כדי להבהיר את הגבולות. עם זאת, הטכניקה מוגבלת על ידי הפונקציה של הצנטריפוגה בין אם הוא מוגדר עם פרמטרים של האצה והאטה. צפיפות הזריעה היא התנאי העיקרי לטיפוח האוסטאופעות. מספר פעמים, הפרוטוקול נכשל עקב צפיפות הזריעה מגונה בעת ציפוי התאים. לפיכך, כ-300,000 תאים לכל לוח 24-ובכן מומלץ בפרוטוקול זה. פרוטוקול זה מתאים גם להשגת סוגים שונים של מח עצם-תאים נגזר בחולדות או בעלי חיים אחרים (למשל, עכבר, ארנב, עוף).

השיטה הקלאסית ביותר להערכת הפעילות של האוסטאופאוקיים היא שיטת הספיגת הבור. קליפת העצם של שור משמשת בדרך כלל עבור שיטת ספיגת הבור, כי המקורות שלה הם רבים זמינים. בעזרת מערכת מודרנית, אנו יכולים להשיג פרוסות עצם דקות בקלות רבה יותר. בעלת שלושה גורמים. כדי להפיק בהצלחה בור ספיגת מחודש בפרוסות, יש לטפל בפרוסות בקפדנות כמתואר בפרוטוקול. בנוסף, העכברים האוסטאופתי מופעלים כדי ליצור בורות ספיגת העצם בסביבה חומצית מעט, ואת הפונקציה ספיגת למעשה "כיבוי" כאשר ה-pH עולה מעל 7.214,15. לפיכך, ראוי לציין כי פתיחת דלת החממה לעתים קרובות במהלך ההתקדמות של הניסויים עלול להוביל לרטבאליות של ה-pH ו-pCO2 ערכים, אפילו השפעה על תפקוד ספיגת העצמות של האוסטאופאוקיים16. לבסוף, פרוסות העצם אמורות להישאר בתחתית הבארות ואין להעבירו או לצוף בעת שינוי המדיום, כדי למנוע גירוי.

קליקים הוא אחד החבר של מחלקת המשנה של מחלקה II של 7-חלבון-ממברנה מצמידים קולטנים אשר מכילים גם את הורמון יותרת התריס הפרשה קולטני בדיל17. כמו גם מלכודות השמנה ושיטת ספיגת הבור, osteoclasts מזוהים על ידי מורפולוגיה ותפקוד, ו קליקים-חיוביים מזהה osteoclasts נמשך אימונולוגיה. עכשיו, אנחנו יכולים גם להשתמש כתמים פלורסנט של הטבעת אקטין ולמדוד pyridinoline הצלב הקישורים ב-supernatant לזהות osteoclasts חזיקה.

למרות שחוקרים שונים יש קצוות משפחה שונים עם טכניקות ניסיוני ואת הסכום הכולל של התאים במח העצם הוא מסוים, הצלחנו להשיג תאים במח העצם בזמן קצר יותר, יחסית, ובסוף, השיגו כמויות גדולות של מלא אוסטאופאולים מובחנים ממוח עצם החולדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81473692) ליונג מא. המחברים מודים לכל הצוות של מרכז המחקר הרפואי של המכללה הראשונה לרפואה קלינית באוניברסיטת נאנג'ינג של הרפואה הסינית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Automatic Hard Tissue Slicer Lecia RM2265
Bovine femoral bone Purchased by ourselves
Cell Incubator Heraus BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum Sarana s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077
Hard Tissue Grinders Lecia SP-2600
Histopaque Kit TianJing Haoyang TBD2013DR Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342 Sigma-Aldrich B2261
Inverted Phase Contrast Microscope Olympus CKX31
Inverted Fluorescence Microscope Lecia DMI-3000
MEM, no Glutamine Gibco 11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor Bioss bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF PeproTech 400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand PeproTech 400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer Absin abs47014932
Scanning Electron Microscopy FEI Quanta 200
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89649

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
  3. Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
  4. Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
  5. Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
  6. Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
  7. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
  8. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
  9. Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
  10. Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
  11. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  12. Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
  13. Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
  14. Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
  15. Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
  16. Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
  17. Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).

Tags

ביולוגיה סוגיה 147 osteoclast אוסטאופורוזיס קולטן activator עבור הגרעין פקטור-κB ליגנד (rankl) שיפוץ עצם תא ביולוגיה בידוד עצם ספיגת עצמות
בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Zheng, S., Guo, Y., Pan,… More

Wang, L., Zheng, S., Guo, Y., Pan, Y., Sun, J., Xu, W., Lu, J., Li, W., Ma, Y. Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow. J. Vis. Exp. (147), e58895, doi:10.3791/58895 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter