Här presenterar vi ett stegvis protokoll för att undersöka den mitokondriella respiration och glycolytic funktion i Candida Albicans använder en extra flux analysator.
Mitokondrierna är väsentliga organeller för cellulär metabolism och överlevnad. En mängd viktiga händelser sker i mitokondrierna, såsom cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos. Mitokondriell dysfunktion rapporteras därför spela en viktig roll i svampdödande läkemedel tolerans och virulens sjukdomsalstrande svampar. Senaste data har också lett till ett erkännande av betydelsen av mitokondrierna som en viktig bidragsgivare till svamp patogenes. Trots betydelsen av mitokondrierna i svamp biologi, är standardiserade metoder för att förstå dess funktion dåligt utvecklade. Här presenterar vi ett förfarande för att studera basala syre materialåtgången (OCR), ett mått på mitokondriell respiration och extracellulära försurning priser (ECAR), ett mått på glycolytic funktion i C. albicans stammar. Den metod som beskrivs häri kan tillämpas på någon Candidaspp. stammar utan att behöva rena mitokondrier från intakt svamp cellerna. Dessutom detta protokoll kan också anpassas till skärmen för hämmare av mitokondriell funktion i C. albicans stammar.
Invasiva svampinfektioner döda över 1,5 miljoner människor per år i hela världen. Detta nummer är på uppgång på grund av en ökning i antalet personer som lever med nedsatt immunitet, inklusive äldre, prematura spädbarn, transplantation mottagare och cancer patienter1. C. albicans är en opportunistisk mänsklig svamp patogener som är en del av den mänskliga mikrofloran. Den lever också slemhinnor och mag-tarmkanalen som kommensaler organism. C. albicans producerar allvarliga systemisk sjukdom hos personer som har immunbrister, som har genomgått en operation, eller som har behandlats med långa kurser av antibiotika. Candida arter rang bland topp tre till fyra orsakar av nosokomiala infektionssjukdomar (NID) i människor2,3,4,5,6,7. Av Candida infektioner blodomloppet årliga antalet uppskattas vara ~ 400 000 fall, med tillhörande mortaliteten 46-75%1. Den årliga dödligheten på grund av candidiasis är ungefär 10 000 i USA ensam. Omfattningen av NID orsakade av svamp återspeglas också i astronomiska patientens kostnader5. I USA överträffar den årliga kostnaden för behandling av invasiva svampinfektioner 2 miljarder dollar, att lägga till en enorm påfrestning för redan överbelastade hälso-och sjukvården. För närvarande är tillgängliga standard antimykotiska behandlingar begränsad på grund av toxicitet, allt vanligare läkemedelsresistens och läkemedelsinteraktioner. Därför finns det ett brådskande behov att identifiera nya svampdödande målmolekyler som resulterar i bättre behandlingsalternativ för patienter med hög risk. Upptäckten av nya läkemedel som agerar på svamp mål är emellertid komplicerat eftersom svampar är eukaryota organismer. Detta begränsar kraftigt antalet svamp-specifika målmolekyler.
Nyligen genomförda studier har visat att mitokondrierna är en viktig bidragsgivare till svamp virulens och tolerans mot svampdödande läkemedel eftersom mitokondrierna är viktiga för cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos8 ,9,10,11. Glycolytic såväl som icke-glycolytic metabolism är avgörande för överlevnaden av C. albicans i däggdjur värd12,13,14,15,16. Dessutom har flera C. albicans mutanter saknar mitokondrie proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. visat sig vara defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Dessutom dessa mutanter visades också att mildras för virulens i en musmodell av disseminerad candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Sålunda, svamp mitokondrier representerar ett attraktivt mål för läkemedelsutveckling. Studien av mitokondriell funktion i C. albicans är dock en utmaning eftersom C. albicans är petite negativa23, vilket innebär att det inte kan överleva utan det mitokondriella genomet.
Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att undersöka mitokondrie och glycolytic funktion i C. albicans utan att behöva rena mitokondrier. Denna metod kan också optimeras för att undersöka effekten av genetisk manipulation eller kemiska modulatorer på mitokondriella och glycolytic vägar i C. albicans.
Bioenergetik extra flux assay fungerar som ett utmärkt verktyg att läsa ut mitokondriefunktion genom att mäta oxidativ fosforylering (OXPHOS)-beroende syreförbrukning i realtid. Dessutom kan en glycolytic funktion som är mätt som årstakt extracellulära försurning (förändring av extracellulära pH) också undersökas samtidigt i realtid analys.
Framgångsrika plätering av C. albicans i assay plattan är en av de kritiska steg i analysen eftersom inkubering av cellerna i PDL…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i NC lab stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01AI24499 och en New Jersey Health Foundation (NJHF) grant, #PC40-18.
RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
KCN | |||
Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
pH meter | Accumet | AR20 | |
Phenol red | Sigma | P5530 | |
Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
SHAM | |||
Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |