Vi præsenterer her, en protokol for at udføre bærbare cellulære aerosol engagementer og måle cellulære reaktion. Metoden bruger celler, dyrkes på grænsefladen luft-væske, efterligne i vivo fysiologi. Cellulære reaktion på kobber nanopartikel aerosoler blev observeret som oxidativt stress gennem reaktive ilt arter generation og cytotoksicitet som laktat dehydrogenase udgivelse.
Denne protokol indfører et nyt in vitro- eksponering system, som kan bæres, herunder dens karakteristika og ydeevne. Air-liquid interface (ALI) in vitro- eksponering systemer er ofte store og pladskrævende, vanskeliggør transport til feltet og drift ved kilden af emission eller inden for indåndingszonen. Gennem miniaturisering af systemerne, kan laboratoriet bringes til feltet, fremskynde behandlingstid og giver en mere passende eksponering metode, der ikke ændrer aerosol før du kontakter cellerne. Transportabel In vitro eksponering kassette (PIVEC) tilpasser en 37 mm filter kassette til in vitro- toksicitet test uden for en traditionel laboratorium indstilling. PIVEC var kendetegnet ved hjælp af tre størrelser af kobber nanopartikler til at bestemme deposition effektivitet baseret på gravimetrisk og partikel nummer koncentration analyse. Indledende cytotoksicitet eksperimenter blev udført med udsatte Lungeceller at fastslå systemets evne til at deponere partikler samtidig opretholde cellernes levedygtighed. PIVEC giver et tilsvarende eller større deposition effektivitet hvor sammenligner hen til rådighed vinkelrette flow i vitro eksponering enheder. Trods lavere prøve overførselshastigheden giver den lille størrelse nogle fordele til nuværende in vitro- ALI eksponering systemer. Disse omfatter evnen til at blive båret til personlige overvågning, mobilitet fra laboratoriet til kilden til emission, og mulighed for at set-up flere systemer til rumlige opløsning samtidig opretholde en lavere bruger omkostninger. PIVEC er et system, der er i stand til at indsamle aerosoler i feltet og i indåndingszonen på en luft-interface, in vitro- model.
Personlige prøvetagning ved hjælp af in vitro- teknikker kunne give omfattende oplysninger om de biologiske virkninger af aerosoler på arbejdspladsen. 1 udsættelse for forurenende stoffer i luften omfatte engagementer med kemiske, at de indsamlede Luftprøver neddykket betingelser hvor gassen er introduceret til cellesuspension, intermitterende engagementer ved hjælp af en enhed som en rocker eller direkte engagementer på luft-flydende interface (ALI). 2 mange af disse teknikker er udført med celler dyrket i suspension eller indsamling af prøver før eksponering, som kan påvirke den toksikologiske undersøgelse på grund af potentielle ændringer i aerosol. 3 for at undgå disse ændringer, laboratoriet kan bringes til feltet ved hjælp af flere in vitro- ALI kultur eksponering systemer, der anvendes i litteratur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 dog få er kommercielt tilgængelige. 8 , 9 , 12 disse systemer er ofte voluminøse, især når herunder instrumenter til regulering af temperatur og luftfugtighed af det cellulære miljø og strømningshastigheden af prøven aerosol. Ved hjælp af PIVEC, kan aerosol engagementer udføres uden for en traditionel lab indstilling eller inden for indåndingszonen mens efterligne indånding betingelser.
Bestemmelse af aerosol deposition i vitro er vigtigt til undersøgelse af sundhedsvirkninger som følge af indånding. Indåndingszonen, området inden for 30 cm fra munden og næsen,14 er afgørende for forståelse eksponering for nanopartikler og linker til de biologiske virkninger i lungerne. 2 ofte, deposition på celler er defineret som en aflejring effektivitet, partikler deponeret på og taget af celler opdelt af partikler system6,15 eller på en masse grundlag af de samme beløb. 4 , 16 de nuværende metoder til måling af aerosoler i indåndingszonen er filter baseret, indfange partikler over en given stikprøveperioden og bruge filtre til at foretage yderligere test. 17 personlige overvågning kræver en lille system, der kommer med afvejning af færre prøver.
Der er mange tilgange til at bestemme de sundhedsmæssige virkninger af eksponering for en aerosol. ALI model giver mulighed for aerosol skal indgives direkte til celler gennem luften som en reel eksponeringsscenarie, men det er mere omkostningseffektivt og mindre tid på intensiv end in vivo undersøgelser mens efterligne luft-flydende hindringer såsom øjne, huden, og lunger. Lungeceller dyrkes i ALI har evnen til at generere en polariseret barriere lag,18,19 , som producerer fysiologiske træk, der ligner i vivo lunge epitel, herunder produktion af slim og overfladeaktivt stof i specifikke bronkial eller alveolær cellelinjer, cilia slå,19 stram vejkryds,19,20 og celle polarisering. 18 ændringer som disse kan påvirke det cellulære respons målt i undersøgelser af toksicitet. 21 desuden ALI i vitro model resultater er ofte mere følsomme end celler udsat via suspension modeller22 og er i stand til model akut i vivo toksicitet ved indånding. 23 , 24 derfor, en ALI eksponering system, der er i stand til at udføre målinger inden for indåndingszonen er et naturligt næste skridt.
Ved at udsætte celler til aerosol direkte ved kilden af emission, opstår undersøgelse af virkningerne af alle gasser, semi-flygtige forbindelser og partikler involveret i blandingen. Når blandingen er indsamlet på et filter, gasser og flygtige forbindelser er ikke fanget og hele blandingen kan ikke undersøges. Derudover kan rekonstituering af partikler i en pulver eller en flydende suspension føre til sammenlægning eller partikel-væske interaktioner, såsom opløsning, i flydende suspension. 25 , 26 når aerosol partikler føjes til væsken, der er en højere potentiale for byområdet,25,27 dannelse af et protein corona,28 eller interaktion med forbindelser i den væske, som kan påvirke deposition og påvirke den biologiske respons. 29 , 30
Eksponering på ALI er baseret på tre vigtigste aerosol profiler, cloud bilæggelse, parallelt flow og vinkelrette flow. Cloud afregning, anvendes af Air-Liquid Interface celle eksponering (ALICE),4 er et batchsystem hvor partikler deponere gennem gravitationel og diffusional afregning som aerosol behandles som én enhed. Parallelt flow, bruges til elektrostatiske Aerosol in vitro- eksponering System (TAGSKÆGGET)5 og multikultur eksponering kammer (MEC) II,6 giver mulighed for deposition gennem tilsætning af Brownske bevægelser gennem flow profil. Vinkelret på strømmen, anvendes af en microsprayer,7 Nano Aerosol kammer for In vitro-toksicitet (NACIVT),11 og kommercielle ALI systemer8,9,10,12, tilføjer impaction af partikler i regionen deposition. Mange af disse eksponering systemer er store og pladskrævende, kræver overskydende systemer for aerosol forudgående konditionering, pumper for strøm, eller endda varme kamre til inkubation af celler. Denne store størrelse falder portabilitet af systemet. I stedet for prøveudtagning direkte ved kilden af emission har disse systemer ofte prøver bringes til en lab eller model aerosoler genereret for analyse. Kompleksiteten af den udsendte aerosol kan gå tabt i oversættelsen fra feltet til laboratoriet. PIVEC er mindre end de nuværende systemer, med en ekstern areal af ca. 460 cm2 og vejer bare 60 gram, med varme og fugtighed kontrol indarbejdet i systemet giver mulighed for en yderst transportabel enhed. Nedsat størrelse og vægt Lad systemet være slidte eller taget til kilden til eksponering, tillader direkte prøveudtagning.
Den store størrelse af nuværende eksponering systemer reducerer også evnen til at udføre prøveudtagning for at undersøge rumlige forløb i koncentrationer. Denne beslutning er nøglen, når bestemmelse af toksikologiske effekter af mange potentielle miljømæssige og erhvervsbetingede risici såsom køreveje udstødning partikler sagen eller arbejdspladsen aktiviteter hvor aerosolization opstår. Straks efter emission, der bliver en rumlig varians i partikel koncentration. Dette vokser med tiden som partikler spredes i hele atmosfæren og disse effekter kan ændre baseret på de omgivende betingelser, såsom temperatur, tryk, vind og sol. Partikler kan begynder at alder og oxidere samt en gang udsendte31,32 og spredning satser påvirkes af topografi; højere koncentrationer vil blive fundet i kløfter og tunneller, hvor dispersion effekter er aftaget, og lavere koncentrationer kan findes hvor der er et stort område for spredning. 33 disse ændringer i dispersion satser kan have betydelige virkninger på menneskers sundhed og kan ses, når man sammenligner antallet af astmatiske voksne bor i urban versus i landdistrikterne indstillinger. 34 mens mange eksponering systemer giver flere prøver på én gang, flere systemer er nødvendigt med en overflod af store udstyr til at udføre rumlige opløsning.
Ved at bringe lab til feltet, kan tidspunktet for analyse være nedsat ved hjælp af hele cellen som en sensor. Følgende kendte biologiske mekanismer og slutpunkter kan støtte ved fastsættelsen af aerosol sammensætning og størrelse. På grund af langsom clearance metoder, herunder mucociliary clearance, fagocytose og omplantning, interagerer disse partikler ofte med celler i ca dage til uger3 generere oxidativ stress, betændelse og endda celledød. Disse biologiske slutpunkter kan være udgangspunktet for negative resultat veje for Kardiovaskulær sygdom eller kronisk obstruktiv lungesygdom. Derudover udførte Wiemenn et al. et array af in vitro- assays skal sammenlignes med litteratur værdier for kort sigt i vivo toksicitet ved indånding. 35 In vivo svar var forudsagt med to af fire positive resultater fra afprøvning cytotoksicitet via laktat dehydrogenase frigivelse, oxidativ stress fra glutathion reduktion og hydrogenperoxid dannelsen og frigivelse og betændelse potentielle fra tumor nekrose faktor alfa genet. Ud af ti nanosized metaloxider testet, seks testet som aktiv (titanium oxid, zinkoxid og fire forskellige cerium oxid) ved hjælp af engagementer in vitro med bekræftelse på vivo.
For at studere virkningerne af aerosoler i erhvervsmæssig omgivelser, udviklet vores lab PIVEC for engagementer i feltet. Derudover, PIVEC kan bæres for personlige prøveudtagning overvåge og undersøge indåndingseksponering som 37 mm filter kassette36 eller flere systemer kan bruges til at opnå rumlige opløsning inden for et givet område. I denne protokol gennemgås karakterisering og brug af PIVEC. Efter eksponering observeres de biologiske virkninger gennem cytotoksicitet assays.
Filterkassetter giver en enkel og billig metode til indsamling af aerosoler i indåndingszonen; dog aerosol prøver udvundet fra filtre ikke repræsenterer den hele aerosol (dvs. gasser, flygtige stoffer og partikler) og således begrænse vurderingen af relaterede biologiske virkninger. Ved hjælp af det oprindelige design af 37 mm filter kassette, er PIVEC designet til at opretholde portabiliteten skulle og efterligne i vivo aflejring af partikler fra indånding. PIVEC er væsentligt mindre end nuværende ALI …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Boris Solomonov og Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop for hjælp med rapid prototyping enheden. Forfatterne vil også gerne takke Cristian Romero-Fuentes af gruppen Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov og Virginia Commonwealth nanomaterialer Core karakterisering faciliteten for deres hjælp med partikel karakterisering. Dette arbejde blev støttet af startup midler til Dr. Lewinski fra College of Engineering på Virginia Commonwealth University.
Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
Resistive heater | |||
1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
Battery power bank | |||
Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |