Her presenterer vi en protokoll for å utføre bærbare mobilnettet aerosol eksponeringer og måle cellulær respons. Metoden bruker celler, dyrket i luft-flytende grensesnittet, etterligne i vivo fysiologi. Cellulær respons til kobber hydrogenion aerosoler ble observert som oksidativt stress gjennom reaktive oksygen arter generasjon og cytotoksisitet som laktat dehydrogenase utgivelse.
Denne protokollen introduserer et nytt i vitro eksponering system kan bæres, inkludert sin karakteristikk og ytelse. Air-flytende grensesnitt (ALI) in vitro eksponering-systemer er ofte store og klumpete, gjør transport til feltet og drift på kilden av utslipp eller sonen puste vanskelig. Gjennom miniatyrisering av disse systemene, kan laboratoriet bli brakt til feltet påskynde behandlingstid og gir en mer passende eksponering metode som ikke endrer aerosoler før du kontakter cellene. Bærbare In vitro eksponering kassett (PIVEC) tilpasser en 37 mm filter kassett å tillate i vitro toksisitet testing utenfor tradisjonelle laboratorium innstillingen. PIVEC var preget bruker tre størrelsene av kobber nanopartikler å avgjøre deponering effektivitet basert på gravimetric og partikkel nummer konsentrasjon analyse. Første cytotoksisitet eksperimenter ble utført med synlige lungekreft cellene for å fastslå muligheten for systemet å sette partikler samtidig opprettholde celle levedyktighet. PIVEC gir en lignende eller økt deponering effektivitet når sammenligne tilgjengelig vinkelrett flyt i vitro eksponering enheter. Til tross for lavere eksempel gjennomstrømningen gir den lille størrelsen noen fordeler gjeldende i vitro ALI eksponering systemer. Disse inkluderer muligheten til å brukes for personlig overvåking, mobilitet fra laboratoriet til kilden til utslipp, og muligheten til å sette opp flere systemer for romlig oppløsning samtidig opprettholde en lavere bruker koste. PIVEC er et system kan samle aerosoler i feltet med sonen puste på en luft-tilkobles, i vitro modellen.
Personlig prøvetaking med i vitro teknikker kan gi omfattende informasjon om biologiske effekter av aerosoler på arbeidsplassen. 1 for forurensninger i luften inkluderer eksponeringer til kjemiske, til luft utvalgene, under neddykket forhold hvor gassen er introdusert til celle suspensjon, intermitterende eksponeringer med en enhet som en rocker, eller direkte eksponeringer i luft-flytende grensesnittet (ALI). 2 mange av disse teknikkene utføres med celler dyrket i suspensjon eller innsamling av prøver før eksponering, hvorav hver kan påvirke toksikologiske studien på grunn av mulige endringer i aerosoler. 3 for å unngå disse endringene, laboratoriet kan bli brakt til feltet bruker flere i vitro ALI kultur eksponering systemer som brukes i litteratur,4,5,6,7, 8,,9,,10,,11,,12,,13 men få er kommersielt tilgjengelig. 8 , 9 , 12 disse systemene er ofte store, spesielt når inkludert instrumenter å regulere temperatur og fuktighet av mobilnettet miljø og flyt av prøven aerosoler. Ved hjelp av PIVEC, kan aerosol eksponeringer utføres utenfor en tradisjonell lab innstilling eller i sonen puste mens mimicking innånding forhold.
Fastsettelse av aerosol avsettelse i vitro er viktig å undersøke helseeffekter på grunn av innånding. Sonen puste området innenfor 30 cm fra munn og nese,14 er avgjørende for å forstå eksponering nanopartikler og for å koble til biologiske effekter i lungene. 2 ofte avsetning på celler er definert som en avsetning effektivitet, partikler avsatt på og tatt opp av cellene delt partikler administrert til systemet6,15 eller på masse basis av samme beløpene. 4 , 16 gjeldende metoder for måling aerosoler i sonen puste er filter basert, fange partikler over en gitt samplingsperiode og bruke filtre til å gjennomføre ytterligere testing. 17 personlig overvåking krever et lite system som følger med bakdelen av færre prøver.
Det er mange metoder å avgjøre helseeffekter fra eksponering for aerosol. ALI modellen gir aerosoler gis direkte til cellene til luften som en ekte eksponering scenario, men det er mer kostnadseffektiv og mindre tid intensive enn i vivo studier samtidig mimicking luft-flytende barrierer som øynene, huden og lungene. Lungekreft cellene vokst på ALI har muligheten til å generere en polarisert barriere lag,18,19 som produserer fysiologiske trekk som ligner i vivo lunge epitel, inkludert mucus og surfactant produksjon i spesifikke bronkial eller alveolar cellelinjer, flimmerhårene slo,19 stramt veikryss,19,20 og celle polarisering. 18 endre som dette kan påvirke den cellulær responsen målt i toksisitet studier. 21 i tillegg ALI i vitro modell resultater er ofte mer følsom enn celler utsatt via hjuloppheng modeller22 og er i stand til modell akutt i vivo innånding toksisitet. 23 , 24 derfor, en ALI eksponering system som kan utføre målinger i sonen puste er en naturlig neste steg.
Ved å utsette cellene aerosol direkte på kilden til utslipp, oppstår undersøkelse av effekten av alle gasser, semi flyktige forbindelser og partikler i blandingen. Når blandingen samles på et filter, gasser og flyktige forbindelser er ikke tatt, og hele blandingen kan ikke undersøkes. I tillegg kan rekonstituering partikler i et pulver eller en flytende suspensjon føre til samling eller partikkel-fluid interaksjoner, for eksempel oppløsningen, i flytende suspensjon. 25 , 26 når aerosol partikler legges til væske, det er en høyere potensial for agglomeration,25,27 dannelsen av protein corona,28 eller interaksjon med forbindelser i væsken, noe som kan påvirke avsettelse og påvirke de biologiske responsen. 29 , 30
Eksponering på ALI er basert på tre viktigste aerosol profiler, Sky bosetting, parallelle flyt og vinkelrett flyt. Sky bosetting, brukes av luft-flytende grensesnitt celle eksponering (ALICE),4 er en batch-systemet der partikler innskudd gjennom gravitasjons og diffusional bosetting som aerosoler behandles som én enhet. Parallell flyt, brukes av elektrostatisk Aerosol i vitro eksponering systemet (TAKSKJEGGET)5 og flerkulturalitet eksponering kammer (MEC) II,6 kan til deponi gjennom tillegg av Brownsk bevegelse gjennom flyt profilen. Vinkelrett flyt, brukes av en microsprayer,7 Nano forstøverkammeret for In Vitro toksisitet (NACIVT),11 og kommersielle ALI systemer8,9,10,12, legger impaction av partikler i regionen deponering. Mange av disse eksponering systemer er stor og klumpete, krever overflødig systemer for aerosol pre condition, pumper for strømmen, eller selv oppvarming kamre for inkubering av celler. Denne størrelsen reduseres portabilitet av systemet. I stedet for prøvetaking direkte på kilden til utslipp har disse systemene ofte prøver brakt til lab eller modell aerosoler generert for analyse. Kompleksiteten av slippes ut aerosoler kan gå tapt i oversettelse fra feltet til laboratoriet. PIVEC er mindre enn gjeldende systemer, med en ekstern areal på ca 460 cm2 og veie bare 60 gram, termisk og fuktighet kontroll innlemmet i systemet muliggjør en svært bærbar enhet. Redusert størrelse og vekt tillater systemet å bli slitt eller tatt til kilden for eksponering, tillater direkte prøvetaking.
Den store størrelsen på gjeldende eksponering systemer reduserer også muligheten til å utføre prøvetaking for å undersøke romlige graderinger i konsentrasjoner. Denne løsningen er nøkkelen når toksikologiske effekten av mange potensielle miljømessige og yrkesmessig farer som vehicular eksos partikler saken eller arbeidsplass aktiviteter hvor aerosolization forekommer. Umiddelbart etter utslipp, blir det en romlig varians i partikkel konsentrasjon. Dette vokser med tid som partikler spre seg i hele atmosfæren og disse effektene kan endre basert på forholdene, som temperatur, trykk, vind og sol. Partikler kan begynne å alder og oksidere også når slippes ut31,32 og spredningen priser påvirkes av topografi; høyere konsentrasjoner vil bli funnet i daler og tunneler, der spredning effekten er redusert, og lave konsentrasjoner finnes der det er et stort område for spredning. 33 disse endringene i spredningen priser kan ha betydelig effekt på menneskers helse og kan ses når sammenlignende mange astmatisk voksne bor i urbane versus i landlige omgivelser. 34 mange eksponering systemer gir flere eksempler på en gang, flere systemer er nødvendig med en overflod av store utstyr å utføre romlig oppløsning.
Ved å bringe laboratoriet til feltet, kan tidspunktet for analysen reduseres ved å bruke hele cellen som en sensor. Følgende kjente biologiske mekanismer og endepunkt kan hjelpe i fastsettelse av aerosol sammensetning og størrelse. På grunn av treg klaring metoder, inkludert mucociliary klaring og fagocytose translokasjon, er disse partiklene ofte samspill med celler i ca dager til uker3 generere oksidativt stress, betennelser og selv celledød. Disse biologiske endepunkt kan være utgangspunkt for negative resultatet trasé for hjerte-og karsykdommer eller kroniske hindrende lunge sykdom. I tillegg utført Wiemenn et al. en rekke i vitro analyser sammenligne med litteratur verdier for kort sikt i vivo innånding toksisitet. 35 I vivo svar ble spådd med to av fire positive resultater fra testing cytotoksisitet via laktat dehydrogenase utgivelse, oksidativt stress fra glutation reduksjon og hydrogenperoksid dannelse og utgivelsen og betennelser potensielle fra tumor nekrose faktor alpha genet. Ut av ti nanosized-metalloksider testet, seks testet som aktiv (Titan oksid, sink oksid og fire ulike cerium-oksid) bruke eksponeringer i vitro med bekreftelse i vivo.
For å studere virkningene av aerosoler i yrkesmessig omgivelser, utviklet vår lab PIVEC for eksponeringer i-feltet. I tillegg til PIVEC kan brukes for personlig prøvetaking overvåke og undersøke innånding som de 37 mm filter kassett36 eller flere systemer kan brukes til å oppnå romlig oppløsning innen et gitt område. I denne protokollen drøftes karakterisering og bruk av PIVEC. Etter eksponering, er biologiske effekter observert gjennom cytotoksisitet analyser.
Filteret kassetter gir en enkel og rimelig metode for å samle aerosoler i sonen puste; imidlertid aerosol eksempler Hentet fra filtre ikke representerer hele aerosoler (i.e. gasser, flyktige og svevestøv) og dermed begrense vurdering av relaterte biologiske effekter. Bruker den opprinnelige utformingen av 37 mm filteret kassetten, er PIVEC utformet for å opprettholde flyttbarhet og etterligne i vivo avsetning av partikler fra innånding. PIVEC er betydelig mindre enn gjeldende ALI eksponering systemer, omtren…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Boris Solomonov og Virginia Commonwealth innovasjon maskin butikken for hjelp med rapid prototyping enheten. Forfatterne vil også gjerne takke Cristian Romero-Fuentes av Lewinski Group, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov og Virginia Commonwealth nanomaterialer Core karakterisering anlegg for deres hjelp med partikkel karakterisering. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler formidles til Dr. Lewinski av College of Engineering ved Virginia Commonwealth University.
Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
Resistive heater | |||
1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
Battery power bank | |||
Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |