Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier

Published: August 19, 2019 doi: 10.3791/58900
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

Summary

Vi presenterer en fluorescens analysen for å demonstrere at Lucifer Yellow (LY) er en robust markør for å fastslå den tilsynelatende paracellular permeabilitet av hCMEC/D3 celle monolagere, en in vitro modell av den menneskelige blod-hjerne-barriere. Vi brukte denne analysen for å bestemme Kinetics av en confluent monolag formasjon i kultivert hCMEC/D3 celler.

Abstract

Blod-hjerne barriere BBB består av endothelial celler som danner en barriere mellom systemisk sirkulasjon og hjernen for å hindre utveksling av ikke-essensielle ioner og giftige stoffer. Tette veikryss (TJ) effektivt forsegle paracellular plass i monolagere resulterer i en intakt barriere. Denne studien beskriver en LY-basert fluorescens analysen som kan brukes til å bestemme dens åpenbare permeabilitet koeffisient (Papp) og i sin tur kan brukes til å bestemme Kinetics av dannelsen av confluent monolagere og den resulterende stramt veikryss barriere integritet i hCMEC/D3 monolagere. Vi viser ytterligere en ekstra nytte av denne analysen for å fastslå TJ funksjonell integritet i transfekterte celler. Våre data fra LY Papp analysen viser at HCMEC/D3 cellene seeded i en transwell oppsett effektivt begrense ly paracellular transport 7 dager-post kultur. Som en ekstra nytte av den presenterte analysen, viser vi også at DNA nanopartikkel transfeksjoner ikke endrer LY paracellular transport i hCMEC/D3 monolagere.

Introduction

Blood-Brain barriere (BBB) er den beskyttende barriere som begrenser tilstrømningen av plasma komponenter inn i hjernevevet og består av hjerne endothelial celler sammen med støtte celler som pericytes. Den viktigste rollen BBB er å tjene som en barriere som sel mellomrommet mellom perifert blod og sentralnervesystemet (CNS) for å opprettholde hemostase av Neural mikromiljøet1,2. Hjernen kapillær endothelial celler effektivt forsegle paracellular veien via dannelse av intercellulære stramme kryss (TJs)1. Denne beskyttende barriere gjør at glukose og utvalgte næringsstoffer å gå inn i hjernen mens den hindrer flertallet av ioner, giftige stoffer og legemidler fra passerer gjennom denne stramme barriere. Bortsett fra sin beskyttende rolle, den naturlige barrierefunksjon av BBB utgjør en alvorlig utfordring i utviklingen av stoffet leveringssystemer rettet mot CNS.

In vitro cellekultur modeller av BBB er nyttige verktøy for å studere sin biologi og å forstå virkningene av narkotikabehandling på TJ barriere integritet. Vi brukte den menneskelige cerebral mikrovaskulær endothelial cellelinje (hCMEC/D3) som en in vitro-modell siden det er en akseptert modell av menneskelig hjerne endotelet3 og viser mange funksjoner av den menneskelige BBB. hCMEC/D3is en av de mest brukte cellelinjer for modellering av BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Til tross for sin forholdsvis lave verdier av transendothelial elektrisk motstand (frivillig), et mål på barriere tetthet, beholder denne cellelinjen de fleste morfologiske og funksjonelle egenskaper av hjernen endothelial celler, selv som en monokultur i fravær av cocultured gliacellene Cells6,7. Den hCMEC/D3 cellelinjen uttrykker flere BBB markører inkludert aktive transportører og reseptorer til ca passasje 35 uten gjennomgår dedifferentiation til ustabil fenotyper6,7,9 ,10,11. Det mest slående karakteristisk for hCMEC/D3 cellelinje som en in vitro BBB-modellen er dens evne til å danne TJs5,9,11,12. Det bør bemerkes at selv om stammen celle-avledet BBB-modeller viste høyere permeabilitet i mange studier sammenlignet med hCMEC/D3 cellelinje og de gjør uttrykke noen BBB markører, de er ennå å utvikle seg som den vanligste BBB celle modell13. Viktigere, stilk-cellen avledet BBB modeller gjenstår å være preget med hensyn til maksimal passasje tall som tillater cellene å opprettholde stabile BBB fenotyper14.

Tre primære metoder er vanligvis brukes til å bestemme TJ barriere integritet, inkludert måling av frivillig, måling av tilsynelatende permeabilitet koeffisient (Papp) av små hydrofile Tracer molekyler som sukrose, inulin, Lucifer Yellow, etc. og immunostaining av kjente molekylære markører av TJs som claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. FRIVILLIG er en relativt enkel og kvantitativ metode som måler den elektriske motstanden over cellen monolagere kultivert på en porøs membran substrat5. Imidlertid kan frivillig verdier bli påvirket av eksperimentelle variabler som sammensetningen av kulturen medium og type måleinstrument. En sannsynlig kombinasjon av disse faktorene fører til en bred fordeling av frivillig verdier som spenner fra 2 til 1150 Ω cm2 i HCMEC/D3 cellelinjen kultivert for 2-21 dager13. Immunostaining er en visuell metode for å bestemme tilstedeværelsen av TJ proteiner ved å merke det målrettede proteinet ved hjelp av antistoffer. Imidlertid innebærer immunostaining en rekke eksperimentelle trinn, inkludert behovet for å fikse/permeabilize celler som kan resultere i eksperimentelle gjenstander og de fluorescerende signalene kan falme over tid. De ovennevnte faktorene kan føre til subjektive feil som påvirker datakvaliteten.

Hovedfokuset i dette arbeidet er å presentere en LY-basert tilsynelatende permeabilitet analysen bestemme Kinetics av en confluent monolag formasjon i kultivert hCMEC/D3 celler. Selv om andre avanserte in vitro BBB-systemer, slik som co-kultur systemer, mikrovæskebasert systemer, er fysiologisk mer relevant etterligner med betydelig forbedret barrierefunksjon15,16,17, hCMEC/D3 transwell oppsett er en enkel og pålitelig modell for å anslå Kinetics av TJ formasjon og raskt skjermen effekten av ulike legemiddel formuleringer på barrierefunksjon. Generelt er P-app -verdiene konsekvente for ulike hydrofile-oppløsninger i HCMEC/D3-monolagere. For eksempel, de rapporterte Papp verdier for ulike lav molekylær masse oppløsninger (som sukrose, mannitol, ly, etc.) i ulike in vitro BBB-modeller er i rekkefølgen av 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vår eksperimentelle oppsett, hjernen endothelial celler er sådd på en kollagen-belagt mikroporøse membran for celle vedlegg og monolag formasjon for å etterligne in vivo barriere. Den LY lagt i apikale side er ventet å krysse intercellulære stramt veikryss og akkumuleres i basolateral side. Større konsentrasjoner av LY i basolateral side indikerer en umoden, ikke-fullt funksjonell barriere mens lavere konsentrasjoner reflekterer begrenset transport på grunn av tilstedeværelsen av funksjonelle TJs resulterer i en moden barriere.

LY er et hydrofile fargestoff med distinkte eksitasjon/utslipps topper og unngår behovet for å radiolabel Tracer molekyler som sukrose, mannitol eller inulin. Dermed kan fluorescens verdiene av LY brukes til å beregne direkte sin paracellular permeabilitet over BBB-monolagere. Også, sammenlignet med mange kommersielt tilgjengelige fargestoffer som brukes i biomedisinsk felt som lider av små Stokes-Skift som fluorescein21, er Stokes-skiftet i LY ca 108 NM med tilstrekkelig Spectral separasjon, og DERMED gir ly fluorescens data som en robust avlesning for å bestemme paracellular permeabilitet. Vi brukte vestlige blotting som en ortogonale teknikk for å demonstrere endringer i uttrykk for den stramme krysset markør protein, ZO-1, over kultur tid. ZO-1-uttrykket som oppdages via vestlig blotting brukes til å supplere data fra LY P-appen og i kombinasjon disse dataene tyder på at de observerte endringene i ly-p-app -verdier gjenspeiler dannelsen av en monolag med gradvis økning i uttrykk for den stramme krysset markør, ZO-1.

Som påpekt tidligere, er det sentrale fokuset i dette arbeidet å demonstrere en LY-analysen som en enkel teknikk for å overvåke dannelsen av en confluent monolag med funksjonell stramt veikryss. Men for å demonstrere en ekstra nytte av den utviklede analysen, målte vi LY Papp i DNA nanopartikkel-transfekterte HCMEC/D3 monolagere. Nukleinsyre syrer kan bli kondensert inn polyelectrolyte nanopartikler med en diameter på 100-200 NM via elektrostatisk interaksjon mellom positivt ladet grupper av polymerer og negativt ladet fosfat grupper av nukleinsyre syrer22, 23. vi refererer til disse KOMPLEKSER som DNA NANOPARTIKLER (DNA NPs) i vårt arbeid. Mens vår intensjon er å transfect celler og uttrykke ønsket protein, må vi sørge for at barriere egenskapene til hCMEC/D3 monolagere ikke er kompromittert. Våre data tyder på at en standard 4 h luciferase gen transfeksjoner regime ikke målbart endre LY permeabilitet demonstrere nytten av LY Papp analysen for å avgjøre endringer i TJ barriere integritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generelt hCMEC/D3 cellekultur

  1. Gjenoppliving av frosne celler
    Merk: all cellekultur vedlikehold og eksperimenter ble utført i en steril biosafety hette. Kultur Media, kosttilskudd og reagenser ble enten kjøpt som sterile produkter eller sterilisert via filtrering ved hjelp av en 0,22 μm membran filter for å hindre mikrobiell forurensning.
    1. Tilsett 8,5 mL kollagen oppløsning (0,15 mg/mL) i en vev kultur kolbe (75 cm2 vekstområde; referert heretter som T75) og legg den i en inkubator (37 ° c, 5% co2) for 1 h.
    2. Fjern kollagen løsningen og forsiktig vaske flasken med sterilisert fosfat-bufret saltvann (PBS). Tilsett 15 mL komplett vekstmedium til flasken og la i CO2 inkubator i 15 min.
      Merk: den komplette medium (endelig konsentrasjon) inneholdt endothelial Cell vekst basal medium-2 (500 mL) supplert med Foster storfe serum (5%), penicillin-Streptomycin (1%), Hydrocortisone (1,4 μM), syre askorbinsyre (5 μg/mL), kjemisk definerte lipid konsentrat (1/100), HEPES (10 mM) og grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (1 ng/mL).
    3. Flytt en cryovial av frosne hCMEC/D3-celler fra væske nitrogen tanken og Tin hetteglasset raskt i et vannbad på 37 ° c (< 1 min).
    4. Når bare en liten flak av isen er synlig, raskt aspirer og overføre celler til flasken inneholder pre-varmet medium. Rist flasken forsiktig for å tillate blanding av cellene med vekstmedium.
    5. Plasser flasken i inkubator (37 ° c, 5% CO2) og observere cellene under et lys mikroskop etter 2 h for å sikre at cellene er festet.
    6. Når cellene festes til bunnen av kolbe, fjerne den gamle veksten medium og tilsett 10 mL av fersk pre-varmet vekstmedium for å erstatte dimetylsulfoksid i den gamle veksten medium24.
    7. Etter 24 h, sjekk under et lett mikroskop for å observere spindel-formede celler og erstatte den gamle veksten medium med pre-varmet frisk vekstmedium.
  2. Vedlikehold av cellekultur
    1. Etterfylle vekstmedium annenhver dag fram til 100% samløpet. Sjekk cellene under mikroskopet før du fjerner den gamle veksten medium og også etter å legge frisk vekstmedium. Ta ut flasken fra inkubator og undersøke hCMEC/D3 celler under fase kontrast mikroskop for å sikre at de vises sunt.
      Merk: de fleste av cellene skal festes til bunnen av flasken, har en spindel-formet morfologi og ofte, lys refracting rundt sine membraner er også sett. Vekstmedium bør være transparent (ikke-skyet) og rosa-oransje i fargen.
    2. Fjern gammel vekstmedium fra flasken og overføre 10 mL av pre-varmet friskt medium inn i flasken.
      Merk: mediet skal legges til den øverste siden av flasken og ikke direkte på overflaten av cellene for å unngå å påvirke celle vedlegg.
    3. Snu flasken tilbake i horisontal posisjon og forsiktig rock det flere ganger og sjekk hCMEC/D3 celler under mikroskopet før du returnerer flasken til inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    4. Observer cellene under en omvendt lys mikroskop hver gang før og etter håndtering av cellene, både under vanlig kulturarbeid og under eksperimenter. Noter merkbare endringer i celle nummer eller morfologi i laboratorie notatblokken.
  3. Celle passaging
    1. Ruge en ny T75 kolbe med 8,5 mL kollagen løsning for 1 t i inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    2. Fjern kollagen løsningen og forsiktig vaske flasken med sterilisert PBS. Tilsett 10 mL pre-varmet hCMEC/D3 medium til den nye flasken og plasser flasken i inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    3. Ta ut flasken fra inkubator og undersøke hCMEC/D3 celler under en fase kontrast mikroskop for å sjekke om cellene er 100% confluent.
    4. Fjern hCMEC/D3 celle medium fra flasken inneholder celler og vask hCMEC/D3 celler med 10 mL PBS.
      Merk: FBS lagt til vekstmedium inneholder protease hemmere som α1-antitrypsin og α2-macroglobulin. Disse hemmer trypsinization prosessen. Dermed er det viktig å vaske cellene med PBS å fjerne spor av FBS å hindre hemming av trypsinization prosessen.
    5. Tilsett 1 mL 0,25% Trypsin oppløsning som inneholder 0,02% EDTA og trypsinize for 2-5 min i inkubator (37 ° c, 5% CO2) (Trykk på flasken forsiktig på sidene for å hjelpe avløsning).
      Merk: aldri la cellene på Trypsin/EDTA for mer enn 6 min.
    6. Tilsett 10 mL pre-varmet hCMEC/D3 medium for å stoppe trypsinization prosessen og resuspend hCMEC/D3 celle ved pipettering opp og ned flere ganger. Deretter fjerner du hele celle fjæringen fra flasken til et 15 mL rør.
    7. Overfør 1 mL av celle suspensjonen fra 15 mL rør til den nye flasken med pre-varmet friskt medium (splitting celler 1:10) og returnere den nye flasken tilbake til inkubator.
      Merk: før du overfører til den nye flasken, pipette cellen suspensjonen opp og ned flere ganger for å redusere celle konsentrasjon graderinger.

2. celle plating

  1. Plasser vevs kultur innsatser med mikroporøse membraner (pore størrelse: 0,4 μm, materiale: polyetylen polyetylentereftalat (PET)) til en 24-brønn kultur plate.
  2. Tilsett 400 μL av kollagen type i (0,15 mg/mL) i hver vevs kultur sett inn og ruge for 1 time i CO2 inkubator (37 ° c, 5% co2). Rock 24-brønn plate forsiktig for å tillate selv spredning av kollagen løsningen over mikroporøse membranen i vevet kulturen setter inn.
  3. Fjern kollagen løsningen og vask forsiktig mikroporøse membranen med 0,4 mL 1x PBS buffer.
  4. Plate hCMEC/D3 celler med tettheten av 50 000 celler/cm2 i cellen inserts (15 000 celler i 500 μL av medium).
    Merk: for å minimere forskjellene i celle nummer i hver vev kultur sette inn, ble celle fjæringen resuspendert med en 10 mL pipette før du legger til celler til innsatsene.
  5. Plasser 24-brønn plate med vev kultur oppsett i en inkubator (37 ° c, 5% CO2) for å tillate celle vedlegg og spredning.
  6. Ruge platen i 7 dager slik at cellene til å nå 100% confluency. Fjern vekstmedium annenhver dag og overføre 0,5 mL pre-varmet ferske medier i vev kultur inserts.
  7. Gjenta plating prosedyren (trinn 2.2-2.6) på en 12-brønn plate, 48-brønn plate og 96-brønn plate. Bruk den 12-brønn platen for vestlig blotting for å bestemme endringer i ZO-1-uttrykket. Bruk 48-brønn platen til DNA NP-transfeksjoner. Bruk 96 brønn platen for ATP-analysen til å bestemme celle levedyktighet i transfekterte celler.

3. Kinetics av cellevekst.

  1. Seed cellene i en tetthet på 50 000 celle/cm2 i en kollagen-belagt 24-brønn vev kultur plate.
  2. På hver dag av eksperimentet, fjerne vekstmedium og forsiktig vaske cellene to ganger med 500 μL av 1x PBS. Deretter tilsett 30 μL av 0,25% Trypsin løsning som inneholder 0,02% EDTA og la platen i ca 2-5 min i en inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    Merk: gradvis dannelse av confluent monolag kan påvirke omfanget av celle avløsning og det er nødvendig å øke volumene av Trypsin/EDTA som angitt her: 30 μL for 1-5 dager etter seeding, 60 μL for 6-7 dager etter seeding og 100 μL for 8-10 dager etter seeding .
  3. Tilsett enten 470 μL, 440 μL eller 400 μL av vekstmedium basert på volumet av Trypsin/EDTA-løsningen som er lagt til i trinn 3,2 for å forberede 500 μL av celle oppheng i hver brønn.
  4. Suspendere cellene ved pipettering opp og ned i hver brønn flere ganger og observere cellene under et mikroskop for å sikre at alle celler er suspendert i vekstmedium. Hvis noen celler er fortsatt festet til platen bunnen etter pipettering flere ganger, forsiktig skrape cellene ved hjelp av en plast celle skraper for å lette celle avløsning.
  5. Fjern 0,1 mL celle fjæring fra 500 μL celle fjæring i trinn 3,3 og Legg til et 1,5 mL rør. Deretter legger 0,1 mL av 0,4% Trypan blå løsning på cellen suspensjon og bland godt.
  6. Rengjør en hemacytometer med 70% isopropylalkohol alkohol. Tilsett 20 μL av stoffblandingen fra trinn 3,5 på hver side i V-sporet og Finn de 16 rutene under mikroskopet. De 16 rutene er regnet som ett rutenett. Finn to tilfeldige rutenett på hver side av hemacytometer og telle alle levende, ikke-blå celler.
    Merk: celler som dukket opp blå i fargen fra ekskludert fra telling, < 1% av cellene beiset blå på alle tidspunkt poeng.
  7. Beregn celle tettheten (celler/cm2) basert på følgende formler.
    Gjennomsnittlig antall celler/rutenett = Equation 1 (EQ. 1)
    Fortynnings faktor = Equation 2 (EQ. 2)
    Celle tetthet (levedyktige celler/cm2) =
    Equation 3
    (EQ. 3)
    Ligninger 1-3. Levedyktige celler er antall celler som telles i hvert rutenett, antall nett tilsvarer antall nett som ligger under mikroskopet, volum av blanding av celle suspensjon og 0,4% Trypan blå er volumet utarbeidet i trinn 3,5, volum av celle suspensjon fjernet er volumet fjernet fra 500 μL celle suspensjon i trinn 3,5, volumet av celle suspensjon i hver brønn er 500 μL celle suspensjon fra trinn 3,3, vekstområde av vev kultur plate er vekst området av enkelt brønn i 24-brønn plate.

4. Lucifer gul tilsynelatende permeabilitet (LY P app ) analysen

  1. For å avgjøre LY-app på hver dag etter seeding, følger du trinnene som starter 4,3. For fastsettelse av P-appen i transfekterte HCMEC/D3-celler, tilsett 8,3 μL av transfeksjoner formulering (figur 1) blandet med 50 μL av komplett vekstmedium og ruge for 4 h. transfeksjoner formuleringer er beskrevet i avsnitt 5.
  2. Etter 4 h transfeksjoner, vask forsiktig apikale IDen to ganger ved hjelp av sterile 1x PBS buffer for å fjerne eventuelle rester transfeksjoner blanding. Varierende volumer av PBS buffer igjen etter fjerning kan påvirke konsentrasjonen av LY i apikale side. Pass på å sikre at gjenværende PBS buffer i vev kultur inserts er helt fjernet. Forsiktig aspirer rester reagenser og medium for å minimere celle avløsning.
    Merk: dette trinnet er hoppet over når måle hver dag tilsynelatende permeabilitet (Papp) av HCMEC/D3 celler.
  3. Fjern vekst mediet og tilsett 1,5 mL pre-varmet (37 ° c) transport buffer (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mm MgCl2, 1 mm NaH2PO4, 5 mm glukose, pH 7,4) til basolateral side.
    Merk: volumet av transport buffer i alle basolateral rom bør være lik for å sikre nøyaktigheten av permeabilitet koeffisient beregning.
  4. Tilsett 58,3 μL av 20 μM LY-oppløsning på apikale IDen av hver transwell innsats. Spar 50 μL av den 20 μM LY-løsningen for fluorescens målinger. Etter fjerning av resterende PBS buffer fra apikale side helt, legger LY løsning så raskt som mulig for å unngå tørking hCMEC/D3 celler. Sikre nøyaktige volumer av LY-løsningen på apikale IDen.
    Merk: for å minimere forfallet av LY-fluorescens intensitet, bør lys eksponering begrenses. Når LY-pulveret er rekonstituert, skal oppløsningen oppbevares ved 4 ° c, beskyttet mot lys.
  5. Ruge i en roterende plate shaker (37 ° c, 100 RPM) for 60 min. Deretter fjernes 30 μL av LY-prøven fra hvert apikale rom. Deretter overføres 20 μM LY-oppløsning og apikale side prøver til pre-merket rør og fortynne prøven 10-fold ved hjelp av transport buffer.
    Merk: det er nødvendig å fortynne den 20 μM LY lager løsningen og apikale side prøver fordi den høye fluorescens intensiteten av disse prøvene kan potensielt overbelaste og skade fluorescens detektoren til den fluorescens mikroplate leseren.
  6. Fjern 500 μL fra hvert basolateral kammer, og Overfør prøven til rør som er merket med forhånds etiketter.
    Merk: prøver fjernes fra separate transwell ved angitte tidspunkt punkter. Tiden poeng er hver dag post-seeding starter på dag 1 til dag 10.
  7. Forbered en serie LY-standarder for standardkurven (39,00, 78,13 NM, 156,25 NM, 312 NM, 625 NM, 1250 NM, 2500 nM).
  8. Tilsett 100 μL av hver standard (i duplikat), apikale og basolateral prøve til hver brønn i en svart 96-brønn plate (figur 1).
    Merk: sorte plater absorberer lys og reduserer bakgrunns-og fluorescens crossover blant brønner.
  9. Bruk en fluorescens mikroplate-leser (settpunkter: eksitasjon 428 NM, utslipp 536 NM) for å måle LY-fluorescens intensitet for å beregne P-appen. En fluorescens plate leser brukes til denne studien.
  10. Beregn gjenopprettings verdiene for P-appen og% ly som beskrevet i teksten i manuskriptet.
    Formel 4. Formler for beregning av verdier i P-appen .
    Beregn den åpenbare permeabilitet (Papp) koeffisient og% ly utvinning ved hjelp av følgende ligninger. Det bør bemerkes at Papp verdier kan beregnes enten basert på massen25 eller konsentrasjon av ly.
    Equation 4 EllerEquation 5
    VA -volum i apikale rommet
    VB -volum i basolateral rommet
    A-arealet av transwell inn membran (0,3 cm2)
    Ma0 -den første massen i apikale kupé
    ΔMB/Δt-endring av massen over tid i basolateral kupé
    CA0-den opprinnelige konsentrasjonen i apikale kupé
    ΔCB/Δt-endring i konsentrasjon over tid i basolateral kupé.
    Formel 5. Formler for beregning av% ly-gjenoppretting.
    Gjenoppretting (%) = Equation 6
    MAF er massen i apikale-rommet på slutt tidspunktet, mBF er massen i basolateral-rommet på sluttidspunktet, ma0 er den opprinnelige massen i apikale-rommet. 26 note: den første massen er beregnet basert på volumet av den 20 μM ly-løsningen i trinn 4,5. Dette eksperimentet ble alltid gjort ved hjelp av celler under passering nummer 35 og ble gjennomført fire uavhengige ganger.

5. kalsium mangel

  1. Fjern vekstmedium fra transwell inserts og 12-brønn plate og forsiktig vaske apikale side og 12-brønn plate ved hjelp av pre-varmet kalsium-fri medium (minimum Essential medium Eagle spinner (S-MEM) medium) for å fjerne kalsium ioner fra transwell inserts og 12-brønn plate.
  2. Tilsett 500 μL eller 2 mL pre-varmet S-MEM 1xmedium til inserts eller 12-brønn plate og ruge for 24 timer i inkubator (37 ° c, 5% CO2). Etter inkubasjons, Fjern S-MEM 1x medium og vask cellene en gang ved hjelp av forvarmet 1x PBS buffer.
  3. Følg trinn 4.4-4.10 beskrevet i avsnitt 4 for LY-behandling og påfølgende trinn. Følg trinn 8.1.2-8.2.4 som er beskrevet i punkt 8 for vestlig blotting og påfølgende trinn.

6. transfeksjoner

  1. Utarbeidelse av DNA nanopartikler (DNA NPs).
    1. Fortynne lager løsningen av gWIZ-Luc plasmider i 10 mM natrium acetate (NaAc) buffer (pH 5,0) og la DNA-løsningen stå i 10 min ved romtemperatur (RT).
      Merk: DNA-en som inneholder overveiende enkle DNA-molekyler kan fremstilles ved DNA-konsentrasjoner 20-40 μg/mL23. Således må gWIZ-Luc plasmider lagerløsning fortynnes. Den frosne gWIZ-Luc plasmider lager må tint helt på isen for å minimere temperatur stress. Sett den fortynnede DNA-løsningen forsiktig inn i 30 s på en standard stasjonære vortexer satt på knott posisjon 3-5.
    2. Beregn ønsket N/P prosenter, brukes her som en numerisk parameter for å reflektere NP komposisjon.
      Equation 7
      Formel 6. N/P ratio beregning: forholdet mellom føflekker av Amin grupper av kationiske polymerer til de av fosfat grupper av DNA. Massen av kationiske polymerer betyr total veid mengde kationiske polymer; (Masse/charge) kationiske polymerer refererer til Molekylvekten av kationiske polymer (Poly (ethyleneglycol) 5k-Block-polyaspartamide med 48 dietylentriamin side KJEDER (PEG-det)) normalisert til antall belastes primære aminer (48) per kationiske polymer ( mol/mol), denne verdien for vår polymer er 306 da; Masse av DNA betyr total mengde av DNA som brukes i formuleringen oppnådd ved å multiplisere volumet og konsentrasjonen i mg/mL; (Masse/charge) DNA refererer til Molekylvekten av DNA normalisert til antall fosfat gruppe per dobbelt-strandet dna (325 da per nucleobase).
      Merk: DNA-preparat (tabell 1) inneholder formulering oppskriften for de ulike prøvene testet i våre eksperimenter. DNA NP ble utarbeidet ved hjelp av en rask titrering teknikk. Den PEG-det polymer løsningen ble lagt langs veggene i røret mens du holder røret i en horisontal stilling. Da røret ble byttet til en vertikal posisjon, etterfulgt av raskt virvlingen med maksimal hastighet for 10s. DNA-en fikk lov til å stå i 30 minutter på RT før bruk. Regel-of-tommelen for DNA NP dosering er 0,5 μg DNA for ca. 1 cm2 vekst området. Så, for hver transwell inn/hver brønn i en 48-brønn plate/hver brønn i en 96-brønn plate, klargjør du DNA NP på N/P 10 som inneholder 0.157/0,5/0.195 μg/brønn av gWIZ-Luc DNA.
    3. For prøver som inneholder indikert konsentrasjon av Poloksamer P84 (P84), tilsett P84 til DNA NP og Vortex for 5 s. Den endelige konsentrasjonen av P84 i hver prøve er enten 0,01% eller 0,03% vekt.
  2. DNA NP transfeksjoner i en 48 brønn plate oppsett
    1. Seed cellene med tettheten av 50 000 celle/cm2 i en 48 brønn plate og vokse til samløpet i inkubator (37 ° c, 5% co2).
    2. Bland 25 μL av den indikerte prøven (transfeksjoner formulering) og 150 μL av komplett vekstmedium og 175 μL av denne blandingen til hver brønn for hver behandlingsgruppe.
    3. Observer hCMEC/D3 cellene under et mikroskop for å sikre at cellene vises friske og er 100% confluent på tidspunktet for eksperimentet.
    4. Fjern vekst mediet fra brønner og 175 μL transfeksjoner blanding til hver brønn. Deretter ruge platen for 4 timer i inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    5. Etter 4 h, Fjern transfeksjoner blandingen og vask hCMEC/D3 celler med forvarmet sterile 1x PBS buffer.
      Merk: for å minimere utilsiktet avløsning av hCMEC/D3 celler fra platen/sett inn overflaten under vaske trinnene, nøye pipette tilstrekkelig steril PBS langs veggene av brønnene og fjerne eventuelle nanopartikler i den gjenværende kulturen Media.
    6. Forsiktig rock platen et par ganger og nøye aspirer og forkaste PBS vask og tilsett 500 μL av hCMEC/D3 pre-varmet kultur medium.
    7. Mikroskopisk undersøker cellene og registrerer observasjoner på celle morfologi og mulige virkninger av transfeksjoner.
    8. Ruge for 24 timer i 37 ° c cellekultur inkubator for å tillate luciferase produksjon. Etter 24 h, Fjern vekstmedium helt og vask cellene en gang med forvarmet 1x PBS.
    9. Lyse transfekterte celler ved å tilsette 100 μL av iskald luciferase cellekultur lyse 1x reagens per brønn.
    10. For måling av luciferase proteininnhold, tilsett 20 μL av celle lysat og 100 μL av luciferase analysebuffer (20 mM glycylglycine (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 3,5 mm DTT, 0,5 mm ATP, 0,27 mm koenzym A) til et 1,5 ml rør.
    11. Les luminescence av prøven som er beskrevet i trinn 6.2.10 på en Luminometeret med en enkelt automatisk injeksjons-
      Merk: luminescence skal integreres over 10 s før lesing.
    12. Mål den totale mengden av mobilnettet protein i lysat ved hjelp av en bicinchoninic acid analysen (BCA-analysen) Kit ved å følge produsentens protokoll.
    13. Beregn og uttrykk luciferase genuttrykk som relative lys enheter (RLU) per totale cellulære protein.

7. Selvlysende ATP-analysen

  1. Seed cellene med tettheten av 50 000 celle/cm2 i en 96 brønn plate og vokse til samløpet i inkubator (37 ° c, 5% co2).
  2. Transfect cellene med 9,7 μL av transfeksjoner formuleringen (Forberedelses detaljer er i avsnitt 6) og 58,4 μL av komplett vekstmedium for 4 timer.
  3. Fjern den transfeksjoner blandingen og vask cellene forsiktig med forvarmet PBS 1x-buffer to ganger for å fjerne behandlings reagensene helt.
    Merk: ulike volumer av gjenværende buffer kan fortynne reagensene i ATP-analysen til ulik grad og kan påvirke dataene.
  4. Bland 75 μL av fersk forvarmet medium og ATP analysen reagens i en 1:1 fortynning ved hjelp av en flerkanals pipette. Sørg for at væskenivået i alle de flerkanals pipette-tipsene er det samme.
  5. Plasser platen på en nutating shaker i 15 minutter ved romtemperatur. Etter 15 minutter med å legge til reagensene, overfører du 60 μL av hver prøve til en hvit 96-brønn plate.
    Merk: hvite plater er bedre å reflektere output lys enn klare eller svarte plater.
  6. Pop eventuelle luftbobler ved hjelp av en nål før du leser platen. Les platen på en luminometeret med en 1 s integrasjons tid. Les plate innen 20 min etter tilsetning av ATP-analysen reagenser. Timing er avgjørende for sammenligning på tvers av forskjellige plater, fordi luminescence signalet er forbigående med en rask forråtnelse rate.
  7. Beregn prosenten (%) celle levedyktighet ved hjelp av denne formelen: (luminescence av transfekterte celler/luminescence av kontroll, ubehandlede celler) x 100.

8. vestlig blotting for måling av stramt veikryss protein ZO-1

  1. Cellelyse og protein utvinning
    Merk: alle trinnene for protein ekstraksjon fra celler må utføres ved 2-8 ° c.
    1. Seed cellene i en tetthet på 50 000 celle/cm2 i en kollagen-belagt 12-brønn vev kultur plate.
    2. På dag 3, dag 5, dag 7, dag 10 post-seeding og på dag 7 (celler pre-inkubert med kalsium fritt medium), fjerne vekstmedium og forsiktig vaske cellene to ganger med 2 mL iskald 1x PBS. Deretter legger du til 300 μL blanding av iskald 1x RIPA lyse buffer som inneholder 3 μg/mL aprotinin i hver brønn.
      Merk: blandingen skal være fersk laget og holdt på isen. Aprotinin brukes til å hemme proteaser tilstede i lysater fra nedverdigende protein av interesse.
    3. Etter to fryse-tine sykluser (-80 ° c), skrape cellene ved hjelp av en kald plast celle skraper. Samle celle lysater i microfuge rør. Deretter sentrifuger rørene ved 200 x g i 30 min ved 4 ° c.
    4. Samle supernatanten i rene rør og legg dem på is. Mål den totale mengden av mobilnettet protein i lysater ved hjelp av BCA analysen Kit ved å følge produsentens protokoll.
  2. Vestlig blotting for påvisning av stramt veikryss protein ZO-1
    1. Denaturere alikvoter av total homogenater inneholdende 40 μg av total protein med 1x Laemmli buffer ved 95 ° c, 5 min og er gjenstand for elektroforese i en redusert 6-7,5% natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel (SDS-side) (90 V, 10 min gjennom stabling gel, 120 V gjennom løse gels).
      Merk: ved lasting av prøvene eller standarder, må du huske å laste langsomt og forsiktig inn i hvert kjørefelt, være forsiktig med å bryte brønnen i prosessen.
    2. Overfør de separerte proteinene til en nitrocellulose membran med en pH 8,5 overføringsbuffer som inneholder 192 mM Glycine, 25 mM Tris base, 10% metanol og 0,1% SDS (75 V, 110 min. ved romtemperatur).
      Merk: ikke berør membranen. Bruk 70% isopropanol plast tang for å håndtere membranen. For å kunne overføre ZO-1-proteinet (MW 200 kDa) til membranen, bør pH være rundt 8,3-8.5. Hvis overføringsbufferen er mer syrlig enn det, vil ikke overføringen skje. Hvis stigen bandene er synlige fortsatt på gel, ville det være nyttig å øke overføringstiden og SDS konsentrasjon.
    3. Etter vask av membranen ved hjelp av Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% mellom 20 (T-TBS), bruk blokkerende løsning (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris bufret saltvann) for å blokkere membraner for 60 min.
    4. Skjær membranen forsiktig i to strimler. Ruge med to primære antistoffer (ZO-1 monoklonale antistoff, fortynning, 1:900 og glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoff, fortynning, 1:10 000) over natten ved 4 ° c. Deretter ruge ZO-1 og GAPDH membraner med esel anti-mus IgG (fortynning, 1:50000). Etter vask av membraner ved hjelp av T-TBS, bildet membraner i 700 kanal på en 16-bits Imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først bestemte vi effekten av dyrking tid på LY permeabilitet å bestemme den tilsynelatende Kinetics av TJ formasjon. Verdiene fra dag 1 til 10-post seeding er vist i figur 2a. På dag 1, var gjennomsnittlig P-app 4,25 x 10-4 cm/min og litt droppet til 3,32 x 10-4 cm/min på dag 2. Gjennomsnittlig P-app -verdi økte litt til 3,93 x 10-4 cm/min på dag 3 og svingt uten vesentlige endringer før dag 6. Papp verdier betydelig redusert til 2,36 x 10-4 cm/min på dag 7 sammenlignet med dag 1 (P < 0,05) trolig antyder at barrieren ble strammere. Papp verdier stabilisert i området mellom 2,14 x 10-4 og 2,36 x 10-4 cm/min fra dag 7 til dag 10, som antydet barrieren formasjonen var komplett og funksjonell resulterer i redusert ly paracellular transport. Vi beregnet prosentandelen (%) LY på hver dag for å være ca. 80%, en verdi som anses som optimal for pålitelig beregning av Papp Value27 (FiGure 2b). Recovery% er en viktig indeks i LY-analysen. For eksempel, hvis cellene forbrenne mest LY, LY er immobilisert i celler eller holder seg til cellemembranen eller LY forringer under inkubasjons, ville det være unøyaktig å tolke som observert lavt LY signal i basolateral kupé indikerer en stram barriere. Dermed utvinning% gir mer tillit til at vi ikke miste betydelig mengde LY på grunn av en eller flere av de ovennevnte muligheter og gjør det mulig å trygt anslå LY Papp verdier. Som nevnt tidligere i innledningen, indikerer større konsentrasjoner av LY på basolateral IDen en ufullstendig barriere, mens lavere konsentrasjoner reflekterer begrenset transport, noe som tyder på en moden, fullstendig barriere på grunn av tilstedeværelsen av funksjonelle TJs. Vi presenterer også ytterligere bevis ved hjelp av en ortogonale teknikk, vestlig blotting deteksjon av ZO-1-protein (Figur 4), for å bekrefte at de observerte endringene i ly Papp samsvarer med dannelsen av tette veikryss.

Siden transwell setter inn oppsettet ikke tillater å spore endringer i celle tetthet, vi bestemte endringer i celle tetthet ved hjelp av en standard Trypan blå eksklusjon analysen. Vi har derfor bestemt endringene i celle tetthet på en transparent vev kultur plate som lett tillot oss å overvåke cellevekst Kinetics. Økningen i celle tetthet fra 5,5 ± 1,0 x 104 celler/cm2 til 1,9 ± 0,2 x 105 celler/cm2 fra dag 1 til 10-post seeding (Figur 3) var lineær med en regresjon koeffisient på 0,94. Disse dataene tyder også på at de observerte endringene i LY Papp (figur 2a) er et resultat av dannelsen av en confluent monolag over 10-dagers perioden. Vi observerte cellene under en invertert lys mikroskop på hver dag og visuelt dokumentert en gradvis økning i celle tall og monolag formasjon.

Vi brukte vestlige blotting å oppdage endringer i uttrykket av den stramme krysset protein ZO-1 over tid (Figur 4). Endringene i ZO-1-uttrykket brukes til å ortogonalt supplere data fra LYp og sikre at de observerte endringene i ly-app indikerer dannelsen av en stram barriere. ZO-1 band intensitet ble analysert av densitometri og normalisert forhold til uttrykk for et housekeeping gen, GAPDH. De to bandene i figur 3a representerer de to zo-1 isoformene (zo-1 α+ og zo-1 α-)28. Densitometri analyse avslørte at pikselverdien av ZO-1 økte fra dag 3-7 post-seeding, noe som tyder på at TJ protein ZO-1 dannet kontinuerlig fra dag 3-7. Etter kalsium tømming behandling på dag 7 post-seeding, bandet av ZO-1 var nesten undetectable, noe som tyder på at ZO-1 var ute av stand til å danne i fravær av kalsium ioner. Videre, pikselverdien av ZO-1 betydelig redusert på dag 10 post-seeding. Signalet INTENSITET av GAPDH fra dag 3-10 dukket opp var sammenlignbare, bortsett fra på dag 7 da cellene ble behandlet med kalsium-fri medium. En mulig årsak til lavere GAPDH-uttrykk i kalsium-behandlede celler kan skyldes det mindre totale proteinet (28,9 mikrogram totalt protein), igjen, sannsynligvis på grunn av kalsium nedbryting. Samlet, bandet densitometri analysen avdekket en gradvis økning i ZO-1 uttrykk (i forhold til GAPDH) til dag 7 og en nedgang i uttrykket på dag 10 når cellene kultivert i fullstendig vekstmedium. Analysen avslørte også et lavere uttrykk for ZO-1 (i forhold til GAPDH) på dag 7 i celler behandlet med kalsium fritt medium.

Mens fokuset for dette arbeidet er å presentere LY Papp analysen som en metode for å bestemme Kinetics av en monolag formasjon, for å demonstrere en ekstra nytte av den utviklede analysen, bestemte vi om DNA np TRANSFEKSJONER påvirket TJ barriere integritet ved å måle LY Papp gjennom HCMEC/D3 celler 4 h post-Transfeksjoner (figur 5). Vårt DNA som inneholder Poloksamer P84 megle høyt nivå av genuttrykk i den transfect hCMEC/D3 cellelinjen (figur 6a). Spesielt ønsket vi å finne ut om de hydrofobe domenene til Poloksamer P84 i vårt DNA NPs kan forurolige TJ integritet i transfekterte celler. % LY som ble gjenopprettet i hver behandlingsgruppe var ca. 92%, noe som tyder på at de beregnede verdiene i P-appen er pålitelige (figur 5B). Vi bemerket at transfeksjoner prosedyren ved hjelp av ulike formuleringer ikke påvirket LY Papp, i forhold til ikke-transfekterte celler eksponert for ly alene. Ekstracellulære kalsium er en kritisk komponent for vedlikehold av celle-celle veikryss i ulike celletyper29,30,31, inkludert hjernen microvessel endothelial celler. Således, opprettholde celler i kalsium-fri medium (cfm) fører til avbrudd i TJs32,33. Derfor brukte vi celler behandlet med CFM for 24 h som en positiv kontroll.

Våre data viser at LY-app for celle-INKUBERT med cfm var 2 ganger høyere sammenlignet med kontroll celler som inkubert med det vanlige vekst mediet. Dette 100% økning i Papp antyder at cellene hadde mistet sin TJs grunn av tap av kalsium ioner som trengs for dannelsen. Spesielt den faktiske verdien (5,14 x 10-4 cm/min) var litt høyere enn gjennomsnittet Papp verdi fra dag 1-6 innlegg seeding (figur 2) når TJs ennå ikke var fullt dannet. Riktignok ikke signifikant, celler transfekterte med DNA NP inneholder 0,01-0.03% Poloksamer P84 viste en liten økning i LY Papp verdier i forhold til ubehandlet celler opprettholdes i vanlig kultur medium. Denne observasjonen antydet at DNA NP + P84 transfeksjoner hadde ingen signifikant effekt på TJ barriere integritet. Overall, det LY Papp verdier i transfekterte cellene omtrent gjennomsnitt til 2.5 x10-4 cm/min og denne verdien tilsvarte den gjennomsnittlige verdien bemerket i løpet av dagen 7-10 post-seeding (figur 2) når ly Papp var minst, foreslå tilstedeværelsen av funksjonell TJs som effektivt begrenset LY paracellular transport.

Vi presenterer ytterligere transfeksjoner data for å vise at mangelen på endringer i LY Papp (figur 5) er ikke en inconsequential observasjon. Til tross for de høye nivåene av transfeksjoner observert i DNA NPs + P84 gruppen, noterte vi ingen endringer i LY Papp antyder at våre formuleringer ikke forurolige TJ barriere. Den relativt lave transfeksjoner effektivitet i de nakne DNA-behandlede cellene er typisk fordi anioniske natur plasmider DNA (på grunn av fosfat grupper i ryggraden) og dens hydrofile natur grense mobil opptak. DNA kondensert i DNA NP mediert en 50-fold økning i transfeksjoner sammenlignet med nakne pDNA (figur 6). Tilsetting av 0,01% P84 til DNA NP resulterte i en 18-fold økning sammenlignet med DNA NP-Alone (P < 0,01). Øke P84 konsentrasjonen til 0,03 WT.% resulterte i en 30-fold økning sammenlignet med DNA NP-Alone (P < 0,001). Disse resultatene er bemerkelsesverdig gitt at hjernen endothelial celler er en vanskelig-å-transfect celle type.

Vi målte celle levedyktigheten av celler transfekterte under ulike forhold for å bekrefte at transfeksjoner prosedyren ikke forårsaker celle stress. Adenosin trifosfat (ATP) er energi valutaen i livet og reflekterer cellulær metabolske funksjon. Vi brukte en luciferase-basert ATP-analyse der luminescence-verdiene er direkte proporsjonal med ATP-nivåene. Possimo et al. rapporterte at luminescence ATP analysen var et robust mål på metabolsk celle levedyktighet34. Celle levedyktigheten til hCMEC/D3 celler transfekterte av de ulike formuleringer var sammenlignbare med ubehandlede celler (figur 5B), noe som tyder på at ATP nivåene var like også. Derfor er DNA NPs inneholder Poloksamer P84 (0,01% til 0,03% w/w) er trygge gen levering formuleringer.

Figure 1
Figur 1 . Eksperimentell oppsett for ly P app studium. 24-brønn plate oppsett som inneholder transwell innsatser (tilpasset for å vise DNA-nanopartikkel transfeksjoner som et eksempel, data i figur 5). Hver kolonne ble behandlet med den indikerte prøven for 4 h. kontroll indikerer hCMEC/D3 celler behandlet med komplett vekstmedium mens kalsium tømming 24 h indikerer at cellene ble inkubert med kalsium fritt medium før LY eksponering. Den riktige malen viser LY fluorescens intensitet måling i en svart 96-brønn plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Tilsynelatende Kinetics av TJ barriere formasjon bestemmes ved hjelp av ly P app analysen. (a) ly app gjennom HCMEC/D3 monolagere kultivert på transwell inserts ble målt hverdags post-seeding celler. (b)% ly utvinnes i hver behandlingsgruppe. Data representerer gjennomsnittlig ± SD av to uavhengige eksperimenter (n = 3/eksperiment). Statistiske sammenligninger ble gjort ved hjelp av ikke-sammenkoblet t-test (*P< 0,05, N.S. ikke signifikant). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 . Kinetics av cellevekst bestemmes ved hjelp av en Trypan blå eksklusjon analysen. hCMEC/D3 celler ble sådd i en 24-brønn plate i en celle tetthet av 50 000 celler/cm2. På hver dag av eksperimentet, celler ble dissosiert og blandet med et likt volum på 0,4% Trypan blå før telling levedyktige celler på en hemacytometer. Data representerer gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige målinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Tilsynelatende Kinetics av zo-1-uttrykket oppdaget ved hjelp av vestlig blotting. (a) HCMEC/D3 celler ble sådd i en 12-brønn plate i en celle tetthet på 50 000 celler/cm2. På hver dag av eksperimentet (dag 3, dag 5, dag 7 og dag 10-post seeding), ble celler lysert av 400 μL av 1x RIPA buffer som inneholder 3 μg/mL aprotinin. Celle lysater inneholdende 40 μg av totalt protein ble lastet på en 4-7,5% SDS-polyakrylamid gel. (b) band densitometri analyse tillot normalisering uttrykk for zo-1 PROTEIN til GAPDH. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 . Effekter av DNA np transfeksjoner på TJ barriere tetthet målt ved hjelp av ly P app analysen. (a) HCMEC/D3 celler var kultivert på transwell inserts i 7 dager, TRANSFEKTERTE med Peg-det inneholder GWIZLUC plasmider DNA med/uten Pluronic P84 for 4 h og deretter erstattet med pre-varmet transport buffer som inneholder 50 μM ly for 1 t. kontroll representerer hCMEC/D3 cellene inkubert med vekstmedium for 4 h etterfulgt av LY eksponering (n = 4, *P< 0,05, N.S. ikke signifikant). (b)% ly utvinnes i hver behandlingsgruppe, verdier som presenteres er gjennomsnittlig ± SD (n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 6
Figur 6 . DNA NPs megle høye nivåer av transgene uttrykk i hCMEC/D3 monolagere. (a) HCMEC/D3 celler ble kultivert 7 dager og TRANSFEKTERTE med Peg-det inneholder GWIZLUC plasmider DNA med/uten Pluronic P84 (N/P 10, DNA dose per brønn: 0,5 μg) for 4 h, transfeksjoner blandingen ble fjernet og celler ble kultivert for 24 h i fullstendig vekst medium før måling av genuttrykk. Nivåer av luciferase genuttrykk ble uttrykt som relative lys enheter (RLU) nornalized til total Cellular proteininnhold. Data presenterer gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble gjort ved hjelp av ikke-sammenkoblet t-test (* * p< 0,01, * * * p< 0,001). (b) DNA NPs er trygge transfeksjoner formuleringer i HCMEC/D3 monolagere. Effekter av DNA-DNA NP transfeksjoner på celle levedyktighet ble evaluert ved hjelp av en selvlysende ATP-analysen. hCMEC/D3 celler ble transfekterte med indikerte prøvene for 4 h følgende som ATP analysen ble gjennomført ved å følge produsentens protokoll. Prosent (%) celle levedyktighet ble beregnet som følger: (luminescence av transfekterte celler/luminescence av kontroll, ubehandlede celler) x100. Data representerer gjennomsnittlig ± SD av to uavhengige eksperimenter (n = 3/eksperiment). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksperimentell oppsett Eksempel på navn Volum av 1mg/mL plasmider DNA (μL) Volum på 10 mM NaAc buffer, pH 5 (μL) Volum på 5 mg/mL polymer (μL) Volum på 10% w/w. P84 (μL) Volum av vekstmedium (μL)
Tissue kultur setter innen Kontroll, ubehandlede celler 0 0 0 0 58,3
Naken DNA 0,157 8,143 50
DNA NP 7,843 0,3
DNA NP + 0,01% P84 7,6681 0,1749
DNA NP + 0.03% P84 7,26 0,0583
48-brønn plate Kontroll, ubehandlede celler 0 0 0 0 175
Naken DNA 0,5 24,5 150
DNA NP 23,56 0,94
DNA NP + 0,01% P84 23,385 0,175
DNA NP + 0.03% P84 23,035 0,525
96-brønn plate Kontroll, ubehandlede celler 0 0 0 0 68,1
Naken DNA 0,195 58,4
DNA NP 9,35 0,37
DNA NP + 0,01% P84 8,9307 0,0681
DNA NP + 0.03% P84 9,0669 0,2043

Tabell 1. NP formuleringer som brukes for innhenting av data rapportert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nøkkelrolle BBB er å hindre utveksling av ikke-essensielle ioner og giftige stoffer mellom systemisk sirkulasjon og hjernen for å opprettholde hemostase av nevrale mikromiljøet. En av de karakteristiske trekk ved BBB er evnen til kapillær endothelial cellene til å danne tette veikryss (TJs) som effektivt forsegle paracellular ruten for transport. Vi demonstrerte en LY Papp analysen som en kvantitativ metode for å fastslå den tilsynelatende KINETICS av TJ barriere formasjon i kultivert HCMEC/D3 monolagere. ZO-1-uttrykket oppdaget via Western blotting ortogonalt validerte dataene fra LY-app -studiene som beskrevet i detalj i følgende avsnitt. Som en ekstra nytte av den utviklede analysen, vi videre demonstrert at DNA NP transfeksjoner ikke målbart endre LY Papp indikerer egnetheten av denne analysen for å avgjøre endringer i TJ barriereegenskaper i en eksperimentell oppsett.

Western Blot data avdekket en klar økning i ZO-1 uttrykk på dager 3, 5, 7-post seeding og en liten reduksjon på dag 10-post seeding (figur 4a). Fra figur 1, kan det ses at lyapp redusert fra dag 1-7 etter seeding antyder dannelsen av TJs. Etter behandling av kalsium mangel, viste LY Papp en markert økning (figur 2a) mens zo-1-uttrykket viste markert reduksjon (figur 4a). Ekstracellulære kalsium er en kritisk komponent for vedlikehold av celle-celle veikryss i ulike celletyper29,30,31, inkludert hjernen microvessel endothelial celler. Mangel på kalsium i vekstmedium forstyrret og dissosiert den TJs33. Som forventet var Papp -verdien av kalsium-utarmet celler signifikant høyere enn ubehandlet celler og i nærheten av Papp verdien av tomme innsatser som ikke inneholder noen celler (figur 2a). LY avdekket en jevn platå i Papp verdier fra dag 7-10 post-seeding (figur 2a) antyder at barrieren hadde fullt dannet av dag 7 som resulterte i begrenset ly transport til basolateral side. Western Blot data viste en liten nedgang i ZO-1 uttrykk på dag 10 sammenlignet med dag 7-post seeding. Denne forskjellen i observasjon er sannsynligvis på grunn av bidrag fra andre ekstracellulære proteiner, bortsett fra ZO-1, i å opprettholde barriere tetthet. Oppsummert har vi med hell brukt data fra to ortogonale teknikker for å bestemme Kinetics av stramme knutepunkt barriere formasjon i en menneskelig celle modell av BBB. Mens LY-app -analysen målte funksjonaliteten til TJ-barrieren, sporet Western Blot-dataene dannelsen av TJs ved hjelp av zo-1 som markør protein.

Som en ekstra nytte av den utviklede analysen, bekreftet vi at DNA NP transfeksjoner i hCMEC/D3 monolagere påvirker ikke integriteten til TJs (figur 5). Ubehandlede celler inkubert med vekstmedium ble brukt som negativ kontroll og celler pre-inkubert med kalsium fritt medium for 24 h ble brukt som en positiv kontroll. Celler der TJs ble forstyrret som følge av kalsium-reduksjonen viste en 210% økning i LY Papp sammenlignet med ubehandlede celler. Våre data tyder på at DNA NP transfeksjoner enten i nærvær eller fravær av P84 påvirker ikke TJ integritet. Det bør bemerkes at mangelen på LY Papp endringer i transfekterte celler er ikke en inconsequential observasjon. Faktisk, vår DNA NPs megle betydelige nivåer av genet uttrykk i den vanskelige å transfect hCMEC/D3 monolagere9,35,36,37. DNA NPs inneholder 0,01 eller 0,03 WT.% P84 økt luciferase genuttrykk ved ca. 18-og 30-fold, sammenlignet med bare DNA NPs (figur 6a). Vi viste også at våre NP-behandlinger ikke har negativ innvirkning på de cellulære ATP-nivåene, brukt her som en indikator på funksjonell celle levedyktighet (figur 6b). Våre resultater understreker utvidet nytte av denne LY Papp analysen for å bestemme TJ barriere integritet i en eksperimentell transfeksjoner oppsett.

Et kritisk skritt i utførelsen av LY-analysen er å holde samme mengde LY i apikale side og lik volum av transport buffer i basolateral side over de ulike tids punktene i hele eksperimentet. Hvis ulike mengder LY eller ulike volumer av transport buffer ble brukt i brønner, ville beregningen av Papp være upålitelig, noe som resulterer i kunstig store standardavvik. Et annet viktig aspekt er å begrense lys eksponering for å minimere forfallet av LY fluorescens intensitet. Væsken må også fjernes helt før du legger til nøyaktig samme volum av LY-løsning og transport buffer i apikale side og basolateral side, henholdsvis. Dette sikrer at fluorescens avlesning kan være pålitelig brukes til Papp beregning. Et annet kritisk skritt i dette eksperimentet er å umiddelbart måle LY fluorescens av basolateral prøvene og unngå behovet for å fryse prøvene etter samlingen. Utsette det LY-inneholder prøvene å fryse-tine sykluser resulterer i en større intra-Group variasjon av fluorescens signalet. Ettall begrensningen av benytter det transwell setup er det alt det bo celler er vanskelig å bli visualisere av tradisjonell mikroskopi eller avbildning av konfokalmikroskopi mikroskopi. Videre er det ikke lett å oversette til et oppsett som gjør at co-dyrking forskjellige celletyper mindre blandet dyrking av si, gliacellene og endothelial celler er en mulighet. Ikke desto mindre har LY-analysen følgende fordeler: LY er et fargestoff med distinkte eksitasjon/utslipps topper og et relativt stort Stokes-skifte sammenlignet med fargestoffer som natrium fluorescein, noe som gir en robust måling av sonden som krysser BBB og unngår behovet for ytterligere radiolabel som i tilfelle av Bevegelsesuskarphet som sukrose eller mannitol. Høy utvinning% s av LY gir pålitelige data for å trygt beregne Papp verdier.

Basert på våre funn, konkluderer vi at LY Papp metoden er en enkel og robust analysen for å kvantifisere paracellular permeabilitet over HCMEC/D3 celle monolagere. Ved å bruke LY Papp metoden, optimaliserte vi kulturen tid for dannelsen av intakt barriere, og vi demonstrerte en ekstra nytte av den utviklede analysen ved å bestemme TJ INTEGRITET i DNA np-transfekterte celle monolagere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for finansiell støtte fra 2017 New etterforsker Award fra American Association of Pharmacy, en Hunkele fryktede Disease Award fra Duquesne University og School of Pharmacy oppstart midler for Manickam laboratoriet. Vi vil gjerne takke lekkasjen laboratoriet (Duquesne University) for vestlig blotting assistanse og tillater bruk av deres Odyssey 16-bits Imager. Vi vil også gjerne inkludere et spesielt notat av takknemlighet for kandarp Dave (Manickam laboratorium) for hjelp med vestlige blotting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. , Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).

Tags

Bioteknologi Lucifer gul paracellular permeabilitet blod-hjerne barriere hCMEC/D3 DNA nanopartikler transfeksjoner.
Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y.,… More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter