Summary
ここでは、余分なフラックス アナライザーを使用してミトコンドリア呼吸とカンジダで解糖系の機能を調査するための段階的なプロトコルを提示します。
Abstract
ミトコンドリアは、細胞の代謝と生存の重要な細胞内小器官です。ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシスなどのさまざまな主要なイベントが起こる。その結果、ミトコンドリア機能障害とされる抗真菌薬耐性と病原菌の病原性に重要な役割を果たします。最近のデータは真菌の病原性に重要な貢献としてミトコンドリアの重要性の認識にもつながっています。真菌の生物学におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらずその機能を理解する標準化された方法の発達は悪い。基底酸素消費量 (OCR) ミトコンドリア呼吸の測定と細胞の酸性化率 (ecar と)、 C. albicans系統における解糖系機能の測定を研究するための手順を紹介します。記載方法は、そのまま真菌細胞からミトコンドリアを浄化することがなく任意のサーベイランス。系統に適用できます。さらに、このプロトコルをカスタマイズすることができますc. アルビカンス菌のミトコンドリア機能阻害剤の画面に。
Introduction
侵襲性真菌感染症は、世界中で毎年以上 150 万人を殺します。この番号は、侵害された免疫は、高齢者、未熟児、移植、癌患者1などとともに生きる人々 の数の増加による上昇には。C. アルビカンスは人間の細菌叢の一部である日和見人間真菌の菌です。また、粘膜の表面や消化管が共生生物として生息します。C. アルビカンスは、免疫不全症、手術を受けている人や長期の抗生物質のコースと扱われている人を持っている人に深刻な全身疾患を生成します。院内感染症 (NID) 人間2,3,4,5,6、7のトップ 3 〜 4 原因のうちカンジダ種のランク。カンジダ血流感染症の年間の世界的な数は、~ 400,000 症例 46 751の関連付けられている死亡すると推定されます。カンジダ症のための年間死亡率はほぼ単独で米国で 10,000 です。菌類が原因で NID の程度も、天文学的な患者費用5に反映されます。アメリカ合衆国では、侵襲性真菌感染症の治療のための年次費用は $ 20 億、すでに負担医療システムに大きな負担を追加するを上回っています。現在、利用可能な標準的抗真菌治療は毒性、ますます普及している薬剤耐性、および薬物-薬物相互作用により制限されています。したがって、ハイリスク患者に対するより良い治療の選択肢になります新しい抗真菌薬のターゲットを識別するために緊急の必要性があります。しかし、菌は真核生物であるために、真菌ターゲットに作用する新薬の発見は複雑です。これは大きく真菌特定薬剤ターゲットの数を制限します。
最近の研究は、ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシス8 の重要なので、ミトコンドリアが耐性抗真菌薬と真菌の病原性に重要な貢献こと示されています。 ,9,10,11。解糖系と非解糖系代謝は、哺乳類のホスト12,13,14,,1516 C. albicansの生存に不可欠です。さらに、Goa1 などのミトコンドリア蛋白質に欠けているいくつかのc. アルビカンス変異 Srr1 Gem1 Sam37 等が示されている粘い、 C. albicans17,の重要な病原因子の欠陥18,19,20,21,22しますさらに、これらの変異体も示したマウス モデルにおける病原性播種性カンジダ症17,18,19,20,21 の減衰させる。 ,22。つまり、菌のミトコンドリアは、創薬のための魅力的なターゲットを表します。ただし、 C. albicansは小柄な負23、それがミトコンドリアのゲノムことがなく生き残ることはできませんを意味するためにC. albicansのミトコンドリア機能に関する研究が困難します。
ここでは、ミトコンドリアを浄化するために必要とせずC. albicansのミトコンドリアと解糖系の機能を調査するために使用することができますプロトコルについて述べる。このメソッドは、 C. albicansのミトコンドリアと解糖系の経路の遺伝的操作や化学物質の変調器の効果を調べるためも最適化することができます。
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Protocol
注: は、アッセイの詳細な段階的なプロトコルには、以下、スケマティック プロトコルは図 1に示します。
1 C. albicans菌株と成長条件。
- 一晩 30 °C インキュベーター シェーカーで液体酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) 媒体のc. アルビカンス菌を育てます。
注: 凍結する在庫としてカンジダ菌を維持し、YPD 寒天 (酵母エキス 1%、2% ペプトン、2% ブドウ糖と 2% 寒天培地) で育ちます。
2. 試薬の調製
- 次のとおりアッセイ培地を準備します。
- ミトコンドリア機能の試金のため溶解 1.04 g ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 パウダーと 2 グラムのブドウ糖 (2%)90 mL の滅菌水と暖かい 37 ° c. にメディアで5 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整し、滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。
- 解糖系のストレス分析のため 1.04 g RPMI 1640 パウダーだけでは 90 mL の滅菌水に溶解、37 ° C にメディアを暖かく、pH 7.4 に調整。滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。RPMI 1640 粉末は、アッセイの中に解糖作用の指標として pH 変化を監視する重要な炭酸を持ちません。
- インジェクションの化合物。
- 滅菌水、-20 ° C で店で 1 M グルコース ストックを準備します。
- ジメチルスルホキシド (DMSO)、小さなボリュームで分注のオリゴマイシン株式 100 mM を準備し、-20 ° C で保存
- DMSO、小さなボリュームで割り切れるで 100 mM アンチマイシン A 株式を準備し、-20 ° C で保存
- アッセイの日に 100 mM のエタノールにシャム (サリチルヒドロキサム酸) 株式を準備します。
- アッセイの当日 1 M 滅菌水で KCN を準備します。
3 アッセイ プレートのコーティング、ポリ-D-リジン (PDL) と
メモ: 実行すべて、層流フードの手順以下。
- 50 μ G/ml の最終的な集中させる組織培養グレードの水にポリ D リジンを溶解します。よく、分注 1.5 mL 遠心チューブに混ぜるし、長期的に-20 ° C で保存します。
注: 50 μ L/ウェルが必要であり、24 ウェル ・ 1.2 mL 必要です。したがって、因数少なくとも 1.3 mL 遠心チューブ/。 - ウェルあたり 50 μ L を追加し、1-2 h 対応ふた付け室温で孵化させなさい。
- ソリューションを吸引し、500 μ L 滅菌組織培養グレードの水との 1 時間をすすいでください。
- 蓋を開き、乾燥空気に井戸を許可します。2-3 日間の最大値の同じ日または 4 ° C でストアにプレートを使用します。
4. センサー カートリッジの水和
注: は、1 日、実験の前にこの手順を実行します。
- 余分なフラックス測定キットを開き、内容を削除します。逆さまユーティリティ プレート (図 2) の横にあるセンサー カートリッジを配置します。
- 塗りつぶしの各 1 ml calibrant のユーティリティ板のよく、バック センサー カートリッジを配置します。(酸素と pH を測定) に蛍光物質を含んだセンサーは、calibrant に沈んでいることを確認します。
- 37 ° C で非 CO2インキュベーターで一晩センサー カートリッジを孵化させなさい
5. 成長と歯根膜被覆板の細胞を播種
- C. アルビカンスYPD スープを接種して 200 rpm でシェーカーの 30 ° C で一晩成長します。
注: は、試金のデザインと関心に基づき、YPG または最小媒体で、 c. アルビカンスに育てることができます。 - 試験の日、最終濃度 100 μ L あたり 10万個のセルを生成するためのアッセイ培地での細胞の適切な数を希釈します。
- A1、B4、C3、D6、追加のバック グラウンド補正 (図 3) のためのアッセイ媒体のみ 100 μ L の井戸を除くアッセイ プレートの各ウェルに 100 μ L の希薄化後のセルを追加します。
- 37 ° C で非 CO2インキュベーターにプレートを転送し、プレート表面に付着細胞をできるようになる 60 分間インキュベートします。
6. 試金のプロトコル
注: ここで説明したプロトコルは、楽器の 24 ウェル フォーマットです。ボリュームは、別の形式を使用する場合に調整する必要があります。
- ミトコンドリア機能試金
- 化合物の調製
- ミトコンドリア機能の試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備: 20 mM シャム、100 μ M を準備 100 mM KCN、オリゴマイシンおよび対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。
- 50 μ l 添加 55 μ L ポート A に偽オリゴマイシン ポート B、62 μ C とポートに KCN ポート D に 68 μ L アンチマイシン A (図 4)。
- 化合物の調製
- 解糖系の応力測定
- 化合物の調製
- 解糖系ストレスの試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備します。100 mM のグルコース、100 μ M を準備オリゴマイシン、500 mM 2-デオキシ糖 (2 DG) と対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。
- ポート A、55 μ L に 50 μ L のブドウ糖を追加 C とポート d. に 68 μ L アンチマイシン A ポートにポート B、62 μ L 2 DG にオリゴマイシン
- 化合物の調製
- 余分なフラックス測定をできる酸素消費量 (OCR) および 24 ウェル プレート形式で生きた細胞の細胞の酸性化率 (ecar と) を採用してください。事前に試金のプロトコルを設定します。
- 余分なフラックス アナライザーを開くし、分析] タブを使用して試金テンプレートを設定セットアップ中に飛び出すすべての情報を記入するステップバイ ステップの指示に従ってください。図5 と同様にグループのレイアウトを生成します。表 1に示すように、プロトコルを設定します。アッセイの前に前もってこれらのレイアウトを設定し、コンピューターに保存します。試金の時に、[分析] タブ (図 5) にファイルを開くのオプションで対応するファイルを開き、保存されたプロトコルを復元します。
- 10 x 化合物、calibrant を含む水分センサー カートリッジのそれぞれのポートにし余分なフラックス アナライザーのキャリア トレイにします。画面のスタートボタンを押すことによって、校正を開始します。
- 450 μ L の最終巻をさせる細胞障害を最小限に抑えるために井戸の側面に沿って細胞板に優しくアッセイ中の 350 μ L を追加します。
- アッセイ プレートと calibrant を含むユーティリティ プレートを交換し、続けます。
- 分析が完了したら、センサー カートリッジとプレートを削除します。適切な保存先フォルダーにファイルを保存します。
7. データ解析
- 図 6に示すように、各パラメーター (OCR または ecar と) を選択してグループ間の差を計算するのにソフトウェアのカーブ-分散分析 (AUC ANOVA) 解析タブの下の領域を使用します。
- 比較する必要があるグループを選択します。
- 分散分析の分析グループに追加し、 [ok]をクリックします。
注: この AUC ANOVA 分析は、AUC はグループごとに計算し、分散分析により両者比較ファイルに新しいシートが追加されます。これは、意義を示す p 値のテーブルを与えます。
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Representative Results
このプロトコルの焦点c. アルビカンス余分なフラックス アナライザーによって評価の生物エネルギー関数を決定することです。ミトコンドリア蛋白質 Mam33 に欠けているC. albicansの変異体は、その補数のひずみ、 mam33Δ/Δ::MAM33 OCR と ecar とミトコンドリア蛋白質の削除の影響を研究すると共に含まれています。推定酸性ミトコンドリア蛋白質のMAM33をエンコードし、カンジダの機能は知られていません。
余分なフラックスの試金のための携帯番号
145 pmol/分 (図 7)、100-300 pmol/分任意細胞フラックスの試金のための最適な範囲内にある OCR を示した余分なフラックスのアッセイでウェルあたり 1 x 105 C. albicansの野生型細胞を採用しました。また、アッセイの前にまたは別の試金の間成長培地組成の変化があるとき最適な OCR を取得するセル番号を滴定することが重要です。
データの分析
ソフトウェアのカーブ-分散分析 (AUC ANOVA) 解析タブの下の領域は、図 7に示すように、各パラメーター (OCR または ecar と) を選択してグループ間の有意差を計算に使用されました。この分析では、p 値のテーブルを与えたファイル AUC されたグループごとに計算し、自動的にそれら分散分析により比較に新しいシートが追加されます。
ミトコンドリア機能試金
ミトコンドリア ストレス テスト アッセイ開始代替オキシダーゼ (AOX)、ATP 合成酵素と電子輸送鎖の複合体、III と IV の阻害剤の注入に続いて基底酸素消費量 (OCR) を測定します。C. アルビカンスは古典的な呼吸鎖に加えて、エネルギー生成24AOX 経路も利用します。したがって、サリチルヒドロキサム酸 (偽の)25を使用して、その活性を阻害することによって OCR の AOX システムの効果を調べた。Pmol/分基底とそれぞれの阻害剤を注射した後の酸素消費量 (OCR) として測定したミトコンドリアの機能を図 7に示します。野生型、 mam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33系統の基底の OCR は (図 7A と B) の違いを示さなかった。同様に、基底 ecar とに有意差が認められなかった (図 7C と D) これらの系統。ただし、野生型およびmam33Δ/Δ::MAM33 mam33Δ/Δとは対照的解糖系への大幅なシフトを示した KCN より複雑な IV を阻害することによって大きく失敗した代償解糖系シフト (図 7を表示するにはE) C IV 依存の解糖系の経路は野生型とmam33Δ/Δ::MAM33系統に比べてmam33Δ/Δ変異体で損なわれることを示唆しています。
解糖系の応力測定
解糖系のストレス テストで細胞がグルコース 1 h に飢えていたし、基底の OCR と ecar とを測定しました。飢餓時にmam33Δ/Δを示した OCR (図 8A と B) と ecar と (図 8C と D) 野生型とグルコースの低下率を示唆しているmam33Δ/Δ::MAM33系統と比較して有意に低い呼吸と解糖系細胞が飢餓状態にならない場合です。グルコースを注射した後は、すべての株は、OCR ・ ecar と刺激を示した。OCR と ecar とオリゴマイシンは、解糖系の阻害剤である OCR と 2 DG ecar との両方で以下の効果を阻害します。具体的には、2 DG 部分的 OCR, アンチマイシン A によってさらに抑制を阻害します。対照的に、2 DG には ecar とほぼ完全に阻害します。
表 1。試金のためのプロトコル コマンド
図 1.実験の模式図この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.Calibrant を追加する前にユーティリティ プレート近くセンサー カートリッジ (グリーン) 上下逆さまに配置します。蛍光物質は、矢印で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.細胞培養プレート背景井戸 A1、B4、C3、D6 を表示します。青いマークは、ノッチ、左下に指向を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.ポート A、B、C および D を示すセンサー カートリッジの上部矢印マークは、ノッチ、左下に指向を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.井戸およびソフトウェアの可視化グループの割り当てのレイアウト。WT-野生型;MT- mam33Δ/Δ変異体;コンプ-mam33Δ/Δ::MAM33ひずみ.を補完します。矢印マークは、ファイルを開くタブを示していますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.グループ間の意義を計算する曲線 (AUC) 分散分析] タブの下の領域。比較する、分散分析の分析グループに追加し、[ok] をクリックする必要があるグループを選択します。この AUC ANOVA 分析は、AUC はグループごとに計算し、分散分析により両者比較ファイルに新しいシートが追加されます。これは、意義を示す p 値のテーブルを与えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。ミトコンドリアの機能試験C. アルビカンス.C. albicansの野生型、 mam33 Δ/Δ、およびmam33 Δ/Δ::MAM33系統の酸素消費量と細胞外酸性化率を測定しました。A) 基底の呼吸で酸素消費量 (OCR) のリアルタイム グラフは続いてシャム (2 mM) のオリゴマイシンのシーケンシャル噴射 (10 μ M)、KCN (10 mM)、アンチマイシン (2 μ M)。B) 曲線 (AUC) 基底 OCR C. albicansの野生型、 mam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33系統間の下の領域の比較は有意差を示します。C) 基底解糖作用で細胞の酸性化率 (ecar と) のリアルタイム グラフは続いてシャム (2 mM) のオリゴマイシンのシーケンシャル噴射 (10 μ M)、KCN (10 mM)、アンチマイシン (2 μ M)。D) 曲線下面積の比較 (AUC) C. albicansの野生型、 mam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33系統間基底 ecar とは有意差を示します。E) C IV 阻害剤 KCN の注入後の c.albicansの (AUC) ecar と野生型、 mam33Δ/Δ mam33 Δ/Δ::MAM33系統間曲線下面積の比較mam33Δ/Δ で解糖系のシフトが大幅に低下を示す変異株は野生型と比較して、補完的な系統値は平均 ± 標準誤差平均として表されます。* p < 0.05 * * p < 0.001 は一方向の分散分析により重要なものとしてと見なされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8.解糖系の応力測定 c. アルビカンス。酸素消費量と細胞の酸性化は野生型、 mam33Δ/Δ変異体彼らは飽和グルコース濃度の急性投与に続いてグルコースに飢えていた後に測定しました。A) 細胞が基底 ecar とにさらされた後の酸素消費速度のリアルタイム グラフは続いてグルコース (10 mM) のオリゴマイシン シーケンシャル噴射 (1 μ M) 2 DG (40 mM) とアンチマイシン (2 μ M)。B) ecar とC. albicansの野生型、 mam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33系統間基底解の曲線の下の領域を示す棒グラフ。解糖系の機能細胞は基底 ecar とにさらされた後の C) リアルタイム グラフは続いてグルコース (10 mM) のオリゴマイシン シーケンシャル噴射 (1 μ M) 2 DG (40 mM) とアンチマイシン (2 μ M)。D) C. albicansの値のmam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33の系統は平均 ± 標準誤差の平均値として表されます ecar と野生型の基底解の曲線の下の領域を示す棒グラフ。* p < 0.05 * * * p < 0.0005、* * * p < 0.0001 は一方向の分散分析により重要なものとしてと見なされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
生体エネルギー酸化的リン酸化 (OXPHOS) を測定することによってミトコンドリアの機能を読み出すための優れたツールとして余分なフラックスの試金-リアルタイム依存酸素消費量。また、リアルタイム解析で同時に細胞の酸性化率 (細胞外 pH の変更) として測定される解糖系関数を調べることがもできます。
アッセイ プレートでC. albicansの成功したメッキは、ため、培養歯根膜コーティング プレートで細胞アッセイ プレートに付着する細胞アッセイで重要な手順の 1 つは。C. albicansの付着細胞の可視化は光学顕微鏡検査によって行われます。不適切な細胞接着細胞複製間の一貫性のない測定値と測定結果に影響を与えるが、井戸に浮いている可能性があります。同様に、この分析では 100-300 pmol/分、これは最適な範囲の OCR を取得する最初のステップとしてセル数滴定を行うことが重要です。また、最適な濃度を取得する化合物の滴定は最適な応答を達成するために重要なも。これは基底の培地組成の変化があるたびに実行する可能性があります。
DMEM は哺乳類細胞の余分なフラックス測定法で最もよく使用される基本培地です。しかし、私たちの手で RPMI 1640 媒体はc.albicansと最適な結果を与えた。これは DMEM に比べて RPMI 1640 中うまくミトコンドリアの電子伝達鎖の複雑な阻害剤の有効性のため主にだった。
このアッセイでは、野生型の c.albicansのmam33Δ/Δ mam33Δ/Δ::MAM33の系統はミトコンドリア呼吸と解糖系の効率を評価するために使用されていました。結果は、C-IV (図 7C ・ 7 e) の阻害などのストレス条件下で解糖系にシフトするC. albicansの能力をMAM33遺伝子の削除に削減を明確に示します。同様に、細胞は、グルコース飢餓のような状態をストレスにさらされた、ミトコンドリア呼吸と解糖系効率の両方が著しく危殆化野生型および補体菌株 (ではなくmam33Δ/Δ変異体で図 8)。したがって、実験によって RPMI 1640 年に炭素源がまた変更グリセロールまたはガラクトースは、解糖系ではなく OXPHOS 使用する細胞を強制的に。
余分なフラックスの試金を使用しての意義はミトコンドリアの機能を混乱させる化合物及び各種の基材に使用して、解糖作用対 OXPHOS を利用する細胞機能は推論できます。これはミトコンドリアを孤立させることがなく任意の治療や遺伝子のカンジダで解糖系とミトコンドリアの機能に及ぼす影響を理解する有益なツールとして使用する可能性があります。アッセイは、ミトコンドリア呼吸の尺度である基底酸素消費量 (OCR) とグルコースのグルコース飢餓後両方の存在における解糖系の機能の測定である細胞の酸性化率 (ecar と) を測定します。余分なフラックス細胞アッセイもさまざまな哺乳類モデル26に採用します。C. albicansの医療重要性にもかかわらず真菌ミトコンドリアの研究はミトコンドリアの機能とリアルタイムで解糖系を検討する標準化された実験手順の不足のためやや妨げられています。
このメソッドは、リアルタイム細胞フラックス法を用いたミトコンドリア呼吸と解糖系の効率を調査する簡単で便利な方法を提供しますc. アルビカンス。将来的にこのアッセイは、フルコナゾールなど一般的に使用される抗真菌薬を使用して薬剤効果試験勉強にも適用可能性があります。また、このメソッドの別の潜在的な将来のアプリケーションは、創薬、特にC. albicansのミトコンドリア機能のターゲット化合物をスクリーニングするためにです。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
NC ラボで研究をサポートするには、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01AI24499 とニュージャージー州健康財団 (NJHF) の助成金、#PC40 18。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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