Summary

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Published: March 19, 2019
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

Abstract

As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .

Introduction

Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer1. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%1. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente5. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.

Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero12,13,14,15,16. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase17,18,19,20,21 ,22. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo23, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.

Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.

Protocol

Nota: O protocolo detalhado passo a passo do ensaio é descrito abaixo, e o protocolo esquemático é mostrado na Figura 1. 1. cepas de c. albicans e condições de crescimento Crescem as cepas de c. albicans em meio de levedura extrato-peptona-Dextrose (YPD) líquido a 30 °C em um shaker incubadora durante a noite.Nota: Manter cepas de Candida como estoques congelados e crescem em ágar YPD (extrato de levedura 1…

Representative Results

O foco do presente protocolo é para determinar as funções bioenergética de c. albicans avaliados pelo analisador de fluxo extra. Um mutante de c. albicans , falta proteína mitocondrial Mam33 também está incluído, juntamente com a sua estirpe de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial em OCR e ECAR. MAM33 codifica para uma proteína putativa matriz mitocondrial de ácidos e sua função na…

Discussion

A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.

Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Pesquisa no laboratório de NC é suportada por uma concessão do National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e uma bolsa da Fundação de saúde de Nova Jersey (NJHF), #PC40-18.

Materials

RPMI 1640 Corning MT50020PB
Antimycin A Sigma A8674
KCN
Mito stress kit Agilent 103015-100
Oligomycin Calbiochem 495455
pH meter Accumet AR20
Phenol red Sigma P5530
Poly-D lysine Sigma P6407
Rotenone Santa cruz 203242
Seahorse XF24 FluxPak Agilent 100850-001
SHAM
Sodium Chloride Amresco  241
Sodium hydroxie pellets J.T Baker 3722
Tissue culture grade water Gibco 1523-0147
XF assay calibrant solution Agilent 100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose Fisher scientific, BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar Sigma A1296
Yeast extract Peptone Glycerol Sigma G2025

References

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Play Video

Cite This Article
Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki, C., Chauhan, N. Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58913, doi:10.3791/58913 (2019).

View Video