Summary
Osteoclasts är vävnadsspecifika makrofagpolykaryoner härledda från monocyt-makrofaghärstamning av hematopoetiska stamceller. Detta protokoll beskriver hur man isolerar benmärgs celler så att stora mängder osteoklaster erhålls samtidigt som risken för olyckor som påträffas i traditionella metoder minskas.
Abstract
Osteoclasts är stora, multinukleerade, och benresorbering celler av monocyt-makrofaghärstamning som bildas av fusion av monocyter eller makrofagprekursorer. Överdriven benresorption är en av de mest signifikanta cellulära mekanismer som leder till osteolytiska sjukdomar, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys. Den huvudsakliga fysiologiska funktionen av Osteoklasterna är att absorbera både hydroxyapatit mineral komponenten och den organiska matrisen av ben, generera den karakteristiska benresorption utseende på ytan av ben. Det finns relativt få Osteoklasterna jämfört med andra celler i kroppen, särskilt i vuxna ben. Nyligen genomförda studier har fokuserat på hur man kan få mer mogna Osteoklasterna på kortare tid, vilket alltid har varit ett problem. Flera förbättringar av isolerings-och odlings teknikerna har utvecklats i laboratorier för att få mer mogna osteoklaster. Här introducerar vi en metod som isolerar benmärg på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet, med hjälp av en speciell och enkel enhet. Med hjälp av densitetsgradient centrifugering, vi får stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna från råtta benmärg, som identifieras med klassiska metoder.
Introduction
Ben homeostas är en komplex fysiologisk process som regleras av benresorbering Osteoklasterna och benbildande osteoblaster1. En balans mellan osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet medierad genom osteoblaster och osteoklaster, respektive, är mycket viktigt för att upprätthålla benhälsa och homeostas, eftersom störningar i ben homeostas kan leda till skelett sjukdomar, såsom onormal ben tillväxt eller förlust av ben täthet. Som unika ben-resorption celler, Osteoklasterna är viktiga vid sjukdomar relaterade till onormal ben förstörelse, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys2,3.
Utvecklingen av en osteoklast kultur är huvudsakligen uppdelad i två steg. De metoder som fastställdes av Boyde et al.4 och Chambers et al.5 bestod av den första etappen på 1980-talet. De erhöll relativt riklig Osteoklasterna från benen på nyfödda djur, vilket är den snabba remodeling period. Osteoclasts frigörs genom att fragmentera och omrörning benen i ett speciellt medium. De celler som erhålls med denna metod är dock låga i kvantitet och renhet. Den andra etappen var utvecklingen av långväga kulturer av osteoklast bildning, med hjälp av hematopoetiska härstamning celler som härrör från benmärg6. Cytokiner, såsom 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), och parathormon (pth), som tillsätts i odlings mediet, verkar genom systemet med osteoblaster/stromaceller för att stimulera osteoklastbildningen7,8 . Den renhet och mängd osteoklaster som erhålls genom denna metod kan dock inte tillgodose behoven hos modern molekylär biologisk forskning. Sedan, upptäckten av makrofag Colony-stimulerande faktor (M-CSF) och receptor Activator för nukleär faktor-κb ligand (Rankl) gör osteoclastogenesis lättare9,10,11, och metoden för att använda M-CSF och RANKL att direkt stimulera osteoklast formation används i stor utsträckning runt om i världen. Det finns dock fortfarande vissa detaljer i den metod som behöver förbättras.
För närvarande, den vanligaste osteoklast kulturen metod, som beskrivs av Marino et al.12 och Pei et al.13, ofta kräver avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet och använder en steriliserad nål för att spola benmärg hålighet med färdigställda medier. Det finns vissa nack delar med denna process, inklusive det faktum att (1) avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet kräver mycket tid och stor kirurgisk teknik, (2) benen är sköra och kan leda till benmärg utflöde, (3) benmärg hålighet kan vara för liten för att spola, och (4) det finns en risk för nålstick skada. För att undvika dessa problem, vi Centrifugera rören som innehåller benen för benmärg i stället för nål-spolning benmärgen. Här introducerar vi en stabil och säker metod som isolerar benmärgen på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet. Tillsammans med användning av densitetsgradient centrifugering, vi erhåller stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna in vitro-.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som omfattar de djur som beskrivs här är godkända av den institutionella djur omsorg och användning kommittén (IACUC) av Nanjing University of Chinese Medicine.
1. inställning av
- Förbered flera longitudinellt skurna 1 mL pipettspetsar (1 cm) och flera 1,5 mL mikrocentrifugrör. Sätt pipettspetsarna och mikrocentrifugrör vid 103 kPa och 121 ° c i 20 minuter och se till att de är sterila.
- Förbered en låda med is och flera sterila rätter för att bevara den isolerade vävnader under isolerings förfarandet.
2. beredning av odlings substrat
- Förbered hela odlings mediet. Använd minsta essentiella medium alfa (α-MEM) som innehåller en slutlig lösning på 1% av penicillin/streptomycin och 10% Foster bovint serum (FBS).
- Filtrera mediet från steg 2,1 med hjälp av ett 0,22 μm filter.
- Förbered benmärgs induktions mediet. För 50 mL av lösningen, tillsätt 125 μL av M-CSF i en koncentration av 10 000 ng/mL (material tabell) till 49,875 ml komplett odlings substrat (från steg 2,2) för att göra en slutlig lösning av 25 ng/ml m-CSF.
- Förbered det osteoksista induktions mediet. För 50 mL av lösningen, tillsätt 500 μL RANKL vid en koncentration av 10 000 ng/mL (material tabell) till 49,5 ml av benmärgs induktions mediet (från steg 2,3) för att göra en slutlig lösning av 25 ng/ml M-CSF och 100 ng/ml Rankl.
3. isolering av ben-Mbenmärgshärledda celler
-
Dödshjälp
- Euthanize fyra Sprague Dawley råttor av CO2 inhalation följt av cervikal dislokering, och sänk dem i 75% etanol för 1 min.
Anmärkning: Se till att djuren är av samma kön och av liknande ålder. Djur som är 2 till 3 veckor gamla rekommenderas. Två råttor är för beredda för centrifugalmetoden, medan de andra två är för den traditionella metoden.
- Euthanize fyra Sprague Dawley råttor av CO2 inhalation följt av cervikal dislokering, och sänk dem i 75% etanol för 1 min.
-
Traditionell metod
- Placera djuren på ett desinfektions medel i ett liggande läge. Gör ett litet snitt (ca 1 cm) vid proximala lårbenet för att skala huden, med hjälp av sterila saxar.
- Dissekera det lårben och Tibias. Skär de bilaterala anslutnings delarna runt höft-, knä-och vristlederna för att isolera skenben och lårben försiktigt och försiktigt. Skära av en del av vävnaderna runt benet; vara noggrann. Frakturera inte skenben och femurer under hela processen.
- Placera de rengjorda benen i en skål med 5 mL av hela odlings mediet. Klipp av det långa benet med steril sax och Använd en 1 mL sprutnål för att spola benmärg kaviteten noggrant med 10 mL komplett Media tills benmärgen kaviteten blir vit.
- Överför cell SUS pensionen från steg 3.2.3 till ett 50 mL-rör och filtrera den sedan med en 70 μm-sil för att avlägsna den kvarvarande vävnaden.
- Tillsätt 5 mL av den röda blodcellslyssningsbufferten (material tabell) till cell SUS pensionen. Inkubera cellerna i 8 min på isen. Centrifugera sedan cellerna vid 250 x g i 5 minuter för att ge cellpelleten.
- Aspirera av mediet och omsuspendera cellerna i 10 mL komplett media. Räkna cellerna med en hemocytometern och beräkna den tid som tillbringas på stegen i detta avsnitt (avsnitt 3,2).
-
Förbättrad metod
- Placera djuren på ett desinfektions medel i ett liggande läge. Gör ett litet snitt (ca 1 cm) vid proximala lårbenet med steril sax för att skala huden.
- Dissekera det lårben och Tibias. Ordentligt skära av den del av vävnaderna runt benet (inget behov av att ta bort helt). Frakturera inte skenben och femurer under hela processen.
- Skölj skenben och lårben med 12 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skär dem i hälften. Placera den klippt skenben och lårben i en 1 ml pipettspets (från steg 1,1), som sedan placeras i en microcentrifug röret och centrifugeras 3x på 1 000 x g för 45 s vid 4 ° c.
- Efter centrifugering, ta bort pipettspetsen som innehåller benet och lämna benmärgen i röret. Tillsätt 200 μL av hela mediet i mikrocentrifugröret och upprepa pipettering för att desinfiera märgen grundligt.
- Överför cell SUS pensionen från steg 3.3.4 till ett 50 mL-rör och filtrera den sedan med en 70 μm-sil för att avlägsna resterande vävnad.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och beräkna den tid som tillbringas på stegen i detta avsnitt (avsnitt 3,3).
4. rening genom densitetsgradient centrifugering
- Justera cell SUS pensionen från steg 3.2.6 eller steg 3.3.5 till 2 mL med α-MEM.
- Förbered ett sterilt silicifierat centrifugalrör och tillsätt 8 mL av cell separations lösningen (material tabell) till röret.
- Tillsätt cell SUS pensionen från steg 4,1 till cell separations lösningen. Följ pipettspetsen till den inre ytan av röret och håll en 45 ° till den inre ytan. Efter att ha lagt till SUS pensionen visas en tydlig gräns mellan cellernas lager och separations lösningen.
Anmärkning: Operationen kräver stor omsorg och måste utföras långsamt. - Centrifugera den skiktade lösningen i en horisontell centrifug på 500 x g i 30 min. Efter centrifugering aspirera bort det grumliga andra skiktet, som innehåller mål cellerna, uppifrån och ned.
Anmärkning: Avbryt centrifugernas acceleration och retardation före centrifugering. Det finns sex lager efter centrifugering; det första skiktet är spädnings vätskan skiktet, det andra skiktet är monocyter skiktet, det tredje skiktet är lagret av mononukleära celler, det fjärde skiktet är den genomskinliga separationen flytande ett lager, den femte är granulär cellager, och det sjätte skiktet är den röda cellen Lager. - Överför mål cellerna till ett nytt rör. Tillsätt 5 mL PBS för att tvätta cellerna 3x. Efter varje tvätt, Centrifugera mål cellerna vid 250 x g i 5 minuter för att ge cellpelleten.
- Omsuspendera cellpelleten med benmärgs induktions medium och räkna cellerna med en hemocytometer. Tillsätt 5 – 8 mL benmärgs induktions medel från steg 2,3 för att erhålla en slutlig cell lösning med 300 000 celler/mL. Tillsätt 1 mL till varje brunn av en 24-well tallrik.
5. kultur och differentiering
- Efter inkubering av cellerna vid 37 ° c i 24 timmar, aspirera försiktigt av mediet och tillsätt 1 mL av osteoklast induktions mediet till varje brunn. Skaka plattan försiktigt och Lägg den i en inkubator vid 37 ° c.
- Ändra osteoklast induktions mediet varje 48 h. Medan du gör det, ändra 0,8 mL av mediet i brunnen och agitera plattan försiktigt.
Anmärkning: Stora, rörliga och multinukleerade osteoklaster bör observeras i brunnen under ett inverterat Mikroskop, vanligt vis runt dag 4 – 6.
6. tartrat-resistent Acid fosfatas färgning
Anmärkning: Multinucleate Osteoklasterna kommer att närvara efter 4 – 6 dagar om induktion (avsnitt 5) är framgångs rik.
- Bered den fixerande lösningen genom att kombinera 4 mL 37% formaldehyd, 32,5 mL aceton och 12,5 mL citratlösning. Förvara den fixerande lösningen vid 4 ° c.
- Förbered tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) fläck lösning (tabell över material) genom att tillsätta 50 μL natriumnitrit, 50 μl av fast garnet GBC bas lösning, 50 μl av naftol som-bi-fosfatlösning, 200 μl av en acetatlösning, och 100 μl av en tartratlösning till 4,55 mL avjoniserat vatten som är förvärmt till 37 ° c. Blanda sedan försiktigt genom att inversion i 1 min, och låt den stå i 2 min.
- Efter den framgångs rika induktion av osteoclasts, aspirera bort mediet, och försiktigt Tvätta brunnarna 3x med PBS.
- Ta den fixerande lösningen till rums temperatur (RT). Tillsätt 2 mL fixativ lösning till brunnarna i 30 s och låt inte cellerna torka.
- Aspirera den fixativ lösningen, försiktigt tvätta den 3x med avjoniserat vatten som är föruppvärmd till 37 ° c, och sedan, aspirera vattnet.
- Tillsätt 2 mL TRAP fläck lösning för 1 h vid 37 ° c och håll provet i mörker.
- Efter 1 h, aspirera fläcken, och försiktigt tvätta provet med avjoniserat vatten som är föruppvärmd till 37 ° c, och sedan, aspirera vattnet.
- Motfärga cellerna i 1 min i en hematoxylinlösning. Efter färgning, aspirera den hematoxylin lösningen och försiktigt tvätta cellerna 3x med avjoniserat vatten.
- Bild Osteoklasterna med brightfield mikroskopi, och Trap+ celler med tre eller fler kärnor kommer att visas lila.
7. benresorption-analys med toluidin blå färgning
-
Förbehandling av ben skivorna
- Skär den friska nötkreatur lår bens Barken i 2 cm tjocka skivor längs den längsgående axeln av microelectric såg. Sedan, klippa och slipa skivorna med hårdvävnad slipmaskiner i 80 μm.
- Tvätta skivorna i en bägare med avjoniserat vatten och 100 Hz ultraljud för 1 h, och upprepa 3x.
- Doppa skivorna i 75% alkohol för 2 h. Sedan aspirera bort alkoholen och exponera varje sida av skivorna till ultraviolett ljus för 1 h på en ren plattform.
- Sänk ned skivorna i odlings mediet i minst 2 timmar innan du planterar cellerna.
-
Toluidin blå färgning
- Placera de förbehandlade ben skivorna i 24-brunnen plattan. Plantera cellerna som nämns i steg 4,6 och inducera cellerna som nämns i avsnitt 5.
- Efter uppkomsten av Osteoklasterna (efter 4-6 dagar), tvätta skivorna med 1 ml 0,25 M ammoniumhydroxid, och sonikera dem 3x för 5 min vardera för att ta bort de levande cellerna för att möjliggöra analys av benresorption gropar på ben skivor. Ta sedan bort ammoniumhydroxid och färga skivorna med 1 mL 1% (WT/Vol) toluidin blå lösning per skiva i 2 min.
- Tvätta skivorna med PBS. Slumpmässigt välja fem vyer och utföra en semikvantitativ analys av benresorption området med hjälp av en bild analys program vara.
8. scanning elektronmikroskopi
- Prefix benet skivor från steg 7.2.1 med 1 mL 2,5% glutaraldehyd per skiva för 2 h vid RT, och sedan, Sonikera skivorna 3x för 3 min vardera med 1 M ammoniumhydroxid för att ta bort cellerna och ta bort ammoniumhydroxid.
- Tvätta ben skivorna 3x i 12 min vardera med PBS.
- Fäst ben skivorna med 1% osmic syra för 2 h vid RT.
- Utför etanol lutning uttorkning, med 50%, 70%, 80%, 90%, och 95% etanol, för 15 min för varje lutning, och sedan, ersätta etanol med isoamylacetat för 15 min.
- Coat skivorna med guld Palladium, och sedan analysera genom att skanna elektronmikroskopi.
9. immunofluorescens färgning av kalcitonin-receptorn
Anmärkning: Multinucleate Osteoklasterna kommer att närvara efter 4 – 6 dagar om induktionen är lyckad (avsnitt 5).
- Aspirera bort mediet och försiktigt tvätta väl 3x med PBS.
- Fixera cellerna i 10 min med 4% paraformaldehyd, som förkyls till 4 ° c.
- Tillsätt 1 mL PBS med 0,3% nonioniskt ytaktivt ämne per brunn i 30 min på is. Aspirera sedan av PBS med 0,3% Nonjonaktivt ytaktivt ämne och tillsätt 1 ml PBS med 5% FBS per brunn för 30 min på is.
- Aspirera av PBS och inkubera membranen med anti-kalcitoninreceptorn (anti-CTR) vid en 1:100 spädning i PBS vid 4 ° c över natten.
- Aspirera bort lösningen, och inkubera membranen med Alexa-488-konjugerade anti-kanin IgG-antikroppar vid en 1:1000 spädning i PBS för 1 h vid RT.
- Aspirera bort lösningen och försiktigt tvätta cellerna 3x med PBS. Motfärga kärnor med Hoechst 33342 fläck i 3 min vid RT.
- Aspirera bort lösningen, och försiktigt tvätta cellerna 3x med PBS. Observera intensiteten av CTR genom fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med protokollet var att isolera och rena ett stort antal osteoklast prekursorer bekvämt och inducera Osteoklasterna framgångs rikt. Genom att komplettera med M-CSF och RANKL sågs jätte osteoklaster på dag 5 – 6. Bildandet av Osteoklasterna identifierades med lyckat resultat av trap-färgning (figur 1a). Stora och lila celler betraktades som TRAP-positiva celler med flera kärnor (typiskt ≥ tre kärnor). Genom denna metod, det var typiskt att få 800 osteoclasts, som innehåller så många som 30 kärnor per osteoclast, i en 24-brunn tallrik (figur 1b). Jämfört med den traditionella metoden sparade den förbättrade metoden ungefär 20 minuter i hela isolerings förloppet (figur 1c).
Användning av ben skivor för att bedöma aktiviteten av benresorption är typisk in vitro-metod. Genom toluidin blå färgning, var benresorption området visualiseras som ljusgrön (figur 2A) och beräknades. Struktur och egenskaper hos ben gro par observerades tydligt genom scanning elektronmikroskopi (figur 2b).
CTR, en av de osteoklast-specifika cell markörer, är avgörande för att identifiera Osteoklasterna och studera bildandet av Osteoklasterna i ben. Det positiva uttrycket för CTR identifierar tydligt osteoklaster och särskiljer dem från makrofagpolykaryoner. CTR upptäcktes av immunofluorescensanalyser. Den gröna färgen indikerade uttrycket av CTR och blått indikerade Atom kärnor (figur 3).
Figur 1: Osteoclastogenes från benmärgshärledda celler. (A) representativ bild av trap-färgning. Den brightfield mikrograf på 10x förstoring visar flera jätte, multinucleära osteoklaster som är trap-positiva och observerades vid 20x förstoring. Ett exempel på en kärna i en multinucleära osteoklaster visas med den röda pilen. (B) brightfield mikrograf vid 10x förstoring bevisar att ett stort antal trap-positiva osteoklaster var närvarande. Ett exempel på en stor, multinucleära osteoklaster beskrivs av röd streckad linje. Cjämförelse av den tid som ägnats åt de två isolerings metoderna. Alla operationer utfördes av samma grupp av experimenterare. Uppgifterna representerar medlen ± standard avvikelsen. * P < 0,05, n = 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: benresorption-analyser av ben skivor. (A) brightfield mikrograf vid 4x förstoring visar benresorption området, är fläckig ljusgrön av toluidin blå fläcken, och är rund-, oval-, eller korv-formad. Ett exempel på benresorptionsområdet visas med den röda pilen. (B) resorption gropar observeras med scanning elektronmikroskopi vid 500x förstoring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: karakterisering av CTR-uttrycket i Osteoklasterna med användning av immunofluorescens-färgning. Panelen visar en tydlig CTR-signal runt cellerna. (A) CTR-positiva celler. B) nuklei. (C) sammanslagna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att få och studera Osteoklasterna in vitro-är en kritisk och grundläggande färdighet för alla forskare som vill studera benmetabolism, som kan bidra till att förstå mekanismerna för benabsorberande sjukdomar och utveckla nya terapeutiska medel. I den här studien beskrevs ett protokoll med vissa modifieringar baserade på tidigare metoder.
Genom att använda pipettspetsar och mikrocentrifugrör för att få benmärg minskade det till stor del Operations tiden för att få benmärg och laboratorie personalens arbets börda jämfört med traditionella metoder. Under tiden, metoden undviker risken för benmärgs förlust eller nålstick skada. I en tidigare studie, benmärgs celler som härrör omedelbart efter isolering12,13. Densitetsgradientcentrifugering användes för att välja benmärgs monocyter enligt skillnaderna i bosättningskoefficienterna. I processen för densitetsgradientcentrifugering, måste tillsatsen av cell separations mediet utföras försiktigt och försiktigt längs väggen, för att göra gränserna tydliga. Men tekniken begränsas av centrifugernas funktion och om den är inställd med parametrarna för acceleration och retardation. Den seedning densitet är det viktigaste villkoret för odling av osteoclasts. Flera gånger, protokollet misslyckades på grund av en felaktig sådd densitet vid plätering cellerna. Sålunda, cirka 300 000 celler per 24-well plattan väl rekommenderas i detta protokoll. Detta protokoll är också lämpligt för att erhålla olika typer av benmärgshärledda celler hos råttor eller andra djur (t. ex. mus, kanin och kyckling).
Den mest klassiska metoden för att utvärdera aktiviteten av Osteoklasterna är benresorption Pit-analysen. Bovint ben cortex används ofta för benresorption grop analysen eftersom dess källor är allmänt tillgängliga. Med hjälp av ett modernt snittnings system kan vi lättare få tunna ben skivor. Benresorption Pit-analysen har tre faktorer. För att framgångs rikt generera en benresorption grop i sektorerna, måste skivorna behandlas strikt som beskrivs för avförning i protokollet. Dessutom är råtta Osteoklasterna aktive ras för att bilda benresorption gropar i en något sur miljö, och benresorption funktionen kommer i huvudsak "stänga" när pH går upp över 7,214,15. Det är därför anmärknings värt att öppnandet av inkubator dörren ofta under utvecklingen av experimenten kan leda till störningar av pH och PCO2 värden, även påverka benresorption funktion av Osteoklasterna16. Slutligen bör ben skivorna förbli i botten av brunnarna och bör inte flyttas eller flyta upp vid byte av medium, för att undvika irritation.
CTR är en medlem av klass II under familjen av de 7-transmembrana G-protein-kopplade receptorer som också innehåller parathormon och sekretin receptorer17. Liksom trap färgning och benresorption grop analys, Osteoklasterna identifieras genom morfologi och funktion, och CTR-positiva identifierar osteoklaster i immunologi. Nu kan vi också använda fluorescerande färgning av aktin ringen och mäta pyridinolin tvär länkar i supernatanten att identifiera osteoclasts.
Även om olika forskare har olika familiarities med experimentella tekniker och den totala mängden celler i benmärgen är säker, vi fick benmärgs celler på kortare tid, relativt, och i ändan, erhållna stora mängder av fullt osteoklaster från råtta benmärg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81473692) till Yong ma. Författarna tackar alla anställda vid Medical Research Center i den första hög skolan för klinisk medicin i Nanjing University of Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
