Summary
Остеокласты представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из моноцитов-макрофагов линии гемопоэтических стволовых клеток. Этот протокол описывает, как изолировать клетки костного мозга, чтобы получить большое количество остеокластов при одновременном снижении риска несчастных случаев, найденных в традиционных методах.
Abstract
Остеокласты большие, многоядерные, и кости-расрезные клетки моноцитов-макрофагов линии, которые формируются путем слияния моноцитов или прекурсоров макрофагов. Чрезмерное резорбция кости является одним из наиболее значимых клеточных механизмов, ведущих к остеолитических заболеваний, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеомолиза. Основной физиологической функцией остеокластов является поглощение как гидроксиапатитового минерального компонента, так и органической матрицы костной ткани, генерирующей характерный вид резорбции на поверхности костей. Есть относительно мало остеокластов по сравнению с другими клетками в организме, особенно у взрослых костей. Недавние исследования были посвящены тому, как получить более зрелые остеокласты за меньшее время, что всегда было проблемой. В лабораториях в целях получения более зрелых остеокластов были разработаны некоторые усовершенствования в методах изоляции и культуры. Здесь мы вводим метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой, используя специальное и простое устройство. С использованием градиента центрифугирования плотности, мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов из крысиного костного мозга, которые определены классическими методами.
Introduction
Костный гомеостаз – это сложный физиологический процесс, регулируемый остеокластами костной ткани и образующие костные остеобласты1. Равновесие между остеобластным и остеокластов активностью при посредничестве остеобластов и остеокластов, соответственно, крайне важно для поддержания здоровья костей и гомеостаза, поскольку возмущения в костном гомеостазе могут приводить к заболеваниям костей, таким как аномальный рост костей или потеря плотности костной ткани. Как уникальные кости-резорбции, остеокласты имеют важное значение при заболеваниях, связанных с аномальной костной разрушения, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеолиза2,3.
Развитие Остеокласт в основном делится на два этапа. Методы, созданные Бойде et al.4 и камерами et al.5 , составили первый этап в 1980-х годах. Они получили относительно обильные остеокласты из костей новорожденных животных, что является быстрым периодом реконструкции. Остеокласты выпускаются путем фрагментации и перемешивания костей в специальной среде. Тем не менее, клетки, полученные этим методом, являются низкими по количеству и чистоте. Вторым этапом было развитие культур дальнего действия остеокластов, использование клеток гематопоэтических родословных, полученных из костного мозга6. Цитокинов, таких как 1а, 25-дигидроксивитамин D3, простагландин Е2 (PGE-2) и паратиреоидный гормон (ПТГ), которые добавляются в среду культуры, действуют через систему остеобластов/стромальных клеток, чтобы стимулировать образование остеокластов7,8 . Однако чистота и количество остеокластов, полученных этим методом, не могут удовлетворить потребности современной молекулярной биологии. Затем, открытие макрофагов колонии-стимулирующий фактор (м-КСФ) и рецептор активатора для ядерного фактора-Клаб лиганда (rankl) сделать остеокластогенез легче9,10,11, и метод использования м-КСФ и RANKL непосредственно стимулировать образование остеокластов широко используется во всем мире. Тем не менее, есть еще некоторые детали в методологии, которые должны быть улучшены.
В настоящее время наиболее часто используемый метод остеокластов, описанный Марино et al.12 и пей et al.13, часто требует удаления окружающих тканей вокруг кости и использует стерилизованные иглы для смыва костного мозга с Завершенные средства массовой информации. Есть некоторые недостатки этого процесса, в том числе тот факт, что (1) удаление окружающих тканей вокруг кости требует много времени и большой хирургической техники, (2) кости хрупкие и может привести к оттоку костного мозга, (3) полость костного мозга может быть слишком крошечные, чтобы флеш, и (4) есть риск травмы Stick иглы. Чтобы избежать этих проблем, мы центрифугирования труб, содержащих кости для костного мозга, а не иглы промывка костного мозга. Здесь мы представляем стабильный и безопасный метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой. Вместе с использованием градиента центрифугирования плотности мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, связанные с животными, описанным здесь, одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных (ИАКУК) Нанкинского университета китайской медицины.
1. Настройка
- Подготовьте несколько продольно срезанные 1 мл пипетки (1 см) и несколько 1,5 мл микроцентрифуг. Положите пипетки советы и микроцентрифуги на 103 КНА и 121 ° c для 20 мин и убедитесь, что они стерильны.
- Приготовьте коробку со льдом и несколько стерильных тарелок, чтобы сохранить изолированные ткани во время процедуры изоляции.
2. Подготовка культурной среды
- Подготовьте полную среду культуры. Использование минимального необходимого среднего альфа-и-мем, содержащего окончательное решение 1% пенициллина/стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФПС).
- Фильтр СМИ от шага 2,1 с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Подготовьте среду индукции костного мозга. Для 50 mL раствора добавьте 125 мкл м-ФГО при концентрации 10 000 нг/мл (таблица материалов) до 49,875 мл полной питательной среды (от шага 2,2), чтобы сделать окончательное решение 25 нг/мл м-СМЖ.
- Подготовьте среду индукции остеокластов. Для 50 mL из раствора, добавить 500 мкл из RANKL в концентрации 10 000 нг/мл (таблица материалов) до 49,5 мл костного мозга индукции среды (от шага 2,3), чтобы сделать окончательное решение 25 нг/мл м-КСФ и 100 нг/мл rankl.
3. изоляция клеток костного мозга, полученных
-
Эвтаназии
- Усыпляйте четыре крысы Спраг даули на CO2 вдыхании следуют шейки дислокации, и погрузить их в 75% этанола в течение 1 мин.
Примечание: Убедитесь, что животные одного пола и того же возраста. Рекомендуются животные от 2 до 3 недель. Две крысы готовятся к центробежные метод, в то время как два других предназначены для традиционного метода.
- Усыпляйте четыре крысы Спраг даули на CO2 вдыхании следуют шейки дислокации, и погрузить их в 75% этанола в течение 1 мин.
-
Традиционный метод
- Поместите животных на дезинфицирующее доска в положении лежа на спине. Сделайте небольшой разрез (приблизительно 1 см) в проксимальном бедре, чтобы очистить кожу, используя стерильные ножницы.
- Вскрыть из бедра и tiпредвзятость. Вырезать двусторонние соединения частей вокруг бедра, колена и голеностопа суставов, чтобы изолировать и бедренные кости осторожно и нежно. Отрезать часть тканей вокруг кости; быть тщательным. Не делайте переломов и бедренные кости в течение всего процесса.
- Поместите очищенные кости в блюдо с 5 мл полной культуры среды. Отрезать длинную кость с стерильными ножницами и использовать 1 мл шприц иглы для смыва костного мозга тщательно с 10 мл полных средств массовой информации до мозга полости становится белым.
- Перенесите клеточную подвеску от шага 3.2.3 к трубке 50 mL, а затем, фильтруйте ее с помощью стрейнера 70 мкм, чтобы удалить оставшиеся ткани.
- Добавьте 5 мл буфера лизиса красных кровяных клеток (таблица материалов) в клеточную подвеску. Инкубировать клетки в течение 8 минут на льду. Затем, центрифуга клеток на 250 x g в течение 5 минут, чтобы дать ячейки гранул.
- Аспирин от среды и ресуспензируем клетки в 10 мл полных средств массовой информации. Подсчитайте ячейки с помощью хемоцитометер и вычислите время, затраченное на шаги из этого раздела (раздел 3,2).
-
Улучшенный метод
- Поместите животных на дезинфицирующее доска в положении лежа на спине. Сделать небольшой разрез (около 1 см) в проксимальных бедренных костей с стерильными ножницами, чтобы очистить кожу.
- Вскрыть из бедра и tiпредвзятость. Правильно отрезать часть тканей вокруг кости (не нужно полностью удалять). Не делайте переломов и бедренные кости в течение всего процесса.
- Промыть Тикос и бедренных костей с 12 мл фосфата-буферизованные физиологический раствор (PBS) и разрезать их пополам. Поместите в наконечник пипетки 1 мл (от шага 1,1), который затем ставится в пробирку микроцентрифуги и центрифугируются 3x при 1 000 x g для 45 s при температуре 4 °c.
- После центрифугирования удалите кончик пипетки, содержащий кость, и оставьте костный мозг в трубке. Добавьте 200 мкл полных носителей в трубку микроцентрифуги и повторите пипетки, чтобы полностью разрушить костный мозг.
- Перенесите клеточную подвеску от шага 3.3.4 к трубке 50 mL, а затем, фильтруйте ее с помощью стрейнера 70 мкм, чтобы удалить оставшиеся ткани.
- Подсчитайте ячейки, используя хемоцитометер, и вычислите время, затраченное на шаги из этого раздела (раздел 3,3).
4. Очистка по плотности градиента центрифугирования
- Отрегулируйте суспензию ячейки от 3.2.6 шага или шага 3.3.5 до 2 мл с мэм.
- Подготовьте одну стерильную силиконовый центробежную трубку и добавьте 8 мл раствора разделения клетки (таблица материалов) в трубку.
- Добавить суспензию ячейки от шага 4,1 к решению ячейки разделения. Придерживайтесь пипетки наконечник на внутреннюю поверхность трубки и держать 45 ° на внутреннюю поверхность. После добавления подвески будет отображаться четкий предел между слоем клеток и раствором разделения.
Примечание: Операция требует большой заботы и должна выполняться медленно. - Центрифуга слоистых раствор в горизонтальной центрифуги при 500 x g в течение 30 мин. После центрифугирования, аспирин от мутный второй слой, который содержит целевые клетки, сверху вниз.
Примечание: Отменить ускорение и замедление центрифуги до центрифугирования. Есть шесть слоев после центрифугирования; Первый слой является слой разбавителя, второй слой моноцитов слой, третий слой слой мононуклеарных клеток, четвертый слой прозрачного разделения жидкости один слой, пятый является гранулированный слой клеток, и шестой слой является Красная Клетка Слой. - Перенесите целевые ячейки в новую трубку. Добавить 5 мл PBS для мытья клеток 3x. После каждого мытья, центрифуга целевых клеток на 250 x g в течение 5 минут, чтобы дать ячейки гранул.
- Ресуспензируем клеток гранулы с костного мозга среды индукции и подсчета клеток с помощью хемоцитометер. Добавьте 5 – 8 мл среды индукции костного мозга от шага 2,3, чтобы получить окончательное решение ячейки 300 000 клеток/мл. Добавить 1 мл к каждому хорошо 24-хорошо пластины.
5. Культура и дифференциация
- После инкубации клеток при температуре 37 ° c в течение 24 ч, осторожно аспоат от среды и добавить 1 мл Остеокласт индукции среды для каждого хорошо. Осторожно взволновать пластину и поместить ее в инкубатор при температуре 37 ° c.
- Измените среду индукции остеокластов каждые 48 h. При этом, изменить 0,8 mL из среды в колодец и агитировать пластины осторожно.
Примечание: Большие, motile, и многоядерные остеокласты должны наблюдаться в колодец под Перевернутый Микроскоп, как правило, вокруг дней 4-6.
6. тартрат-устойчивые кислоты фосфатазы окрашивание
Примечание: Остеокласты мултинуклеате будут присутствовать после 4 – 6 дней, если индукция (раздел 5) будет успешной.
- Подготовьте фиксативный раствор, объединив 4 мл 37% формальдегида, 32,5 мл ацетона и 12,5 мл раствора цитрата. Храните фиксиительное решение при температуре 4 °C.
- Подготовьте тартрат-резистентные кислоты фосфатазы (ловушка) пятно решение (таблица материалов), добавив 50 МКН нитрит натрия, 50 мкл быстрого граната БЦ базового решения, 50 мкл нафсол AS-BI фосфата решение, 200 мкл ацетатного раствора, и 100 мкл тартрат раствор в 4,55 мл обожионизированной воды, которая предварительно разогревается до 37 °C. Затем смешайте мягко инверсией для 1 мин, и дайте ему постоять 2 мин.
- После успешной индукции остеокластов, аспоат от среды, и осторожно промойте скважин 3x с PBS.
- Довести фиксативное решение до комнатной температуры (RT). Добавьте 2 мл фиксиительного раствора в скважины на 30 с и не позволяйте клеткам высохнуть.
- Аспирин раствор, Осторожно промойте его 3x с обожонизированной воды, которая предварительно разогрет до 37 ° c, а затем, аспирин воды.
- Добавить 2 мл ловушки пятно решение для 1 ч на 37 ° c и сохранить образец в темноте.
- После 1 ч, аспирин пятно, и осторожно промойте образец с обожионизированной воды, которая предварительно разогрет до 37 ° c, а затем, аспоте воды.
- Противоокрашивать клетки в течение 1 мин в раствор гематоксилина. После окрашивания, аспирин раствор для гематоксилина и аккуратно мыть клетки 3x с деионизированной воды.
- Изображение остеокластов с использованием микроскопии Брайта, и ловушки+ клетки с тремя или более ядрами появятся фиолетовые.
7. кость резорбция анализ с использованием Толуидин синий окрашивание
-
Предварительная обработка ломтиков кости
- Вырезать свежего крупного рогатого скота бедренной кости коры на 2 см толщиной ломтиками вдоль продольной оси микроэлектрической пилы. Затем вырезать и измельчить ломтики с твердой ткани измельчители в 80 мкм.
- Вымойте ломтики в стакане с деионизированной водой и 100 Гц УЗИ для 1 ч, и повторите 3x.
- Погрузите ломтики в 75% спирта на 2 ч. Затем, аспирин от алкоголя и подвергать каждую сторону ломтиками ультрафиолетовым светом для 1 ч на чистую платформу.
- Перед посадкой клеток, погрузить ломтики в культуре среды, по крайней мере 2 ч.
-
Толуидин синий окрашивание
- Поместите предварительно обработанные кусочки кости в 24-хорошо пластины. Завод клетки, как упоминалось в шаге 4,6 и побудить клетки, как упоминалось в разделе 5.
- После появления остеокластов (после 4 – 6 дней), промойте ломтики с 1 мл 0,25 м гидроксида аммония, и sonicate их 3x в течение 5 минут каждый, чтобы удалить живые клетки, чтобы анализ резорбции ямы на ломтиков костей. Затем удалите Гидроксид аммония и испачкать ломтики с 1 мл 1% (т/т) толуидиновых синего раствора на ломтик в течение 2 мин.
- Вымойте ломтики с PBS. Случайным образом выберите пять просмотров и выполните полуколичественный анализ области резорбции с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
8. сканирующая электронная микроскопия
- Приставка кусочки кости от шага 7.2.1 с 1 мл 2,5% глутаральдегид на ломтик для 2 ч в РТ, а затем, sonicate ломтики 3x для 3 мин каждый с 1 м Гидроксид аммония для удаления клеток и удаления гидроксида аммония.
- Вымойте кусочки кости 3x за 12 минут каждый с PBS.
- Fix кусочки кости с 1% осминой кислоты в течение 2 ч на RT.
- Выполните обезвоживание градиента этанола, с 50%, 70%, 80%, 90%, и 95% этанола, в течение 15 минут для каждого градиента, а затем, замените этанол с изоамил ацетат для 15 мин.
- Пальто ломтики с золотом палладий, а затем проанализировать путем сканирования электронной микроскопии.
9. иммунофлуоресцентное окрашивание кальцитонина рецептора
Примечание: Остеокласты мултинуклеате будут присутствовать после 4 – 6 дней, если индукция успешна (раздел 5).
- Аспирин от среды и осторожно мыть хорошо 3x с PBS.
- Исправьте клетки на 10 мин с 4% параформальдегида, который предварительно охлаждается до 4 °C.
- Добавить 1 мл PBS с 0,3% нонионический сурфактант в колодец на 30 мин на льду. Затем, аспирин от PBS с 0,3% нонионический сурфактант и добавить 1 мл PBS с 5% ФПС на хорошо за 30 мин на льду.
- Аспирин от PBS и инкубировать мембраны с анти-кальцитонина рецептора (анти-рейтинг кликов) на 1:100 разрежения в PBS при температуре 4 °C в одночасье.
- Аспирин от раствора, и инкубировать мембраны с Alexa-488-спряжения анти-кролика IgG антител на 1:1000 разбавления в PBS для 1 ч на RT.
- Аспирин от раствора и осторожно мыть клетки 3x с PBS. Контрпятно ядер с Хехст 33342 пятно на 3 мин в рт.
- Аспирин от раствора, и осторожно мыть клетки 3x с PBS. Соблюдайте интенсивность КЛИКОВ по флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель протокола заключалась в том, чтобы удобно изолировать и очищать большое количество прекурсоров остеокластов и успешно вызывать остеокласты. Дополняя M-СМЖ и RANKL, гигантские остеокласты были замечены в дни 5-6. Формирование остеокластов было успешно идентифицировано пятнать ловушки (рис. 1A). Большие и фиолетовые клетки рассматривались как ловушки-позитивные клетки с несколькими ядрами (обычно три ядра). С помощью этого метода, это было типично для получения 800 остеокластов, содержащих до 30 ядер на Остеокласт, в 24-хорошо пластины (рис.1B). По сравнению с традиционным методом, Улучшенный метод сэкономил примерно 20 мин во всей изоляции прогресса (рис. 1C).
Использование ломтиков кости для оценки активности резорбции костной ткани является типичным методом экстракорпорального метода. Через толуидин синий окрашивание, области резорбции был визуализирован как светло-зеленый (рис. 2a) и был рассчитан. Структура и характеристики костяных Ям отчетливо наблюдались при сканировании электронной микроскопии (Диаграмма 2B).
Рейтинг кликов, один из специфических клеточных маркеров остеокластов, имеет решающее значение для выявления остеокластов и изучения образования остеокластов в костях. Положительное выражение Суу четко определяет остеокласты и отличает их от макрофагов поликарионов. Рейтинг кликов был обнаружен иммунофлуоресцентных анализов. Зеленый цвет указывает на выражение Суу, а синий-на ядра (рис. 3).
Рисунок 1: Остеокластогенез из клеток костного мозга. (A) репрезентативное изображение окрашивания ловушки. Микрограф на 10 х увеличении демонстрирует множественные гигантские, многоядерные остеокласты, которые являются ЛОВУШКОЙ-позитивными и наблюдались при 20x увеличении. Пример ядра в многоядерные Остеокласт показан красной стрелкой. (B) микрограф Брайта при 10-кратному увеличении доказывает, что большое количество остеокластов с ловушкой-позитивными присутствуют. Пример большого, многоядерные, изложенным красной пунктирной линией. (C) сравнение времени, затраченного на два метода изоляции. Все операции выполняются одной и той же группой экспериментаторов. Данные представляют собой средство ± стандартное отклонение. * P < 0,05, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: резорбция костной ткани с помощью ломтиков костей. А) микрограф брайтфилд при 4-кратном увеличении демонстрирует область резорбции кости, окрашенный в светло-зеленый цвет толуидинским синим пятном, и круглый, овальный, или в форме колбасы. Пример области резорбции кости показана красной стрелкой. (B) резорбции ямы наблюдаются при сканировании электронной микроскопии при увеличении 500X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: характеристика выражения "Ви" в остеокластов с применением иммунофлуоресцентного окрашивания. Панель показывает четкий сигнал КЛИКОВ по клеткам. А) Суу-позитивные клетки. (B) ядер. (C) объединены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность получать и изучать остеокласты в пробирке является критическим и фундаментальным навыком для любого исследователя, желающего изучать костный метаболизм, что может помочь понять механизмы костной поглощающей болезни и развить новые терапевтические агенты. В настоящем исследовании описан протокол с некоторыми изменениями на основе предыдущих методов.
Используя пипетки и микроцентрифужные трубки для получения костного мозга, это в значительной степени уменьшило время работы по получению костного мозга и рабочей нагрузки лабораторного персонала по сравнению с традиционными методами. Между тем, метод избегает риска потери костного мозга или травмы палочки иглы. В предыдущем исследовании, клетки, полученные из костного мозга, были покрыты сразу после изоляции12,13. Градиент плотности центрифугирования использовался для отбора моноцитов костного мозга в зависимости от различий в коэффициентах поселения. В процессе центрифугирования плотность плотности, Добавление ячейки разделения СМИ должны быть выполнены осторожно и осторожно вдоль стены, чтобы сделать четкие границы. Однако, методика ограничена функцией центрифуги и в том, устанавливается ли она с параметрами ускорения и замедления. Плотность посева является ключевым условием для выращивания остеокластов. Несколько раз протокол не удалось из-за неправильной плотности посева при обшивки клеток. Таким образом, примерно 300 000 клеток на 24-хорошо пластины хорошо рекомендуется в этом протоколе. Этот протокол также подходит для получения различных видов клеток костного мозга, полученных от крыс или других животных (например, мышь, кролик и курица).
Наиболее классическим методом оценки активности остеокластов является анализ резорбции ямы. Бычий кость коры обычно используется для анализа резорбции ямы, потому что его источники широко доступны. С помощью современной системы секционирования, мы можем получить тонкие кусочки кости легче. Анализ резорбции ямы имеет три фактора. Для того чтобы произвести успешно яму резорбции в ломтиках, ломтики необходимо рассматривать строго как описано для дефаттинг в протоколе. Кроме того, крысы остеокласты активируются в форме рассасывания ям в слегка кислой среде, и функция резорбции будет по существу «закрыта», когда рН поднимается выше 7,214,15. Таким образом, следует отметить, что часто открытие дверей инкубатора во время хода экспериментов может привести к возмущениям значений рН и ВКП2 , даже влияя на функцию резорбции остеокластов16. Наконец, кусочки кости должны оставаться в нижней части скважины и не должны быть перемещены или всплывают при изменении среды, для того, чтобы избежать раздражения.
СУУ является одним из членов подсемейства II класса, из 7-трансмембран G-белок-совместили рецепторы, которые также содержат паратиреоидный гормон и секретин рецепторы17. Как и окрашивание ловушки и анализ резорбции яму, остеокласты определены морфологии и функции, и рейтинг кликов-положительных идентифицирует остеокластов в иммунологии. Теперь, мы можем также использовать люминесцентное окрашивание актина кольца и измерить пириндолин перекрестках в супернатант для выявления остеокластов.
Хотя различные исследователи имеют различные знакомства с экспериментальными методами и общее количество клеток в костном мозге уверен, мы получили клетки костного мозга в более короткие сроки, относительно, и в конце концов, получил большое количество полностью дифференцированные остеокласты из крысиного костного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81473692) к Юн мА. Авторы благодарят весь коллектив медицинского исследовательского центра первого колледжа клинической медицины в Нанкинском университете китайской медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
