Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.
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Artículo de método
Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata
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Resumen
Resumen
Los osteoclastos son células grandes, multinucleadas y que recurren al hueso del linaje de monocitos y macrófagos que se forman mediante la fusión de monocitos o precursores de macrófagos. La resorción ósea excesiva es uno de los mecanismos celulares más significativos que conducen a enfermedades osteolíticas, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica. La principal función fisiológica de los osteoclastos es absorber tanto el componente mineral de hidroxiapatita como la matriz orgánica de hueso, generando la apariencia de resorción característica en la superficie de los huesos. Hay relativamente pocos osteoclastos en comparación con otras células en el cuerpo, especialmente en los huesos adultos. Estudios recientes se han centrado en cómo obtener osteoclastos más maduros en menos tiempo, lo que siempre ha sido un problema. En los laboratorios se han desarrollado varias mejoras en las técnicas de aislamiento y cultivo para obtener osteoclastos más maduros. Aquí, introducimos un método que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional, utilizando un dispositivo especial y simple. Con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados de la médula ósea de rata, que se identifican mediante métodos clásicos.
Introducción
La la homeostasis ósea es un proceso fisiológico complejo que está regulado por osteoclastos de resorto óseo y osteoblastos de formación ósea1. Un equilibrio entre la actividad osteoblástica y osteoclástica mediada a través de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente, es muy esencial para mantener la salud ósea y la la homeostasis, porque las perturbaciones en la la homeostasis ósea pueden conducir a enfermedades óseas, tales como crecimiento óseo anormal o pérdida de densidad ósea. Como células únicas de resorción ósea, los osteoclastos son importantes en enfermedades relacionadas con la destrucción ósea anormal, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica2,3.
El desarrollo de un cultivo de los osteoclastos se divide principalmente en dos etapas. Los métodos establecidos por Boyde et al.4 y Chambers et al.5 componían la primera etapa de la década de 1980. Obtuvieron osteoclastos relativamente abundantes de los huesos de los animales recién nacidos, que es el período de remodelación rápida. Los osteoclastos se liberan al fragmentar y agitar los huesos en un medio especial. Sin embargo, las células obtenidas por este método son bajas en cantidad y pureza. La segunda etapa fue el desarrollo de cultivos de largo alcance de formación de osteoclastos, utilizando células de linaje hematopoyético derivadas de la médula ósea6. Citoquinas, tales como 1 α, 25-dihidroxivitamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), y la hormona paratiroidea (PTH), que se añaden en el medio de cultivo, actúan a través del sistema de osteoblastos/células del stromal para estimular la formación de los osteoclastos7,8 . Sin embargo, la pureza y la cantidad de osteoclastos obtenidos por este método no pueden satisfacer las necesidades de la investigación moderna de biología molecular. Luego, el descubrimiento del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador de receptores para el ligando de factor nuclear-κB (RANKL) hacen que la osteoclastogénesis sea más fácil9,10,11, y el método de uso de M-CSF y RANKL para estimular directamente la formación de los osteoclastos es ampliamente utilizado en todo el mundo. Sin embargo, todavía hay algunos detalles en la metodología que deben mejorarse.
En la actualidad, el método de cultivo de los osteoclastos más utilizado, según lo descrito por marino et al.12 y PEI et al.13, a menudo requiere la extirpación del tejido circundante alrededor del hueso y utiliza una aguja esterilizada para vaciar la cavidad de la médula con medios completados. Hay algunos inconvenientes en este proceso, incluyendo el hecho de que (1) la eliminación del tejido circundante alrededor del hueso requiere mucho tiempo y gran técnica quirúrgica, (2) los huesos son frágiles y pueden conducir a la salida de la médula ósea, (3) la cavidad de la médula ósea podría ser demasiado pequeño para vaciar, y (4) hay un riesgo de lesión de pinchazo de aguja. Para evitar estos problemas, centrifugamos los tubos que contienen los huesos para la médula ósea en lugar de lavar la médula ósea con la aguja. Aquí, introducimos un método estable y seguro que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional. Junto con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados in vitro.
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Protocolo
Todos los métodos que involucran a los animales descritos aquí son aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Medicina China de Nanjing.
1. Setup
- Prepare varias puntas de pipetas longitudinalmente cortadas de 1 mL (1 cm) y varios tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Poner las puntas de las pipetas y los tubos de microcentrífuga a 103 kPa y 121 ° c durante 20 min y asegurarse de que son estériles.
- Prepare una caja de hielo y varios platos estériles para preservar los tejidos aislados durante el procedimiento de aislamiento.
2. preparación del medio de cultivo
- Prepare el medio de cultivo completo. Utilice el alfa medio esencial mínimo (α-MEM) que contenga una solución final del 1% de penicilina/estreptomicina y un 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Filtre el medio desde el paso 2,1 usando un filtro de 0,22 μm.
- Prepare el medio de inducción de médula ósea. Para 50 mL de la solución, añadir 125 μL de M-CSF a una concentración de 10.000 ng/mL (tabla de materiales) a 49,875 ml de medio de cultivo completo (desde el paso 2,2) para hacer una solución final de 25 ng/ml m-CSF.
- Prepare el medio de inducción de los osteoclastos. Para 50 mL de la solución, Añadir 500 μL de RANKL a una concentración de 10.000 ng/mL (tabla de materiales) a 49,5 ml de medio de inducción de médula ósea (desde el paso 2,3) para hacer una solución final de 25 ng/ml M-CSF y 100 ng/ml RANKL.
3. aislamiento de células derivadas de Mmédula ósea
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eutanasia
- Eutanasia cuatro ratas Sprague Dawley por CO2 inhalación seguida de dislocación cervical, y sumergir en 75% etanol durante 1 min.
Nota: Asegúrese de que los animales son del mismo sexo y de una edad similar. Se recomiendan los animales de 2 a 3 semanas de edad. Dos ratas están preparadas para el método centrífugo, mientras que las otras dos son para el método tradicional.
- Eutanasia cuatro ratas Sprague Dawley por CO2 inhalación seguida de dislocación cervical, y sumergir en 75% etanol durante 1 min.
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Método tradicional
- Coloque los animales en una tabla desinfectante en posición supina. Hacer una pequeña incisión (aproximadamente 1 cm) en el fémur proximal para pelar la piel, usando tijeras estériles.
- Diseccionar los fémures y las tibias. Corte las partes de conexión bilaterales alrededor de las articulaciones de la cadera, la rodilla y el tobillo para aislar las tibias y los fémures con cuidado y suavidad. Corte parte de los tejidos alrededor del hueso; ser minucioso. No fracturar las tibias y fémures durante todo el proceso.
- Colocar los huesos limpios en un plato con 5 mL del medio de cultivo completo. Corte el hueso largo con tijeras estériles y use una aguja de jeringa de 1 mL para vaciar la cavidad de la médula con cuidado con 10 mL de medios completos hasta que la cavidad de la médula se vuelva blanca.
- Transfiera la suspensión de la célula del paso 3.2.3 a un tubo de 50 mL y, a continuación, filtre con un colador de 70 μm para retirar el tejido restante.
- Añadir 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (tabla de materiales) a la suspensión celular. Incubar las células durante 8 min en hielo. A continuación, centrifugar las células a 250 x g durante 5 min para producir el pellet de células.
- Aspirar el medio y resuspender las células en 10 mL de medios completos. Cuente las células utilizando un hemociómetro y calcule el tiempo invertido en los pasos de esta sección (sección 3,2).
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Método mejorado
- Coloque los animales en una tabla desinfectante en posición supina. Hacer una pequeña incisión (aproximadamente 1 cm) en el fémur proximal con tijeras estériles para pelar la piel.
- Diseccionar los fémures y las tibias. Cortar correctamente la parte de los tejidos alrededor del hueso (no hay necesidad de eliminar por completo). No fracturar las tibias y fémures durante todo el proceso.
- Enjuague las tibias y los fémures con 12 ml de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y córtelos por la mitad. Colocar las tibias y los fémures en una punta de pipetas de 1 ml (del paso 1,1), que luego se coloca en un tubo de microcentrífuga y se centrifuga 3x a 1.000 x g para 45 s a 4 ° c.
- Después de la centrifugación, retire la punta de la pileta que contiene el hueso y deje la médula ósea en el tubo. Añadir 200 μL de medios completos en el tubo de microcentrífuga y repetir el pipeteo para desintegrar la médula a fondo.
- Transfiera la suspensión celular del paso 3.3.4 a un tubo de 50 mL y, a continuación, filtre con un colador de 70 μm para extraer el tejido restante.
- Cuente las celdas usando un hemociómetro y calcule el tiempo invertido en los pasos de esta sección (sección 3,3).
4. purificación por centrifugación de gradiente de densidad
- Ajuste la suspensión celular desde el paso 3.2.6 o el paso 3.3.5 a 2 mL con α-MEM.
- Prepare un tubo centrífugo silicificado estéril y añada 8 mL de la solución de separación celular (tabla de materiales) al tubo.
- Añada la suspensión celular del paso 4,1 a la solución de separación celular. Adhiera la punta de la Piera a la superficie interior del tubo y mantenga un 45 ° en la superficie interior. Después de agregar la suspensión, aparecerá un límite claro entre la capa de las celdas y la solución de separación.
Nota: La operación requiere un gran cuidado y debe realizarse lentamente. - Centrifugar la solución en capas en una centrífuga horizontal a 500 x g durante 30 min. Después de la centrifugación, aspirar la segunda capa nublada, que contiene las celdas de destino, de arriba a abajo.
Nota: Cancelar la aceleración y deceleración de la centrífuga antes de la centrifugación. Hay seis capas después de la centrifugación; la primera capa es la capa de diluyente, la segunda capa es la capa monocitos, la tercera capa es la capa de células mononucleares, la cuarta capa es el líquido de separación transparente una capa, la quinta es la capa de célula granular, y la sexta capa es la célula roja acodo. - Transfiera las celdas de destino a un nuevo tubo. Añadir 5 mL de PBS para lavar las células 3x. Después de cada lavado, centrifugar las células diana a 250 x g durante 5 min para producir el pellet de células.
- Resuspend el pellet de células con medio de inducción de médula ósea y cuente las células usando un hemociómetro. Añadir 5 – 8 mL de medio de inducción de médula ósea del paso 2,3 para obtener una solución celular final de 300.000 células/mL. Añadir 1 mL a cada pozo de una placa de 24-well.
5. cultura y diferenciación
- Después de incuar las células a 37 ° c durante 24 h, aspirar suavemente el medio y añadir 1 mL del medio de inducción de los osteoclastos a cada pozo. Agitar suavemente la placa y ponerla en una incubadora a 37 ° c.
- Cambiar el medio de inducción de los osteoclastos cada 48 h. Al hacerlo, cambie 0,8 mL del medio en el pozo y agite suavemente la placa.
Nota: Se deben observar osteoclastos grandes, motiles y multinucleados en el pozo bajo un microscopio invertido, típicamente alrededor de los días 4 – 6.
6. tinción de fosfatasa ácida resistente a tartrato
Nota: Los osteoclastos multinucleados estarán presentes después de 4 – 6 días si la inducción (sección 5) es exitosa.
- Preparar la solución fijadora combinando 4 mL de formaldehído al 37%, 32,5 mL de acetona y 12,5 mL de una solución de citrato. Almacene la solución fijadora a 4 ° c.
- Prepare la solución antimanchas de fosfatasa ácida (TRAP) resistente al tartrato (tabla de materiales) añadiendo 50 μl de nitrito sódico, 50 μl de solución base GBC de granate rápido, 50 μl de solución de fosfato de naftol AS-BI, 200 μL de una solución de acetato y 100 μl de un solución de tartrato en 4,55 mL de agua desionizada que se precalentó a 37 ° c. Luego, mezclar suavemente por inversión durante 1 min, y dejarlo reposar durante 2 min.
- Después de la exitosa inducción de los osteoclastos, aspiran fuera del medio, y lavar suavemente los pozos 3x con PBS.
- Lleve la solución fijadora a la temperatura ambiente (RT). Añada 2 mL de solución fijadora a los pozos durante 30 s y no permita que las células se sequen.
- Aspirar la solución fijadora, lavar suavemente 3x con agua desionizada que se precalentó a 37 ° c, y luego, aspirar el agua.
- Añadir 2 mL de solución de manchas TRAP durante 1 h a 37 ° c y mantener la muestra en la oscuridad.
- Después de 1 h, aspirar la mancha, y lavar suavemente la muestra con agua desionizada que se precalentó a 37 ° c, y luego, aspiran el agua.
- Antimanchas de las células durante 1 min en una solución de hematoxilina. Después de la tinción, aspirar la solución de hematoxilina y lavar suavemente las células 3x con agua desionizada.
- La imagen osteoclastos usando microscopía de campo claro, y las células TRAP+ con tres o más núcleos aparecerán púrpuras.
7. ensayo de resorción ósea utilizando tinción azul toluidina
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El pretratamiento de las rodajas de hueso
- Corte la corteza ósea femoral bovina fresca en rodajas de 2 cm de espesor a lo largo del eje longitudinal mediante una sierra microeléctrica. A continuación, cortar y moler las rodajas con amoladoras de tejido duro en 80 μm.
- Lavar las rodajas en un vaso de precipitados con agua desionizada y ultrasonido de 100 Hz durante 1 h, y repetir 3x.
- Sumergir las rodajas en un 75% de alcohol durante 2 h. Luego, Aspire el alcohol y exponga cada lado de las rodajas a la luz ultravioleta durante 1 h en una plataforma limpia.
- Antes de plantar las células, sumergir las rodajas en el medio de cultivo durante al menos 2 h.
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Coloración azul toluidina
- Coloque las rodajas de hueso pretratadas en la placa de 24-well. Plantar las células como se menciona en el paso 4,6 e inducir las células como se menciona en la sección 5.
- Después de la aparición de osteoclastos (después de 4 – 6 días), lavar las rodajas con 1 mL de hidróxido de amonio de 0,25 M, y sonicarlos 3x durante 5 min cada uno para eliminar las células vivas para permitir el análisis de los pozos de resorción en las rodajas de hueso. A continuación, retire el hidróxido de amonio y manche las rodajas con 1 mL de solución azul de toluidina al 1% (WT/vol) por rebanada durante 2 min.
- Lave las rodajas con PBS. Seleccione aleatoriamente cinco vistas y realice un análisis semicuantitativo del área de resorción utilizando un software de análisis de imágenes.
8. microscopía electrónica de escaneo
- Anteponga las rodajas de hueso del paso 7.2.1 con 1 mL de glutaraldehído al 2,5% por rebanada durante 2 h en RT, y luego, Sonicar las rebanadas 3x durante 3 min cada una con 1 M de hidróxido de amonio para remover las células y remover el hidróxido de amonio.
- Lave las rodajas de hueso 3x durante 12 min cada una con PBS.
- Fije las rodajas de hueso con 1% de ácido osmico para 2 h en RT.
- Realizar deshidratación de gradiente de etanol, con 50%, 70%, 80%, 90%, y 95% de etanol, durante 15 min por cada gradiente, y luego, reemplace el etanol con acetato de isoamilo durante 15 min.
- Cubrir las rodajas con paladio de oro, y luego, analizar por microscopía electrónica de escaneo.
9. tinción de inmunofluorescencia del receptor de Calcitonin
Nota: Los osteoclastos multinucleados estarán presentes después de 4 – 6 días si la inducción es exitosa (sección 5).
- Aspira el medio y lava suavemente el pozo 3x con PBS.
- Fije las células durante 10 min con un 4% de paraformaldehído, que está preenfriado a 4 ° c.
- Añadir 1 mL de PBS con un tensioactivo no iónico al 0,3% por pozo durante 30 min en hielo. A continuación, aspirar el PBS con un tensioactivo no iónico al 0,3% y añadir 1 mL de PBS con 5% de FBS por pozo durante 30 min en hielo.
- Aspirar el PBS e incubar las membranas con receptor anticalcitonin (anti-CTR) a una dilución 1:100 en PBS a 4 ° c durante la noche.
- Aspire la solución e incube las membranas con los anticuerpos IgG anticonejo conjugados con Alexa-488 a una dilución de 1:1000 en PBS durante 1 h en RT.
- Aspiran la solución y lavan suavemente las células 3x con PBS. Contrtiñe los núcleos con la mancha 33342 de Hoechst durante 3 min en RT.
- Aspire la solución y lave suavemente las células 3x con PBS. Observe la intensidad de la CTR por microscopía de fluorescencia.
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Resultados
El propósito del protocolo era aislar y purificar un gran número de precursores de los osteoclastos convenientemente e inducir a los osteoclastos con éxito. Complementando con M-CSF y RANKL, se observaron osteoclastos gigantes en los días 5 – 6. La formación de osteoclastos se identificó con éxito mediante la tinción TRAP (figura 1A). Las células grandes y púrpuras fueron consideradas como células trampa-positivas con múltiples núcleos (típicamente ≥ tres núc...
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Discusión
La capacidad de obtener y estudiar osteoclastos in vitro es una habilidad crítica y fundamental para cualquier investigador que desee estudiar el metabolismo óseo, lo que puede ayudar a comprender los mecanismos de las enfermedades que absorben los huesos y desarrollar nuevos agentes terapéuticos. El presente estudio describió un protocolo con algunas modificaciones basadas en métodos anteriores.
Mediante el uso de puntas de pipetas y tubos de microcentrífuga para obtener médula ósea, redujo e...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta obra fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81473692) a Yong MA. Los autores agradecen a todo el personal del centro de investigación médica del primer Colegio de medicina clínica de la Universidad de Medicina China de Nanjing.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de fosfatasa ácida, lecocitos (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Cortadora automática de tejidos duros | Lecia | RM2265 | |
| Hueso | Comprado por nosotros | ||
| Incubadora de células | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Suero fetal bovino | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Cabra Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Trituradoras de tejidos duros | Lecia | SP-2600 | |
| Kit histopaco | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Tubo centrífugo silicificado y solución de separación celular |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Microscopio de contraste de fase invertida | Olympus | CKX31 | |
| Microscopio de fluorescencia invertida | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, sin glutamina | Gibco | 11090-081 | |
| Penicilina-Estreptomicina, | Gibco | líquido 15140122 | |
| Conejo Receptor anti-calcitonina | Bioss | bs-0124R | |
| Rata Recombinante M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Rata Recombinante Ligando | sRANKPeproTech | 400-30 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Absina | abs47014932 | |
| Microscopía electrónica de barrido | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidina Azul | Sigma-Aldrich | 89649 |
Referencias
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570(2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
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Reimpresiones y permisos
