Summary
Osteoklaster er vev-spesifikke macrophage polykaryons avledet fra monocytt-macrophage avstamning av blodkreft stamceller. Denne protokollen beskriver hvordan du isolerer benmargceller slik at store mengder osteoklaster oppnås samtidig redusere risikoen for ulykker som finnes i tradisjonelle metoder.
Abstract
Osteoklaster er store, multinucleated, og Ben-resorbing celler av monocytt-macrophage avstamning som er dannet av fusjon av monocytter eller macrophage forløpere. Overdreven bein resorpsjon er en av de mest betydningsfulle cellulære mekanismer som fører til osteolytiske sykdommer, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis. Den viktigste fysiologiske funksjon av osteoklaster er å absorbere både hydroksyapatitt mineral komponent og organisk matrise av bein, genererer den karakteristiske resorpsjon utseende på overflaten av bein. Det er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, spesielt i voksen bein. Nyere studier har fokusert på hvordan å få mer modne osteoklaster på kortere tid, som alltid har vært et problem. Flere forbedringer i isolasjon og kultur teknikker har utviklet seg i laboratorier for å oppnå mer modne osteoklaster. Her introduserer vi en metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren, ved hjelp av en spesiell og enkel enhet. Med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster fra rotte benmarg, som er identifisert av klassiske metoder.
Introduction
Bone homeostase er en kompleks fysiologisk prosess som er regulert av Ben-resorbing osteoklaster og bein-forming osteoblaster1. En balanse mellom osteoblastaktivitet og osteoclastic aktivitet formidlet gjennom osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er svært viktig for å opprettholde bein helse og homeostase, fordi forstyrrelser i bein homeostase kan føre til bein sykdommer, slik som unormal bein vekst eller tap av bentetthet. Som unike Ben-resorpsjon celler, osteoklaster er viktige i sykdommer knyttet til unormal bein ødeleggelse, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis2,3.
Utviklingen av en osteoclast kultur er i hovedsak delt inn i to etapper. Metodene etablert av Boyde et al.4 og Chambers et al.5 komponerte den første etappen på 1980-tallet. De fikk relativt rikelig osteoklaster fra bein av nyfødte dyr, som er den raske remodeling perioden. Osteoklaster er utgitt av fragmentering og stirring beina i et spesielt medium. Men cellene innhentet av denne metoden er lav i kvantitet og renhet. Den andre fasen var utviklingen av langtrekkende kulturer av osteoclast formasjon, bruker blodkreft avstamning celler avledet fra benmarg6. Cytokiner, som 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), og parathyroid hormon (PTH), som er lagt inn i kulturen medium, handle gjennom systemet av osteoblaster/stromal celler for å stimulere osteoclast formasjon7,8 . Imidlertid kan renheten og mengden av osteoklaster innhentet av denne metoden ikke oppfyller behovene til moderne molekylærbiologi forskning. Deretter oppdagelsen av macrophage koloni-stimulerende Factor (M-CSF) og reseptor aktivator for kjernefysisk faktor-KB ligand (RANKL) gjør osteoclastogenesis enklere9,10,11, og metoden for å bruke M-CSF og RANKL å direkte stimulere osteoclast formasjon er mye brukt rundt om i verden. Det er imidlertid fortsatt noen detaljer i metodikken som må forbedres.
Foreløpig den mest brukte osteoclast kultur metoden, som beskrevet av Marino et al.12 og Pei et al.13, ofte krever fjerning av omkringliggende vev rundt benet og bruker en sterilisert nål for å skylle margen hulrom med fullførte medier. Det er noen ulemper med denne prosessen, inkludert det faktum at (1) fjerning av omkringliggende vev rundt benet krever mye tid og stor kirurgisk teknikk, (2) beina er skjøre og kan føre til benmarg utløp, (3) benmargen hulrom kan være for liten til å spyle, og (4) det er en risiko for nål Stick skade. For å unngå disse problemene, sentrifuger vi rørene som inneholder bein for benmarg i stedet for nål-Flushing benmargen. Her introduserer vi en stabil og sikker metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren. Sammen med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som involverer dyrene er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Nanjing University of Chinese Medicine.
1. oppsett
- Forbered flere lengderetningen klipp 1 mL pipette tips (1 cm) og flere 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Sett pipette tips og mikrosentrifugen rør ved 103 kPa og 121 ° c i 20 min og sikre at de er sterile.
- Forbered en eske med is og flere sterile retter for å bevare det isolerte vevet under isolasjons prosedyren.
2. utarbeidelse av kultur medium
- Forbered hele kulturen medium. Bruk minimum essensiell medium Alpha (α-MEM) som inneholder en endelig løsning på 1% av penicillin-Streptomycin og 10% fosterets blod serum (FBS).
- Filtrer mediet fra trinn 2,1 ved hjelp av et 0,22 μm-filter.
- Forbered benmargen induksjon medium. For 50 mL oppløsning, tilsett 125 μL av M-CSF ved en konsentrasjon på 10 000 ng/mL (tabell over materialer) til 49,875 ml komplett kultur medium (fra trinn 2,2) for å lage en endelig løsning på 25 ng/ml M-CSF.
- Forbered osteoclast induksjon medium. For 50 mL oppløsning, tilsett 500 μL av RANKL ved en konsentrasjon på 10 000 ng/mL (tabell av materialer) til 49,5 ml benmarg induksjon medium (fra trinn 2,3) for å lage en endelig løsning av 25 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL.
3. isolering av Bone mMarrow-avledede celler
-
Euthanasia
- Euthanize fire Sprague Dawley rotter av CO2 inhalasjon etterfulgt av cervical forvridning, og dyppe dem i 75% etanol i 1 min.
Merk: Sørg for at dyr er av samme kjønn og av en lignende alder. Dyr som er 2 til 3 uker gamle anbefales. To rotter er forberedt på sentrifugal metoden, mens de to andre er for den tradisjonelle metoden.
- Euthanize fire Sprague Dawley rotter av CO2 inhalasjon etterfulgt av cervical forvridning, og dyppe dem i 75% etanol i 1 min.
-
Tradisjonell metode
- Plasser dyrene på et desinfeksjonsmiddel bord i en liggende stilling. Lag et lite snitt (ca 1 cm) ved proksimale femur å skrelle huden, ved hjelp av sterile saks.
- Analysere ut femurs og tibias. Skjær de bilaterale forbindelses delene rundt hofte-, kne-og ankel leddene for å isolere tibias og femurs forsiktig og forsiktig. Skjær av en del av vevet rundt benet; være grundig. Ikke brudd på tibias og femurs under hele prosessen.
- Plasser renset bein i en tallerken med 5 mL av den komplette kulturen medium. Klipp av den lange benet med steril saks og bruk en 1 mL sprøyte nål for å skylle marg hulrommet forsiktig med 10 mL komplett Media til margen hulrom blir hvit.
- Overfør celle suspensjonen fra trinn 3.2.3 til en 50 mL rør, og deretter filtrere den med en 70 μm sil for å fjerne det resterende vevet.
- Tilsett 5 mL rød blod cellelyse Rings buffer (tabell med materialer) til celle fjæringen. Ruge cellene i 8 min på isen. Deretter sentrifuger cellene på 250 x g for 5 min å gi cellen pellet.
- Aspirer av mediet og resuspend cellene i 10 mL av komplette medier. Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer, og Beregn tiden som er brukt på trinnene fra denne delen (del 3,2).
-
Forbedret metode
- Plasser dyrene på et desinfeksjonsmiddel bord i en liggende stilling. Lag et lite snitt (ca 1 cm) ved proksimale femur med steril saks for å skrelle huden.
- Analysere ut femurs og tibias. Riktig avskåret den delen av vev rundt benet (ikke nødvendig å fjerne helt). Ikke brudd på tibias og femurs under hele prosessen.
- Skyll tibias og femurs med 12 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) og skjær dem i to. Plasser snipped tibias og femurs i en 1 mL pipette spissen (fra trinn 1,1), som deretter settes inn i et mikrosentrifugen rør og er sentrifugert 3x ved 1 000 x g for 45 s ved 4 ° c.
- Etter sentrifugering, Fjern pipette spissen inneholder benet, og la benmargen i røret. Tilsett 200 μL av komplett Media inn i mikrosentrifugen røret og gjenta pipettering for å oppløses margen grundig.
- Overfør celle suspensjonen fra trinn 3.3.4 til en 50 mL rør, og deretter filtrere den med en 70 μm sil for å fjerne det resterende vevet.
- Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer, og Beregn tiden som er brukt på trinnene fra denne delen (del 3,3).
4. rensing av Density gradient sentrifugering
- Juster celle fjæringen fra trinn 3.2.6 eller trinn 3.3.5 til 2 mL med α-MEM.
- Forbered en steril silifisering sentrifugal rør og tilsett 8 mL av celle separasjon løsningen (tabell over materialer) til røret.
- Legg til celle suspensjonen fra trinn 4,1 til celle skille løsningen. Fest pipette spissen til den indre overflaten av røret og holde en 45 ° til den indre overflaten. Etter å legge til suspensjonen, vil en klar grense vises mellom lag av celler og separasjon løsning.
Merk: Operasjonen krever stor forsiktighet og må utføres langsomt. - Sentrifuger den lagdelte løsningen i en horisontal sentrifuge ved 500 x g i 30 min. Etter sentrifugering, aspirer av det skyet andre laget, som inneholder målcellene, fra topp til bunn.
Merk: Avbryte akselerasjon og retardasjon av sentrifuger før sentrifugering. Det er seks lag etter sentrifugering; det første laget er fortynnings laget, det andre laget er monocytter laget, det tredje laget er laget av mononukleære celler, det fjerde laget er den gjennomsiktige separasjon væsken ett lag, den femte er kornet celle laget, og det sjette laget er den røde cellen Lag. - Overfør målcellene til et nytt rør. Tilsett 5 mL PBS å vaske cellene 3x. Etter hver vask, sentrifuger målcellene ved 250 x g i 5 min for å gi cellen pellet.
- Resuspend cellen pellet med benmarg induksjon medium og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer. Tilsett 5 – 8 mL benmarg induksjon medium fra trinn 2,3 for å få en endelig celle løsning av 300 000 celler/mL. Tilsett 1 mL til hver brønn av en 24-brønn plate.
5. kultur og differensiering
- Etter incubating av cellene ved 37 ° c i 24 timer, aspirer forsiktig av mediet og tilsett 1 mL av osteoclast induksjon medium til hver brønn. Agitere platen forsiktig og legg den i en inkubator ved 37 ° c.
- Endre osteoclast induksjon medium hver 48 h. Mens du gjør det, endre 0,8 mL av mediet i brønnen og agitere platen forsiktig.
Merk: Store, aktive og multinucleated osteoklaster bør observeres i brønnen under et invertert mikroskop, vanligvis rundt dag 4 – 6.
6. Tartrate acid fosfatase farging
Merk: Multinucleate osteoklaster vil være til stede etter 4 – 6 dager hvis induksjon (avsnitt 5) er vellykket.
- Klargjør bindemiddel løsningen ved å kombinere 4 mL 37% formaldehyd, 32,5 mL aceton, og 12,5 mL av en citrate løsning. Oppbevar den bindemiddel løsningen ved 4 ° c.
- Forbered den Tartrate-resistente syre fosfatase (TRAP) beis løsning (tabell av materialer) ved å tilsette 50 μL av natrium nitritt, 50 ΜL av fast garnet GBC base løsning, 50 μL av naphthol AS-bi fosfat oppløsning, 200 μL av en acetate løsning, og 100 μL av en Tartrate oppløsning i 4,55 mL deionisert vann som er prewarmed til 37 ° c. Deretter blandes forsiktig ved inversjon i 1 min, og la det stå i 2 min.
- Etter den vellykkede induksjon av osteoklaster, aspirer av mediet, og forsiktig vaske brønnene 3x med PBS.
- Bring den bindemiddel løsningen til romtemperatur (RT). Tilsett 2 mL bindemiddel løsning til brønnene for 30 s, og ikke la cellene tørke.
- Aspirer den bindemiddel løsningen, vask den forsiktig 3x med deionisert vann som er prewarmed til 37 ° c, og deretter aspirer vannet.
- Tilsett 2 mL FELLE flekk løsning for 1 t ved 37 ° c og behold prøven i mørket.
- Etter 1 h, aspirer flekken, og forsiktig vask prøven med deionisert vann som er prewarmed til 37 ° c, og deretter, aspirer vannet.
- Counterstain cellene i 1 min i en hematoksylin løsning. Etter farging, aspirer den hematoksylin løsningen og forsiktig vaske cellene 3x med deionisert vann.
- Image osteoklaster bruker brightfield mikroskopi, og TRAP+ celler med tre eller flere kjerner vises lilla.
7. Bone resorpsjon analysen bruke Toluidine Blue farging
-
Forbehandling av bein skiver
- Skjær den friske storfe lårbeinet cortex i 2 cm tykke skiver langs langsgående aksen ved microelectric så. Deretter klippe og slipe skiver med harde vev kverner inn 80 μm.
- Vask skiver i et beger med deionisert vann og 100 Hz ultralyd for 1 h, og gjenta 3x.
- Dypp skivene i 75% alkohol for 2 t. Deretter aspirer av alkohol og utsett hver side av skiver til ultrafiolett lys for 1 time på en ren plattform.
- Før planting cellene, dyppe skiver i kulturen medium for minst 2 t.
-
Toluidine blå farging
- Plasser forbehandlet bein skiver i 24-brønn plate. Plant cellene som nevnt i trinn 4,6, og indusere cellene som nevnt i avsnitt 5.
- Etter utseendet av osteoklaster (etter 4-6 dager), vask skiver med 1 mL 0,25 M ammonium natriumhydroksid, og sonikere dem 3x i 5 min hver for å fjerne levende celler for å tillate analyse av resorpsjon groper på benet skiver. Deretter fjerner du ammonium og flekker skiver med 1 mL 1% (WT/Vol) toluidine blå oppløsning per skive i 2 min.
- Vask skiver med PBS. Velg tilfeldig fem visninger og utfør en analyse analyse av resorpsjon området ved hjelp av et bildeanalyse program.
8. skanning av Electron mikroskopi
- Prefiks benet skiver fra trinn 7.2.1 med 1 mL 2,5% glutaraldehyde per skive for 2 h på RT, og deretter sonikere skiver 3x for 3 min hver med 1 M ammonium natriumhydroksid å fjerne cellene og fjerne ammonium natriumhydroksid.
- Vask bein skivene 3x i 12 minutter hver med PBS.
- Fest Ben skiver med 1% osmic syre for 2 h ved RT.
- Utfør etanol gradient dehydrering, med 50%, 70%, 80%, 90%, og 95% etanol, i 15 min for hver gradient, og deretter erstatte etanol med isoamylacetat acetate i 15 min.
- Coat skiver med gull Palladium, og deretter analysere ved å skanne elektron mikroskopi.
9. Immunofluorescence farging av calcitonin reseptor
Merk: Multinucleate osteoklaster vil være til stede etter 4 – 6 dager hvis innledningen er vellykket (avsnitt 5).
- Aspirer av mediet og forsiktig vaske brønnen 3x med PBS.
- Fest cellene i 10 minutter med 4% paraformaldehyde, som er forkjøles til 4 ° c.
- Tilsett 1 mL PBS med 0,3% ioniske overflateaktivt middel per brønn i 30 minutter på is. Deretter aspirer av PBS med 0,3% ioniske overflateaktivt middel og tilsett 1 mL PBS med 5% FBS per brønn for 30 min på isen.
- Aspirer av PBS og ruge membraner med anti-calcitonin reseptor (anti-CTR) ved en 1:100 fortynning i PBS ved 4 ° c over natten.
- Aspirer av løsningen, og ruge membraner med Alexa-488-bøyd anti-kanin IgG antistoffer ved en 1:1000 fortynning i PBS for 1 time ved RT.
- Aspirer av løsningen og forsiktig vaske cellene 3x med PBS. Counterstain kjerner med Hoechst 33342 beis for 3 min ved RT.
- Aspirer av løsningen, og forsiktig vaske cellene 3x med PBS. Observer intensiteten av CTR ved fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med protokollen var å isolere og rense et stort antall osteoclast forløpere bekvemt og indusere osteoklaster vellykket. Ved å supplere med M-CSF og RANKL ble gigantiske osteoklaster sett på dag 5 – 6. Dannelsen av osteoklaster ble vellykket identifisert ved TRAP farging (figur 1a). Store og lilla celler ble betraktet som TRAP-positive celler med flere kjerner (vanligvis ≥ tre kjerner). Gjennom denne metoden var det typisk å skaffe 800 osteoklaster, som inneholdt så mange som 30 kjerner per osteoclast, i en 24-brønn plate (figur 1B). Sammenlignet med den tradisjonelle metoden, sparte den forbedrede metoden omtrent 20 min i hele isolasjons fremgangen (figur 1C).
Bruke bein skiver for å vurdere aktiviteten av bein resorpsjon er typisk in vitro-metoden. Gjennom toluidine blå farging ble det resorpsjon området som lys grønn (fig.2a) og ble kalkulert. Strukturen og egenskapene til bein gropene ble tydelig observert ved å skanne elektron mikroskopi (fig. 2b).
CTR, en av de osteoclast-spesifikke celle markører, er avgjørende for å identifisere osteoklaster og studere dannelsen av osteoklaster i benet. Det positive uttrykket for CTR identifiserer tydelig osteoklaster og skiller dem fra macrophage polykaryons. CTR ble oppdaget av immunofluorescence analysene. Den grønne fargen indikerte uttrykk for CTR og den blå indikerte kjerner (Figur 3).
Figur 1: Osteoclastogenesis fra benmarg-avledede celler. (A) representativt bilde av Trap farging. Den brightfield mikroskop ved 10x forstørrelse demonstrerer flere gigantiske, multinucleated osteoklaster som er TRAP-positive og ble observert ved 20x forstørrelse. Et eksempel på en kjerne i en multinucleated osteoclast vises med den røde pilen. (B) brightfield mikroskop ved 10x forstørrelse beviser at et stort antall Trap-positive osteoklaster var til stede. Et eksempel på en stor, multinucleated osteoclast er skissert av den røde stiplede linjen. (C) sammenligning av tiden brukt på de to isolasjons metoder. Alle operasjonene ble utført av den samme gruppen av forskere. Dataene representerer midlene ± standardavviket. * P < 0,05, n = 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bone resorpsjon analyser av bein skiver. (A) den brightfield mikroskop på 4X forstørrelse demonstrerer benet resorpsjon området, er farget lys grønn av toluidine blå flekken, og er rund-, oval-, eller pølse-formet. Et eksempel på ben resorpsjon området vises med den røde pilen. (B) resorpsjon groper observert med skanning elektron mikroskopi på 500x forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: karakterisering av CTR-uttrykket i osteoklaster ved hjelp av immunofluorescence farging. Panelet viser et klart CTR-signal rundt cellene. (A) CTR-positive celler. (B) kjerner. (C) fusjonerte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å skaffe og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grunnleggende ferdighet for enhver forsker som ønsker å studere bein metabolisme, som kan bidra til å forstå mekanismene for Ben-absorberende sykdommer og utvikle romanen terapeutiske midler. Den foreliggende studien beskrev en protokoll med noen modifikasjoner basert på tidligere metoder.
Ved å bruke pipette tips og mikrosentrifugen rør for å få benmarg, det i stor grad redusert operasjonstiden for å skaffe benmarg og arbeidsmengden av laboratoriepersonell i forhold til tradisjonelle metoder. Mellomtiden, unngår metoden risikoen for benmarg tap eller nål Stick skade. I en tidligere studie, benmarg-avledet celler ble belagt umiddelbart etter isolasjon12,13. Tetthet gradient sentrifugering ble brukt til å velge benmargen monocytter i henhold til forskjellene i oppgjøret koeffisienter. I prosessen med tetthet gradient sentrifugering, tillegg av celle separasjon mediene må utføres forsiktig og forsiktig langs veggen, for å gjøre grensene klare. Imidlertid er teknikken begrenset av funksjonen av sentrifuger og i om det er satt opp med parametrene av akselerasjon og retardasjon. Seeding tettheten er nøkkelen forutsetning for dyrking av osteoklaster. Flere ganger, protokollen mislyktes på grunn av en uriktig seeding tetthet når plating cellene. Dermed er omtrent 300 000 celler per 24-brønn plate godt anbefalt i denne protokollen. Denne protokollen er også hensiktsmessig for å skaffe ulike typer benmarg-avledet celler i rotter eller andre dyr (f. eks, mus, kanin, og kylling).
Den mest klassiske metoden for å evaluere aktiviteten til osteoklaster er resorpsjon pit analysen. Storfe bein cortex er vanligvis brukes for resorpsjon pit analysen fordi kildene er allment tilgjengelig. Ved hjelp av et moderne skjære system kan vi lettere oppnå tynne Ben skiver. Den resorpsjon pit analysen har tre faktorer. For å kunne generere en resorpsjon grop i sektorene, må sektorene behandles strengt som beskrevet for magring i protokollen. Dessuten, rotten osteoklaster er aktivert å blankett resorpsjon gropene inne en lett syrlig omgivelsene, og det resorpsjon funksjonen ville i all vesentlighet "nedlegge" når det pH går opp over 7,214,15. Dermed er det bemerkelsesverdig at åpning av inkubator døren ofte under fremdriften av eksperimentene kan føre til forstyrrelser av pH og pCO2 verdier, selv påvirke resorpsjon funksjon av osteoklaster16. Til slutt bør benet skiver forbli på bunnen av brønnene og bør ikke flyttes eller flyte opp når du skifter medium, for å unngå irritasjon.
CTR er et medlem av klasse II gruppe av 7-transmembrane G-protein-sammenkoblede reseptorer som også inneholder parathyroid hormonet og secretin reseptorer17. I tillegg til TRAP farging og resorpsjon pit analysen, osteoklaster identifiseres ved morfologi og funksjon, og CTR-positive identifiserer osteoklaster i immunologi. Nå kan vi også bruke fluorescerende flekker av utgangen ringen og måle pyridinoline krysskoblinger i supernatanten å identifisere osteoklaster.
Selv om ulike forskere har ulike intimitet med eksperimentelle teknikker og den totale mengden av celler i benmargen er sikkert, fikk vi benmargceller på kortere tid, relativt, og til slutt, innhentet store mengder fullt differensiert osteoklaster fra rotte benmargen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81473692) til Yong ma. Forfatterne takker alle ansatte i Medical Research Center i den første College of Clinical Medicine i Nanjing University of Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
