هنا، نقدم بروتوكول التدرجي للتحقيق في التنفس المتقدرية والدالة جليكوليتيك في المبيضات البيض استخدام محلل تدفق إضافي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا هي العضيات الضرورية الأيض الخلوية والبقاء على قيد الحياة. مجموعة متنوعة من الأحداث الرئيسية تجري في الميتوكوندريا، مثل التنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج. ونتيجة لذلك، أفيد بخلل mitochondrial تلعب دوراً هاما في التسامح العقاقير المضادة للفطور وضراوة من الفطريات المسببة للأمراض. البيانات الأخيرة أدت أيضا إلى الاعتراف بأهمية الميتوكوندريا بوصفها مساهما هاما في الآلية المرضية الفطرية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في الأحياء الفطرية، هي بدائية أساليب موحدة لفهم وظيفتها. نقدم هنا، إجراء دراسة معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، مقياسا للتنفس المتقدرية، ومعدلات تحمض خارج الخلية (عكر)، مقياسا للدالة جليكوليتيك في سلالات المبيضة . يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا لأي ضغوط كانديداسب. دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من الخلايا الفطرية سليمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تخصيص هذا البروتوكول إلى الشاشة لمثبطات للوظيفة المتقدرية في سلالات المبيضة .
المقدمة
الأمراض الفطرية الغازية تقتل ما يزيد على 1.5 مليون شخص سنوياً في جميع أنحاء العالم. هذا الرقم في الارتفاع بسبب زيادة في عدد الأشخاص الذين يعيشون مع حصانة المساس بها، بما في ذلك الرضع المسنين، سابق لأوانه، ومتلقي زرع، و مرضى السرطان1. المبيضة هو ممرض فطرية بشرية انتهازية التي جزء من النبت البشرية. كما يقطن الأسطح المخاطية والجهاز الهضمي ككائن كومينسال. وتنتج المبيضة الأمراض الجهازية الخطيرة في الأشخاص الذين لديهم أوجه القصور المناعي، الذين خضعوا لعملية جراحية، أو الذين قد تم التعامل مع دورات طويلة من المضادات الحيوية. أنواع المبيضات الرتبة من بين أعلى ثلاثة إلى أربعة أسباب الأمراض المعدية (NID) المستشفيات في البشر
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: بروتوكول التدرجي مفصلة المقايسة يرد أدناه، والبروتوكول التخطيطي ويرد في الشكل 1.
1-سلالات المبيضة وظروف النمو
- تنمو سلالات المبيضة في السائل المتوسطة الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YPD) في 30 °مئوية في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الحفاظ على سلالات المبيضات الأرصدة المجمدة، وتنمو في أجار YPD (استخراج الخميرة 1% ببتون 2%، 2% سكر العنب واجار 2%).
2-إعداد الكواشف
- إعداد متوسطة المقايسة كما يلي:
- لفحص الوظيفة المتقدرية، يحل الجلوكوز ز 2 (2 في المائة) ومسحوق 1640 معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) ز 1.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ينصب هذا البروتوكول تحديد وظائف الطاقة البيولوجية المبيضة تقييم من قبل محلل تدفق إضافي. ويرد أيضا متحولة المبيضة التي تفتقر إلى البروتين المتقدرية Mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملاً لها، mam33Δ/Δ::MAM33 لدراسة آثار حذف البروتين المتقدرية على التعرف الضوئي على الحروف وعكر. MAM33 يشفر لبروتين مصفوفة حمضية المتقدرية المفترضة ووظيفتها في المبيضات غير معروف.
أرقام الخلية لتحليل تدف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الاستقلاب المقايسة الجريان الإضافي بمثابة أداة ممتازة لقراءة وظيفة الميتوكوندريا بقياس الفسفرة (أوكسفوس)-استهلاك الأوكسجين تعتمد في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التحقيق دالة glycolytic ويتم قياسه كنسبة تحمض خارج الخلية (التغير في درجة الحموضة خارج الخلية) في نفس الوقت في تحليل في الوقت الحقيقي.
الطلاء الناجح من المبيضة في لوحة الفحص واحدة من الخطوات الحاسمة في المقايسة للحضانة للخلايا في لوحات PDL المغلفة تسمح الخلايا على التمسك بلوحة المقايسة. هو إنجاز التصور المنضمة <.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
البحث في نورث كارولاينا مختبر معتمد من قبل منحة معاهد وطنية لصحة (NIH) R01AI24499، ومنحة مؤسسة صحة ولاية نيو جيرسي (نجهف)، #PC40-18.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito الإجهاد | Kit Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| مقياس الأس الهيدروجيني | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| بولي دي ليسين | سيجما | P6407 | |
| روتينون | سانتا كروز | 203242 | |
| فرس البحر XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| كلوريد الصوديوم | Amresco | 241 | |
| كريات هيدروكسي الصوديوم | جي تي بيكر | 3722 | |
| مياه زراعة الأنسجة من الدرجة | Gibco | 1523-0147 | |
| XF محلول العيار لفحص | XF Agilent | 100840-000 | |
| مستخلص الخميرة الببتون سكر العنب | فيشر علمي ، | BP2469 | |
| مستخلص الخميرة ببتون سكر العنب أجار | سيجما | A1296 | |
| مستخلص الخميرة الببتون الجلسرين | سيجما | G2025 |
المراجع
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
