Summary
هنا، نقدم بروتوكول التدرجي للتحقيق في التنفس المتقدرية والدالة جليكوليتيك في المبيضات البيض استخدام محلل تدفق إضافي.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات الضرورية الأيض الخلوية والبقاء على قيد الحياة. مجموعة متنوعة من الأحداث الرئيسية تجري في الميتوكوندريا، مثل التنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج. ونتيجة لذلك، أفيد بخلل mitochondrial تلعب دوراً هاما في التسامح العقاقير المضادة للفطور وضراوة من الفطريات المسببة للأمراض. البيانات الأخيرة أدت أيضا إلى الاعتراف بأهمية الميتوكوندريا بوصفها مساهما هاما في الآلية المرضية الفطرية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في الأحياء الفطرية، هي بدائية أساليب موحدة لفهم وظيفتها. نقدم هنا، إجراء دراسة معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، مقياسا للتنفس المتقدرية، ومعدلات تحمض خارج الخلية (عكر)، مقياسا للدالة جليكوليتيك في سلالات المبيضة . يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا لأي ضغوط كانديداسب. دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من الخلايا الفطرية سليمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تخصيص هذا البروتوكول إلى الشاشة لمثبطات للوظيفة المتقدرية في سلالات المبيضة .
Introduction
الأمراض الفطرية الغازية تقتل ما يزيد على 1.5 مليون شخص سنوياً في جميع أنحاء العالم. هذا الرقم في الارتفاع بسبب زيادة في عدد الأشخاص الذين يعيشون مع حصانة المساس بها، بما في ذلك الرضع المسنين، سابق لأوانه، ومتلقي زرع، و مرضى السرطان1. المبيضة هو ممرض فطرية بشرية انتهازية التي جزء من النبت البشرية. كما يقطن الأسطح المخاطية والجهاز الهضمي ككائن كومينسال. وتنتج المبيضة الأمراض الجهازية الخطيرة في الأشخاص الذين لديهم أوجه القصور المناعي، الذين خضعوا لعملية جراحية، أو الذين قد تم التعامل مع دورات طويلة من المضادات الحيوية. أنواع المبيضات الرتبة من بين أعلى ثلاثة إلى أربعة أسباب الأمراض المعدية (NID) المستشفيات في البشر2،3،،من45،،من67. ويقدر عدد العالمية السنوية من التهابات مجرى الدم المبيضات حالات ~ 400,000، مع نفوق المرتبطة بها من 46-75%1. الوفيات السنوية بسبب داء المبيضات هو تقريبا 10000 في الولايات المتحدة وحدها. مدى NID تسببها الفطريات ينعكس أيضا في نفقات المريض الفلكية5. في الولايات المتحدة، تفوق النفقات السنوية لعلاج الأمراض الفطرية الغازية $ 2 بیلیون، مضيفاً سلالة ضخمة لنظام الرعاية الصحية المثقلة بالفعل. العلاجات المضادة للفطور القياسية المتوفرة حاليا محدودة بسبب السمية، ومقاومة المخدرات أكثر انتشارا، والمخدرات-المخدرات التفاعلات. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد أهداف العقاقير المضادة للفطور الجديدة التي سوف تسفر عن أفضل خيارات العلاج للمرضى المعرضة للخطر. ومع ذلك، اكتشاف أدوية جديدة تعمل على أهداف الفطرية معقد نظراً للفطريات حقيقيات النوى. وهذا يحد بدرجة كبيرة العدد من الأهداف الفطرية الخاصة بالمخدرات.
قد بينت الدراسات الأخيرة أن الميتوكوندريا هي مساهم حرجة لضراوة الفطرية والتسامح للأدوية المضادة للفطور منذ الميتوكوندريا هامة للتنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج8 9، ،،من1011. التمثيل الغذائي سواء جليكوليتيك أو غير جليكوليتيك ضرورية لبقاء المبيضة في الثدييات المضيفة12،،من1314،،من1516. وعلاوة على ذلك، عدة طفرات المبيضة التي تفتقر إلى البروتينات المتقدرية، مثل Goa1، Srr1، Gem1، Sam37 إلخ قد أظهرت أن تكون معيبة في فيلامينتيشن، عامل فوعة هامة من المبيضة17، 18 , 19 , 20 , 21 , 22-وبالإضافة إلى ذلك، عرضت هذه طفرات أيضا أن يخفف لضراوة في نموذج ماوس لنشر داء المبيضات17،،من1819،20،21 ،22. وهكذا، تمثل الميتوكوندريا الفطرية هدفا جذاباً لاكتشاف المخدرات. ومع ذلك، هو التحدي دراسة الوظيفة المتقدرية في المبيضة سبب المبيضة صغيرتي السلبية23، مما يعني أنها لا تستطيع أن تعيش دون جينوم المتقدرية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وجليكوليتيك في المبيضة دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا. هذا الأسلوب يمكن أن يكون الأمثل أيضا للتحقيق في تأثير التلاعب بالجينات أو المغيرون الكيميائية على مسارات mitochondrial وجليكوليتيك في المبيضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول التدرجي مفصلة المقايسة يرد أدناه، والبروتوكول التخطيطي ويرد في الشكل 1.
1-سلالات المبيضة وظروف النمو
- تنمو سلالات المبيضة في السائل المتوسطة الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YPD) في 30 °مئوية في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الحفاظ على سلالات المبيضات الأرصدة المجمدة، وتنمو في أجار YPD (استخراج الخميرة 1% ببتون 2%، 2% سكر العنب واجار 2%).
2-إعداد الكواشف
- إعداد متوسطة المقايسة كما يلي:
- لفحص الوظيفة المتقدرية، يحل الجلوكوز ز 2 (2 في المائة) ومسحوق 1640 معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) ز 1.04 في 90 مل من الماء المعقم والحارة وسائط الإعلام إلى 37 درجة مئوية. ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام 5 م هيدروكسيد الصوديوم وتكونها إلى 100 مل بالماء المعقم.
- للإجهاد glycolytic المقايسة، حل ز 1.04 مسحوق RPMI 1640 وحدها في 90 مل من الماء المعقم والحارة وسائط الإعلام إلى 37 درجة مئوية وضبط ال pH إلى 7.4. جعل وحدة التخزين إلى 100 مل بالماء المعقم. مسحوق RPMI 1640 قد لا بيكربونات، هو أمر حيوي لرصد تغير درجة الحموضة كمقياس لتحلل خلال المقايسة.
- حقن مركبات.
- إعداد مخزون الجلوكوز 1 متر في الماء المعقم ومخزن في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 مم أوليجوميسين الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، الكوة بكميات صغيرة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 مم أنتيميسين بالأسهم في [دمس]، الكوة بكميات صغيرة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 ملم الشام (حمض ساليسيلهيدروكساميك) المخزون في الإيثانول في اليوم للمقايسة.
- تحضير 1 م KCN في الماء المعقم في اليوم من المقايسة.
3-طلاء لوحة المقايسة مع بولي-د-يسين (PDL)
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الصفحي أدناه.
- حل "يسين" بولي-د في زراعة الأنسجة الصف المياه لجعل 50 ميكروغرام/مل التركيز النهائي. يخلط جيدا والكوة في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية لفترة طويلة.
ملاحظة: هناك حاجة إلى 50 ميليلتر كل بئر، ومطلوب للآبار 24، 1.2 مل. ولذلك، قاسمة على الأقل 1.3 مل في أنبوب ميكروسينتريفوجي. - إضافة 50 ميليلتر كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع غطاء تغطي ح 1-2.
- نضح الحل وشطف مرة واحدة مع 500 ميليلتر زراعة الأنسجة المعقمة الصف المياه.
- فتح الغطاء وتسمح الآبار للهواء الجاف. استخدم اللوحة في نفس اليوم أو مخزن في 4 درجات مئوية كحد أقصى من 2-3 أيام.
4-الماء من استشعار خرطوشة
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة يوم واحد قبل التجربة.
- فتح تدفق إضافي "أدوات الفحص" وإزالة المحتويات. ضع خرطوشة استشعار رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة (الشكل 2).
- تعبئة كل جيدا للوحة الأداة المساعدة مع 1 مل كاليبرانت ومكان خرطوشة استشعار مرة أخرى. تأكد من أن أجهزة الاستشعار التي تحتوي على فلوروفوريس (لقياس الأوكسجين ودرجة الحموضة) مغمورة في كاليبرانت.
- احتضان خرطوشة الاستشعار بين عشية وضحاها في حاضنة غير CO2 في 37 درجة مئوية.
5-تزايد وبذر خلايا في لوحات PDL المغلفة
- تطعيم المبيضة في مرق YPD وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في شاكر 200 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: استناداً إلى تصميم المقايسة والفائدة، يمكن أيضا زراعة المبيضة في يبج أو المتوسطة الدنيا. - في يوم الفحص، تخفف من عدد مناسب من الخلايا على المديين المتوسط ومقايسة تسفر عن تركيز نهائي للخلايا 100,000 الواحد 100 ميليلتر.
- إضافة 100 ميليلتر من الخلايا المخفف في كل بئر من لوحة الفحص ما عدا الآبار A1، B4، C3، و D6، الذي إضافة فقط 100 ميليلتر من المتوسطة المقايسة لتصحيح الخلفية (الشكل 3).
- نقل اللوحة لحاضنة غير CO2 عند 37 درجة مئوية واحتضانها ل 60 دقيقة، التي سوف تسمح للخلايا التمسك بسطح لوحة.
6-فحص بروتوكول
ملاحظة: البروتوكول المبينة هنا للشكل 24-جيدا للصك. وحدات التخزين سوف تحتاج إلى تعديل في حالة استخدام تنسيق آخر.
- تحليل الوظيفة المتقدرية
- إعداد المركبات
- إعداد المركبات بتركيز x 10 للوظيفة المتقدرية المقايسة: إعداد 20 مم الشام، 100 ميكرومتر أوليجوميسين، KCN، 100 ملم و 20 ألف أنتيميسين ميكرومتر في المتوسط التحليل المطابق.
- إضافة 50 ميليلتر الشام في المنفذ A، ميليلتر 55 أوليجوميسين إلى المنفذ B، 62 ميليلتر KCN إلى ميناء ج و 68 ألف أنتيميسين ميليلتر في منفذ د (الشكل 4).
- إعداد المركبات
- فحص الإجهاد جليكوليتيك
- إعداد المركبات
- إعداد المركبات في تركيز x 10 لفحص الإجهاد جليكوليتيك. إعداد 100 ملم الجلوكوز، 100 ميكرومتر أوليجوميسين، 500 ملم 2-ديوكسي الجلوكوز (المديرية العامة 2) و 20 ألف أنتيميسين ميكرومتر في المتوسط التحليل المطابق.
- إضافة 50 ميليلتر الجلوكوز في المنفذ A، ميليلتر 55 أوليجوميسين منفذ ب، 2 ميليلتر 62-المديرية العامة في ميناء ج و 68 ألف أنتيميسين ميليلتر في منفذ دال
- إعداد المركبات
- توظيف محلل التدفق الإضافي، الذي يقيس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر) من الخلايا الحية في شكل لوحة 24-جيدا. إعداد البروتوكول الفحص مقدما.
- افتح محلل تدفق إضافي وإعداد قالب الفحص باستخدام علامة التبويب معالج المقايسة واتبع التعليمات خطوة بخطوة ملء جميع المعلومات التي الملوثات العضوية الثابتة أثناء الإعداد. إنشاء تخطيط المجموعة كشبيه هو موضح في الشكل 5. إعداد البروتوكول كما هو مبين في الجدول 1. إعداد هذه التخطيطات مسبقاً قبل الفحص وحفظه في جهاز الكمبيوتر. في الوقت للمقايسة، استعادة بروتوكول المحفوظة عن طريق فتح الملف المطابق في خيار فتح الملف في علامة التبويب معالج بالانزيم (الشكل 5).
- تحميل المركبات 10 x في موانئ كل خرطوشة استشعار المائية التي تحتوي على كاليبرانت وتحميل في علبة الناقل من محلل تدفق إضافي. بدء المعايرة عن طريق الضغط على زر ابدأ على الشاشة.
- إضافة 350 ميليلتر من المتوسطة المقايسة بلطف إلى لوحة الخلية على طول الجانب من الآبار للتقليل من اضطرابات الخلية لإحضار وحدة التخزين النهائي إلى 450 ميليلتر.
- استبدال لوحة الأداة التي تحتوي على كاليبرانت مع لوحة المقايسة والاستمرار.
- إزالة خرطوشة الاستشعار واللوحة بمجرد اكتمال المقايسة. حفظ الملف في المجلد الوجهة المناسبة.
7-بيانات التحليل
- استخدام المنطقة تحت منحنى--تحليل التباين (أوك-ANOVA) التبويب تحليل في البرنامج لحساب الفرق الكبير بين المجموعات بتحديد المعلمات الخاصة بكل منها (التعرف الضوئي على الحروف أو عكر) كما هو موضح في الشكل 6.
- حدد المجموعات التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة.
- إضافة إلى مجموعات تحليل ANOVA وانقر فوق موافق.
ملاحظة: هذا تحليل ANOVA أوك سيتم إضافة ورقة جديدة إلى الملف الذي يحسب لكل مجموعة أوك والمقارنة بينهما من ANOVA. وهذا سيعطي جدول القيم ف لإظهار الأهمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينصب هذا البروتوكول تحديد وظائف الطاقة البيولوجية المبيضة تقييم من قبل محلل تدفق إضافي. ويرد أيضا متحولة المبيضة التي تفتقر إلى البروتين المتقدرية Mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملاً لها، mam33Δ/Δ::MAM33 لدراسة آثار حذف البروتين المتقدرية على التعرف الضوئي على الحروف وعكر. MAM33 يشفر لبروتين مصفوفة حمضية المتقدرية المفترضة ووظيفتها في المبيضات غير معروف.
أرقام الخلية لتحليل تدفق إضافي
ونحن العاملين 1 × 105 المبيضة البرية نوع الخلايا من كل بئر في مقايسة التمويه الإضافية، التي أظهرت التعرف الضوئي على الحروف من 145 pmol/دقيقة (الشكل 7)، التي تقع ضمن النطاق الأمثل من 100-300 pmol/دقيقة لأي تحليل الجريان خارج الخلية. من المهم أيضا أن تيتراتي عدد الخلايا للحصول على أمثل التعرف الضوئي على الحروف قبل المقايسة، أو عندما يكون هناك تغيير في تكوين نمو متوسطة بين فحوصات مختلفة.
تحليل البيانات
استخدمت المنطقة تحت منحنى--تحليل التباين (أوك-ANOVA) التبويب تحليل في البرنامج لحساب الفرق الكبير بين المجموعات بتحديد المعلمات الخاصة بكل منها (التعرف الضوئي على الحروف أو عكر) كما هو موضح في الشكل 7. هذا التحليل إضافة ورقة جديدة إلى ملف المحسوبة لكل مجموعة فيها أوك والمقارنة بينها ب ANOVA تلقائياً، الذي أعطى جدول القيم ف.
تحليل الوظيفة المتقدرية
في اختبار الإجهاد المتقدرية، يبدأ الفحص بقياس معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR) متبوعاً بحقن مثبطات أوكسيديز بديل (AOX)، ATP synthase ومجمعات سلسلة نقل الإلكترون، الرابع والثالث. بالإضافة إلى السلسلة التنفسية الكلاسيكية، و المبيضة تستخدم أيضا في مسار أوش ل توليد الطاقة24. ولذلك، نحن التحقيق أثر نظام أوكس على التعرف الضوئي على الحروف عن طريق تثبيط نشاطها باستخدام ساليسيلهيدروكساميك الحمضية (الشام)25. وظيفة الميتوكوندريا، الذي تم قياسه كمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) في pmol/دقيقة في القاعدية وبعد الحقن مثبطات كل منهما هو الموضح في الشكل 7. وأظهرت OCR القاعدية من السلالات البرية نوع، mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 لا توجد فروقات (الشكل 7ب). وبالمثل، لا يوجد فرق كبير في عكر القاعدية لوحظ بين هذه السلالات (الشكل 7جيم ودال). ومع ذلك، عن طريق تثبيط رابعا معقدة من KCN، نوع البرية و mam33Δ/Δ::MAM33 وأظهرت تحولاً كبيرا نحو تحلل خلافا mam33Δ/Δ، التي كثيرا أخفقت في إثبات تحولاً glycolytic تعويضي (الشكل 7 ﻫ)، مما يوحي بأن تعتمد المسار glycolytic ج-الرابع هو ضعف في المسخ mam33Δ/Δ بالمقارنة مع نوع البرية وسلالات mam33Δ/Δ::MAM33 .
فحص الإجهاد جليكوليتيك
في اختبار الإجهاد glycolytic، كانت تفتقر الخلايا الجلوكوز ح 1 وتم قياس القاعدية التعرف الضوئي على الحروف وعكر. وأظهرت mam33Δ/Δ عند المجاعة، أقل بكثير التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 8أ وب) واكار (الشكل 8ج ود) بالمقارنة مع نوع البرية وسلالات mam33Δ/Δ::MAM33 ، مما يوحي ضعف استخدام الجلوكوز للتنفس وتحلل عندما يجبر الخلايا إلى حالة المجاعة. وبعد حقن الجلوكوز، أظهرت جميع سلالات التحفيز للتعرف الضوئي على الحروف واكار. على الرغم من أن أوليجوميسين له تأثير أقل على التعرف الضوئي على الحروف واكار، 2-المديرية العامة، ومثبط تنافسي لتحلل، يحول دون التعرف الضوئي على الحروف واكار. على وجه التحديد، 2-المديرية العامة جزئيا يمنع التعرف الضوئي على الحروف، التي تحول دون مزيد من ألف أنتيميسين وفي المقابل، يمنع 2-المديرية العامة تماما تقريبا عكر.
الجدول 1. أوامر البروتوكول للفحص
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي للتجربة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . وضعت أجهزة الاستشعار خرطوشة (الأخضر) رأسا على عقب بالقرب من لوحة الأداة المساعدة قبل إضافة كاليبرانت- يتم الإشارة إلى فلوروفوريس بالأسهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . خلية ثقافة لوحة عرض خلفية الآبار A1، B4، C3، والفئة دال-6- يظهر علامة زرقاء الدرجة، والتوجه إلى الزاوية اليسرى السفلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الجزء العلوي من خرطوشة استشعار عرض منافذ ألف، باء، جيم ودال يظهر علامة السهم الدرجة، والتوجه إلى الزاوية اليسرى السفلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تخطيط الآبار والإحالة المجموعة كما تصور في البرنامج- الوزن-نوع البرية؛ MT-المسخ mam33Δ/Δ ؛ شركات-mam33Δ/Δ::MAM33 يكمل سلالة. علامة السهم يظهر علامة التبويب فتح ملف الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . منطقة ضمن علامة التبويب تحليل ANOVA المنحنى (AUC) لحساب أهمية بين المجموعات- حدد المجموعات التي تحتاج إلى مقارنة وإضافة إلى المجموعات تحليل ANOVA وانقر فوق موافق. هذا تحليل ANOVA أوك سيتم إضافة ورقة جديدة إلى الملف الذي يحسب لكل مجموعة أوك والمقارنة بينهما من ANOVA. وهذا سيعطي جدول القيم ف لإظهار الأهمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7. تحليل الوظيفة المتقدرية في المبيضة. تم قياس استهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في البرية سلالات المبيضةنوع mam33 Δ/Δ، و mam33 Δ/Δ::MAM33 . A) رسم بياني في الوقت الحقيقي لمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) في التنفس القاعدية تليها حقن متسلسلة من الشام (2 مم)، أوليجوميسين (10 ميكرومتر)، KCN (10 ملم)، وأنتيميسين (ميكرومتر 2). ب) وتظهر مقارنة من المساحة تحت المنحنى (AUC) OCR القاعدية بين سلالات النوع، mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 البرية من المبيضة لا يوجد فرق كبير. ج) الرسم البياني في الوقت الحقيقي تحمض خارج الخلية (عكر) معدل تحلل القاعدية تليها حقن متسلسلة من الشام (2 مم)، أوليجوميسين (10 ميكرومتر)، KCN (10 ملم)، وأنتيميسين (ميكرومتر 2). د) مقارنة للمنطقة تحت المنحنى (AUC) عكر القاعدية بين سلالات النوع، mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 البرية من المبيضة إظهار لا يوجد فرق كبير. ﻫ) مقارنة بين المنطقة تحت المنحنى (AUC) عكر بين سلالات النوع، mam33Δ/Δ و mam33 Δ/Δ::MAM33 البرية من المبيضة بعد حقن ج-رابعا المانع KCN إظهار انخفاض كبير في تحول جليكوليتيك في mam33Δ/Δ المسخ بالمقارنة مع نوع البرية، ويتم التعبير عن قيم سلالات التكميلية كمتوسط ± الخطأ القياسي الوسط. * ف < 0.05، * * ف < 0.001 تعتبر كبيرة ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 . فحص الإجهاد جليكوليتيك في المبيضة. تم قياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية في نوع البرية، متحولة mam33Δ/Δ بعد أنها كانت جوعاً الجلوكوز متبوعاً بالحقن الحادة من تركيز الجلوكوز المشبعة. A) رسم بياني في الوقت الحقيقي لمعدل استهلاك الأوكسجين بعد تعرض الخلايا إلى أكار القاعدية تليها حقن متسلسلة من الجلوكوز (10 ملم)، أوليجوميسين (1 ميكرومتر)، 2-DG (40 مم)، وأنتيميسين (ميكرومتر 2). ب) الرسم البياني شريط عرض منطقة تحت منحنى عكر تحلل القاعدية بين سلالات النوع، mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 البرية من المبيضة. ج) الرسم البياني في الوقت الحقيقي للدالة جليكوليتيك بعد تعرض الخلايا إلى أكار القاعدية تليها حقن متسلسلة من الجلوكوز (10 ملم)، أوليجوميسين (1 ميكرومتر)، 2-DG (40 مم)، وأنتيميسين (ميكرومتر 2). د) الرسم البياني شريط عرض منطقة تحت منحنى أكار لتحلل القاعدية بين نوع البرية، سلالات mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 المبيضة القيم يتم التعبير عنها ك ± متوسط يعني الخطأ القياسي. * ف < 0.05، * * * ف < 0.0005، * * * ف < 0.0001 تعتبر كبيرة ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاستقلاب المقايسة الجريان الإضافي بمثابة أداة ممتازة لقراءة وظيفة الميتوكوندريا بقياس الفسفرة (أوكسفوس)-استهلاك الأوكسجين تعتمد في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التحقيق دالة glycolytic ويتم قياسه كنسبة تحمض خارج الخلية (التغير في درجة الحموضة خارج الخلية) في نفس الوقت في تحليل في الوقت الحقيقي.
الطلاء الناجح من المبيضة في لوحة الفحص واحدة من الخطوات الحاسمة في المقايسة للحضانة للخلايا في لوحات PDL المغلفة تسمح الخلايا على التمسك بلوحة المقايسة. هو إنجاز التصور المنضمة المبيضة الخلايا بالميكروسكوب الخفيفة. قد يؤدي التقيد الخلية غير لائق إلى الخلايا العائمة في الآبار، التي سوف تؤثر على نتائج التحليل مع القراءات غير متناسقة بين replicates. وبالمثل، من المهم إجراء المعايرة رقم الخلية كخطوة أولى في هذا التحليل الحصول التعرف الضوئي على الحروف بين 100-300 pmol/دقيقة، ومجموعة أمثل. أيضا، المعايرة المركبات للحصول على تركيز الأمثل أيضا عاملاً حاسما في تحقيق الاستجابة المثلى. يمكن إجراء ذلك عندما يكون هناك تغيير في تكوين متوسطة القاعدية.
هو دميم متوسطة القاعدية الأكثر استخداماً في تحليل تدفق إضافي لخلايا الثدييات. ومع ذلك، أعطت المتوسط RPMI 1640 في أيدينا، أفضل النتائج مع المبيضة. وهذا يعزى أساسا إلى فعالية المتقدرية الإلكترون النقل سلسلة مثبطات المعقدة التي عملت على نحو أفضل في المتوسط RPMI 1640 مقارنة دميم.
في هذا التحليل، نوع البرية، استخدمت سلالات mam33Δ/Δ، و mam33Δ/Δ::MAM33 من المبيضة لتقييم التنفس المتقدرية والكفاءة جليكوليتيك. النتائج التي تظهر بوضوح أن حذف الجين MAM33 قلل من قدرة المبيضة للتحول إلى تحلل تحت ظروف الإجهاد مثل تثبيط ج-رابعا (الشكل 7ج و 7E). وبالمثل، عند تعرض الخلايا التشديد على شرط مثل المجاعة الجلوكوز، التنفس المتقدرية والكفاءة جليكوليتيك إلى حد كبير للخطر في المسخ mam33Δ/Δ ولكن ليس في نوع البرية وتكملة سلالات ( الشكل 8). ولذلك، اعتماداً على التجارب، ومصادر الكربون في RPMI 1640 يجوز أيضا تعديل والغليسيرول أو اللبن، مما يجبر الخلايا إلى استخدام أوكسفوس بدلاً من تحلل.
أهمية استخدام مقايسة التمويه إضافي هو أنه باستخدام مختلف ركائز والمركبات التي التشويش الوظيفة المتقدرية، يمكن الاستدلال على قدرة الخلايا على استخدام أوكسفوس مقابل تحلل. وهذا قد تستعمل كأداة مفيدة لفهم تأثير أي علاج أو الجينات في وظيفة الميتوكوندريا وتحلل في المبيضات البيض دون عزل الميتوكوندريا. التدابير الفحص معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، ومقياس للتنفس المتقدرية، ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر)، ومقياس للدالة جليكوليتيك في وجود كلا من السكر وبعد التجويع الجلوكوز. كذلك يعمل المقايسة الخلوية التمويه إضافية في مجموعة متنوعة من نماذج الثدييات26. وعلى الرغم من أهمية الطبية المبيضة، أعيق بحوث الميتوكوندريا الفطرية نوعا ما نظراً لعدم وجود توحيد الإجراءات التجريبية لدراسة الوظيفة المتقدرية وتحلل في الوقت الحقيقي.
يوفر هذا الأسلوب طريقة سهلة ومريحة للتحقيق في التنفس المتقدرية وكفاءة جليكوليتيك باستخدام مقايسة الجريان خارج الخلية في الوقت الحقيقي في المبيضة. في المستقبل، قد أيضا تطبيق هذا التحليل على دراسة اختبار المخدرات-فعالية استخدام الأنواع شيوعاً العاملين مثل الفلوكونازول. بالإضافة إلى ذلك، آخر التطبيق المستقبلية المحتملة لهذا الأسلوب في اكتشاف الأدوية، خاصة بالنسبة لفحص المركبات استهداف الوظيفة المتقدرية من المبيضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
البحث في نورث كارولاينا مختبر معتمد من قبل منحة معاهد وطنية لصحة (NIH) R01AI24499، ومنحة مؤسسة صحة ولاية نيو جيرسي (نجهف)، #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
