Summary

Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis

Published: March 19, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.

Abstract

Las mitocondrias son organelos esenciales para el metabolismo celular y la supervivencia. Una variedad de eventos clave llevará a cabo en la mitocondria, como la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis. En consecuencia, la disfunción mitocondrial se divulga a jugar un papel importante en la tolerancia de antimicóticos y la virulencia de hongos patógenos. Datos recientes también han contribuido al reconocimiento de la importancia de la mitocondria como un contribuyente importante para la patogénesis fúngica. A pesar de la importancia de la mitocondria en biología fúngica, métodos estandarizados para entender su función están poco desarrollados. Aquí, presentamos un procedimiento para estudiar la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), una medida de la respiración mitocondrial y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), una medida de la función glucolisis en cepas de C. albicans . El método descrito en este documento puede aplicarse a cualquier Candidaspp. cepas sin la necesidad de purificar las mitocondrias de las células fúngicas intactas. Además, este protocolo puede también ser modificado para requisitos particulares para detectar inhibidores de la función mitocondrial en cepas de C. albicans .

Introduction

Las infecciones fúngicas invasivas mata a más 1,5 millones de personas al año en todo el mundo. Este número va en aumento debido a un aumento en el número de personas con inmunidad comprometida, incluyendo los bebés prematuros, ancianos, trasplantados y cáncer pacientes1. C. albicans es un hongo patógeno humano oportunista que es una parte de la microflora humana. También habita las superficies mucosas y el tracto gastrointestinal como un organismo comensal. C. albicans produce enfermedad sistémica seria en personas con inmunodeficiencias, que han sometido a cirugía o que han sido tratados con cursos largos de antibióticos. El rango de especies de Candida entre las causas de la tapa tres de las enfermedades infecciosas nosocomiales (NID) en los seres humanos2,3,4,5,6,7. Se estima el número global de infecciones de la sangre de Candida ~ 400.000 casos, con mortalidad asociada de 46-75%1. La mortalidad anual a causa de la candidiasis es de aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos. El grado de NID causada por hongos también se refleja en gastos astronómicos de paciente5. En los Estados Unidos, el gasto anual para el tratamiento de las infecciones fúngicas invasivas supera los $ 2 billones, añadiendo una gran tensión al sistema de salud ya sobrecargado. En la actualidad, terapias antihongos estándar disponibles son limitadas debido a toxicidad, resistencia a los medicamentos cada vez más frecuentes y las interacciones de fármacos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas dianas de antimicóticos que se traducirá en mejores opciones de tratamiento para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos fármacos que actúan sobre dianas fúngicas es complicado porque los hongos son eucariotas. Grandemente, esto limita el número de dianas farmacológicas de fungicidas específicos.

Estudios recientes han indicado que las mitocondrias son un contribuyente fundamental a la virulencia de hongos y la tolerancia a drogas antihongos ya que las mitocondrias son importantes para la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico y no glucolisis son esenciales para la supervivencia de C. albicans en el huésped mamífero12,13,14,15,16. Además, varios mutantes de C. albicans que carece de proteínas mitocondriales, como la Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. han demostrado ser defectuoso en la filamentación, un factor importante de virulencia de C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Además, estos mutantes también fueron demostrados para ser atenuada para difusión de virulencia en un modelo murino de candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Así, las mitocondrias hongos representan un atractivo destino para el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, el estudio de la función mitocondrial en C. albicans es difícil debido a que C. albicans es petite negativa23, que significa que no puede sobrevivir sin el genoma mitocondrial.

Aquí, describimos un protocolo que puede utilizarse para investigar la función mitocondrial y glucolisis en C. albicans sin necesidad de purificar las mitocondrias. Este método también se puede optimizar para investigar el efecto de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolisis en C. albicans.

Protocol

Nota: El protocolo paso a paso detallado del análisis se describe a continuación, y el protocolo esquemático se muestra en la figura 1. 1. las cepas de C. albicans y condiciones de crecimiento Crecen las cepas de C. albicans en medio líquido de la dextrosa-peptona-Extracto de levadura (YPD) a 30 °C en un agitador incubador durante la noche.Nota: Mantener cepas de Candida como acción congelada y crecen en agar…

Representative Results

El objetivo de este protocolo es determinar las funciones bioenergéticas de C. albicans por analizador de flujo adicional. Un mutante de C. albicans que carece de proteína mitocondrial Mam33 también está incluido junto con su variedad de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para el estudio de los efectos de la eliminación de una proteína mitocondrial en OCR y ECAR. MAM33 codifica para una proteína supuesta matriz mitocondrial de ácidos y su función e…

Discussion

La bioenergética análisis de flujo extra sirven como una excelente herramienta para leer la función mitocondrial mediante la medición de fosforilación oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxígeno dependiente en tiempo real. Además, una función de glucolisis que es medida como una tasa de acidificación extracelular (cambio en el pH extracelular) también se puede investigar al mismo tiempo en el análisis en tiempo real.

Exitosa siembra de C. albicans en la placa de ensayo es uno de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Investigación en laboratorio de NC es apoyada por una subvención de los institutos nacionales de salud (NIH) R01AI24499 y una beca de la Fundación de salud de Nueva Jersey (NJHF), #PC40-18.

Materials

RPMI 1640 Corning MT50020PB
Antimycin A Sigma A8674
KCN
Mito stress kit Agilent 103015-100
Oligomycin Calbiochem 495455
pH meter Accumet AR20
Phenol red Sigma P5530
Poly-D lysine Sigma P6407
Rotenone Santa cruz 203242
Seahorse XF24 FluxPak Agilent 100850-001
SHAM
Sodium Chloride Amresco  241
Sodium hydroxie pellets J.T Baker 3722
Tissue culture grade water Gibco 1523-0147
XF assay calibrant solution Agilent 100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose Fisher scientific, BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar Sigma A1296
Yeast extract Peptone Glycerol Sigma G2025

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Cite This Article
Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki, C., Chauhan, N. Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58913, doi:10.3791/58913 (2019).

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