Summary
Ici nous présentons une méthode efficace pour étudier l'activité antifibrotique des cellules stromal humaines infusées par voie intraveineuse injectées obtenues du cordon ombilical entier suivant l'induction des dommages de poumon par une injection endotracheal de bleomycin dans C57BL /6 souris. Ce protocole peut être facilement étendu aux tests précliniques d'autres traitements.
Abstract
La fibrose pulmonaire est une caractéristique de plusieurs maladies pulmonaires humaines avec une étiologie différente. Étant donné que les thérapies actuelles sont plutôt limitées, les modèles de souris continuent d'être un outil essentiel pour développer de nouvelles stratégies antifibrotiques. Ici nous fournissons une méthode efficace pour étudier l'activité antifibrotique in vivo des cellules stromal mésenchymales humaines obtenues du cordon ombilical entier (hUC-MSC) en atténuant des dommages pulmonaires bleomycin-induits. Les souris C57BL/6 reçoivent une seule injection endotrachéale de bléomycine (1,5 U/kg de poids corporel) suivie d'une double perfusion de hUC-MSC (2,5 x 105) dans la veine de la queue, 24 h et 7 jours après l'administration de la bléomycine. Au sacrifice aux jours 8, 14, ou 21, les changements inflammatoires et fibrotiques, la teneur en collagène, et la présence de hUC-MSC dans le tissu pulmonaire explanté sont analysés. L'injection de bléomycine dans la trachée de la souris permet le ciblage direct des poumons, conduisant à une inflammation pulmonaire étendue et la fibrose. L'administration systémique d'une double dose de hUC-MSC a comme conséquence l'émoussement tôt des dommages de poumon bleomycin-induits. Le hUC-MSC infusé par voie intraveineuse est greffé transitoirement dans les poumons de la souris, où il exerce son activité anti-inflammatoire et antifibrotique. En conclusion, ce protocole a été appliqué avec succès pour l'essai préclinique de hUC-MSC dans un modèle expérimental de souris de la fibrose pulmonaire humaine. Cependant, cette technique peut être facilement étendue à la fois pour étudier l'effet de différentes substances administrées endotracheally sur la pathophysiologie des poumons et pour valider de nouvelles thérapies systémiques anti-inflammatoires et antifibrotiques.
Introduction
La fibrose pulmonaire est un processus pathologique progressif caractérisé par le dépôt excessif de composants de matrice extracellulaire, principalement le collagène de type I, dans l'interstitium pulmonaire, conduisant à une altération de la fonction pulmonaire. Il est la marque de plusieurs maladies pulmonaires humaines avec une étiologie différente et représente un facteur pronostique clinique pauvres. Étant donné que les thérapies actuelles sont plutôt limitées1, les modèles murins continuent d'être un outil essentiel à la fois pour la poursuite de l'étude des mécanismes pathogènes influençant l'évolution de l'évolution et de la progression de la maladie et pour le développement de nouveaux antifibrotic stratégies2,3.
Jusqu'ici, l'administration de la bleomycine a été le modèlele plus couramment appliqué de la fibrose pulmonaire expérimentalement induite 4. Outre les multiples méthodes d'accouchement (y compris les injections intraveineuses, intrapéritones, sous-cutanées et inhalantes), les injections intratrachéales ou endotrachéales de bléomycine sont apparues comme les voies les plus fréquemment utilisées4,5. La méthode que nous décrivons ici a été développée pour éviter l'effet brûlant de la bleomycine sur la muqueuse trachéale. En fait, en extériorisant la trachée et en la visualisant à l'aide d'un microscope opératoire, il est possible d'obtenir l'instillation de tout le volume de la solution de bléomycine directement dans les voies respiratoires inférieures sans aucun déversement dans les voies respiratoires supérieures. Lorsque l'expertise chirurgicale et l'instrumentation requises sont disponibles, cette méthode permet l'induction sûre, robuste et reproductible de l'inflammation pulmonaire et de la fibrose, comme indiqué ci-dessous.
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Protocol
Toutes les procédures de soins aux animaux et expérimentales ont été approuvées par le ministère italien de la Santé (autorisation n. 456/2016-PR) et effectuées conformément aux conventions de la Déclaration d'Helsinki.
1. Souris
- Après les avoir achetés, laisser les souris s'acclimater pendant au moins 7 jours avant l'injection.
REMARQUE : Les souris ont été logées dans l'établissement animalier dans des conditions exemptes d'agents pathogènes, ont été maintenues sous une température et une humidité constantes sur un cycle de 12 h de lumière/obscurité, et ont eu un accès gratuit à l'eau et à la nourriture standard pour granulés. - Utilisez des souris femelles C57BL/6 et injectez-les à l'âge de 12 à 16 semaines.
2. Injection endotrachéale de bléomycine
- Préparation de la bléomycine
CAUTION : D'après le Système mondial harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH), la bléomycine est classée comme un danger pour la santé du GHS08.- Préparer la bléomycine sous une hotte chimique.
- Pour obtenir la concentration de travail désirée (0,05 U/100 L), resuspendre 15 U de sulfate de bléomycine lyophilisée dans 30 mL de salin stérile.
- Mélanger soigneusement l'échantillon en inversant le tube pour éviter la formation de caillots.
- Étiquetez correctement le tube avec la date de la suspension, stockez-le à 4 oC et utilisez son contenu dans les 24 h.
- Avant l'instillation, équilibrez la solution de bléomycine à la température ambiante.
REMARQUE : Dans cette expérience, une dose simple de 1.5 U/kg poids corporel de la bleomycine a été employée pour induire des dommages de poumon dans les souris de C57BL/6. Néanmoins, chaque souche de souris a une sensibilité différente à la bléomycine6,7. La titration de la bléomycine doit être effectuée pour déterminer la dose optimale dans la souche de souris utilisée pour les expériences.
- Anesthésie
- Préparer l'anesthésie en dissolvant 0,2 g de 2,2,2-tribromoéthanol dans 9 ml de salin stérile et 1 ml d'éthanol absolu (à une concentration de travail de 20 mg/mL).
- Bien mélanger en inversant le tube pour éviter la formation de caillots.
- Étiquetez correctement le tube avec la date de préparation, rangez-le à 4 oC dans l'obscurité et utilisez-le dans les 3 jours.
- Anesthésiez les souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale de 250 l de solution de tribromoéthanol (à une dose finale de 200 mg/kg de poids corporel) par souris, à l'aide d'une seringue de 1 ml et d'une aiguille de 26 G.
REMARQUE: Avec cette dose, les souris sont inconscientes pendant au moins 20 min. Si nécessaire, ajuster la dose en fonction de la réponse de la souris, en consultation avec le vétérinaire. - Surveillez la respiration de la souris. Le taux de respiration ralentira légèrement. Après quelques minutes, pincez l'un des pieds de souris pour vérifier l'absence de réflexe de pédale.
- Injection endotrachéale
- Maintenir des conditions aseptiques pendant toute la procédure. Utilisez des instruments et des matériaux chirurgicaux stériles, portez des gants stériles et évitez tout contact avec une surface non stérile.
- Allongez la souris anesthésiée sur le dos sur une plate-forme chirurgicale et maintenez-la en place en fixant délicatement ses jambes avec des bandes de ruban adhésif chirurgical.
REMARQUE : Il est recommandé d'enregistrer doucement les pattes de souris pour éviter que la souris ne glisse loin de la plate-forme chirurgicale pendant sa rotation (étape 2.3.10). - Placer la souris sur le tapis chauffé pour maintenir la température rectale stable à 37 oC tout au long de l'intervention. Mesurer la température rectale à l'une de sessons rectales.
- Étendre doucement le cou de la souris en plaçant un "pillow", par exemple, un rouleau de coton dentaire, sous sa région cervicale.
- Raser doucement la gorge avec une lame de rasoir.
- Retirer les cheveux de la zone chirurgicale avec de l'alcool et désinfecter la peau de la souris à plusieurs reprises avec 1% povidone-iode solution.
- Pincer la peau avec une paire de forceps anatomiques et faire une courte incision dans la correspondance du muscle sternohyoid souris, en utilisant une paire de cerclé, ciseaux émoussés courbés.
REMARQUE : L'incision de la peau est d'environ 0,5 cm de longueur. Le morceau de peau correspondant qui est enlevé est si petit qu'il ne créera aucune tension dans le cou de la souris. - Arrêtez le saignement avec des bâtons de coton.
- Extériez la trachée par dissection émoussée, en la nettoyant délicatement à partir de graisse et d'autres tissus.
- Faites pivoter la plate-forme chirurgicale pour orienter la souris avec sa tête vers l'opérateur.
REMARQUE : Cette position permet à l'opérateur, pendant l'injection, d'incliner la seringue de sorte qu'elle suive le chemin naturel de la trachée directement vers les poumons. - Placez la souris sous un microscope d'opération pour aider à la visualisation de la trachée. Ajuster l'éclairage et régler le grossissement (entre 1 et 1,2), la mise au point et la netteté. La trachée peut être facilement distinguée comme un tube translucide blanc, et les anneaux trachéaux sont clairement visibles.
- Mélanger la solution de bléomycine en pipetilage doucement, et aspirer 100 L dans une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 25 G, en évitant la formation de bulles.
- Une fois la trachée clairement visualisée, perforez soigneusement avec la pointe de l'aiguille à un angle de 30 degrés (Figure 1A).
- Inculquez lentement 100 l de bléomycine ou de salin stérile (contrôle du véhicule) directement dans le lumen de la trachée. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que le volume entier se déplace vers le bas de l'aiguille, puis retirez-la de la trachée.
- Observez quelques secondes d'apnée, qui se produit lorsque l'aiguille est correctement insérée dans la trachée de sorte que la souris inhale immédiatement tout le volume du liquide.
- Si la souris n'inhale pas le liquide, surveillez soigneusement sa respiration et ajustez la position de l'aiguille. Si la souris cesse de respirer, retirez immédiatement l'aiguille et laissez la souris reprendre sa respiration normalement avant de la réinsérer.
- Jetez en toute sécurité la seringue et l'aiguille après l'injection.
- Fermer le fascia sous-cutané et la plaie cutanée avec une suture absorbable 5-0.
REMARQUE : Lorsqu'il n'est pas complètement réabsorbé, enlever les sutures 7-10 jours après la chirurgie.
- Récupération animale
- Placez la souris injectée sur le côté sur un coussin chauffant pour la récupération.
- Surveillez la respiration de la souris et observez la souris jusqu'à ce qu'elle commence à bouger et retrouve la charge sternale et la pleine conscience.
- Une fois qu'il est confirmé que la souris est en bon état, retournez-la dans la cage d'origine. Ne le retournez pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
- Afin d'assurer une analgésie prolongée et d'éviter toute douleur post-interventionnelle résiduelle, administrez sous-cutanée ment buprénorphine (à une dose finale de 0,05 mg/kg de poids corporel) à la souris tous les 12 h après l'injection endotrachéale.
- Examinez les souris pendant 24 h après l'injection endotrachéale de bléomycine et faites-le deux fois par jour. Surveillez les souris pour la détresse respiratoire, la perte de poids, les anomalies de comportement, et pour tout signe de morbidité.
3. Infusion de veine de queue des cellules stromal de moelle ombilical humaines
- Préparation cellulaire
REMARQUE : L'isolement, la caractérisation, et la culture des cellules stromal mésenchymales du cordon ombilical humain a été précédemment décrit8,9,10. hUC-MSC doit être aseptiquement manipulé et infusé; par conséquent, effectuer toutes les étapes sous une hotte stérile.- Étendre le hUC-MSC en flacons de culture de 75 cm2 jusqu'aux premiers passages (1 à 3 maximum).
REMARQUE : Le hUC-MSC devrait être 70% confluent le jour de leur infusion dans les souris. - Laver les cellules avec 10 ml de saline stérile tamponnée par phosphate (PBS) à température ambiante.
- Ajouter 2 ml de trypsine et incuber les cellules à 37 oC pendant environ 1 min, jusqu'à ce qu'elles commencent à se détacher.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 8 mL de hUC-MSC milieu complet contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Recueillir les cellules par centrifugation à 350 x g pendant 10 min.
- Resuspendre la pastille dans la saline stérile et compter les cellules à l'aide d'une chambre de B.Rker. Préparer la suspension cellulaire pour l'infusion en diluant les cellules à une concentration finale de 2,5 x 105 dans 200 L de salin stérile par souris. Préparer une suspension cellulaire excédentaire pour s'assurer qu'il y a assez de volume pour infuser toutes les souris.
- Gardez les cellules sur la glace avant l'infusion. Infuser en quelques heures, tel que décrit à la section 3.3.
- Étendre le hUC-MSC en flacons de culture de 75 cm2 jusqu'aux premiers passages (1 à 3 maximum).
- Anesthésie
REMARQUE : Afin de minimiser le risque d'endommager la veine de la queue de la souris pendant l'injection, la souris ne doit pas bouger. Par conséquent, l'anesthésie a été préférée à la simple retenue de souris.- Anesthésier les souris par 4% inhalation d'isoflurane dans une chambre d'induction.
- Surveillez la respiration de la souris. Le taux de respiration ralentira légèrement. Après quelques minutes, pincez l'un des pieds de souris pour vérifier l'anesthésie appropriée.
- Infusion de veine de queue
- Une fois que l'inconscience a été confirmée, placez la souris sous une hotte stérile pour l'infusion intraveineuse aseptique de hUC-MSC.
- Maintenir l'anesthésie générale tout au long de l'expérience via un masque facial avec un flux continu de 1,5% isoflurane.
- Pour favoriser la vasodilatation et faciliter l'injection, trempez la queue de la souris dans de l'eau chaude pendant 2 min.
- Mélanger la suspension cellulaire en pipetilage doucement pour s'assurer que les cellules ne forment pas des amas. Aspirez 200 l dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G, évitant ainsi la formation de bulles.
- Tenez la queue de la souris près de la pointe et redressez-la doucement.
- Localiser la veine latérale de la queue de la souris; gratter délicatement avec un scalpel et l'essuyer avec 70% d'éthanol.
REMARQUE : Le grattage doux de la queue est effectué pour enlever les cheveux, ce qui rend le site d'injection plus lisse et plus propre. - À partir de la partie distale de la queue, insérez l'aiguille dans la veine à un angle de 15 degrés et infusez lentement 200 L de hUC-MSC ou salin stérile (contrôle du véhicule) (Figure 1B).
- Surveillez l'infusion intraveineuse réussie par le liquide entrant dans la veine sans résistance et par un manque d'extravasation. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que le volume entier se déplace vers le bas de l'aiguille, puis retirez-la de la veine.
- Pour éviter les saignements, appliquez brièvement une pression sur la plaie d'entrée avec une gaze stérile.
- Jetez en toute sécurité la seringue et l'aiguille après l'infusion.
- Récupération animale
- Placez la souris infusée sur le côté sur un coussin chauffant pour la récupération.
- Surveillez la respiration de la souris et observez la souris jusqu'à ce qu'elle commence à bouger et retrouve la charge sternale et la pleine conscience.
- Une fois qu'il est confirmé que la souris est en bon état, retournez-la dans la cage d'origine. Ne le retournez pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
- Examiner les souris pendant 24 h après l'infusion de veine de queue et tous les deux jours, pour surveiller leur état de santé et détecter n'importe quelle souffrance ou signe pathologique tôt.
4. Explantation d'organes et traitement des tissus
- Sacrifiez les souris aux jours 8, 14, ou 21 après l'administration de bleomycine (figure 1C) par surdose d'anesthésique injectable.
- Acciser la trachée et les poumons et les laver immédiatement dans du PBS glacé.
- Congelez les poumons droits dans de l'azote liquide et entreposez-les à -80 oC pour une analyse moléculaire subséquente10.
- Gonflez les poumons gauches avec 4 % de paraformaldéhyde et fixez-les dans une solution formaline à tampon neutre de 10 % pendant 24 h; puis, les déshydrater dans la série d'alcool classé, les effacer en xylène, et les intégrer dans la paraffine10.
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Representative Results
Les dommages de poumon ont été induits par une injection endotrachéale simple de 1.5 U/kg poids corporel du sulfate de bleomycin dans 100 l de saline stérile. Les animaux témoins ont reçu une injection endotrachéale d'un volume égal de saline. Deux plans de hUC-MSC (2,5 x 105 sur 200 l de saline stérile) ont été infusés dans la veine de la queue de la souris, 24 h et 7 jours après l'administration de la bléomycine. Les animaux témoins ont reçu une perfusion intraveineuse d'un volume égal de salin stérile. Les souris ont été sacrifiées pour le traitement des poumons et des tissus aux jours 8, 14 et 21 après l'administration de la bléomycine (figure 1).
Nous avons démontré qu'une instillation directe de la bléomycine dans la trachée de souris a permis une diffusion rapide vers les poumons, ayant pour résultat l'inflammation étendue, la fibrose progressive, et une distorsion de leur architecture normale, uniformément avec des études antérieures 11. Les changements histopathologiques pulmonaires ont été évalués par l'hématoxyline-éosine (H et E) et la coloration rouge picrosirius10, et la fibrose a été confirmée par une teneur accrue en hydroxyproline et dépôt de collagène (figure 2). Les changements inflammatoires dans le tissu ont été évalués par un système de notation histologique basé sur l'infiltration inflammatoire autour des bronchioles, des bronches, et des vaisseaux sanguins, et la pneumonie interstitielle observée dans les sections souillées d'hématoxylin-éosin eosin10. Après l'injection de bléomycine, le score Ashcroft des sections pulmonaires a progressivement augmenté d'une valeur moyenne de 1,5 au jour 8 à une valeur moyenne de 4,5 au jour 14 et de 6,5 au jour 2110. La double perfusion de hUC-MSC dans la veine de queue de souris a en grande partie atténué des dommages pulmonaires induits par la bléomycine, avec une réduction significative, mais pas l'abrogation complète, de l'infiltration inflammatoire et de l'étendue de la fibrose à chaque moment ( Figure 2). Immunostaining avec des anticorps spécifiques10 a montré que le hUC-MSC infusé a rapidement et efficacement atteint les poumons de souris, bien que seulement quelques cellules aient été détectées, avec un nombre décroissant du jour 8 au jour 21 (figure 3). Comme précédemment rapporté12,ces données suggèrent une dislocation rapide des cellules du site des dommages, en dépit de leur effet protecteur prolongé. La coloration d'immunohistochimie (IHC) de hUC-MSC a été exécutée, également dans les échantillons salin-traités, mais aucune cellule n'a pu être détectée, étant donné l'absence de foyers inflammatoires attirant hUC-MSC.
Figure 1 : Schéma du protocole expérimental. (A) Les souris ont reçu une seule injection endotrachéale (e.t.) de 1,5 U/kg de poids corporel de la bléomycine pour induire des lésions pulmonaires (jour 0). (B) Une double perfusion intraveineuse (i.v.) de 2,5 x 105 cellules stromal mésenchymales humaines obtenues à partir du cordon ombilical entier (hUC-MSC) a été exécutée 24 h (jour 1) et 7 jours (jour 7) après l'administration de bleomycine. (C) Une chronologie des injections et des moments de sacrifice est montrée ici. Les groupes de souris ont été sacrifiés aux jours 8, 14, et 21 après l'administration de bleomycine (c.-à-d., 24 h, 7 jours, et 14 jours après la deuxième perfusion de hUC-MSC, respectivement). Ce chiffre a été modifié à partir de Moroncini et al. 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : HUC-MSC downregulate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. (A et B) Images microscopiques représentatives (10x grossissement) de l'hématoxyline-éosine (H et E) et de la coloration rouge picrosirius de sections pulmonaires obtenues à partir de souris C57BL/6, 21 jours après l'injection endotrachéale de saline stérile (saline) ou de bléomycine (bleomycine), le plus tard a également suivi une perfusion intraveineuse de hUC-MSC (bleomycin-hUC-MSC) ou saline stérile (bleomycin-saline). Les contrôles salins ont démontré l'architecture normale de poumon. Des infiltrations inflammatoires répandues ont été observées 21 jours après la blessure de bleomycine, avec une distorsion grave de l'architecture pulmonaire et de la formation des foyers fibrotiques. Les altérations induites par la bléomycine ont été significativement atténuées par le traitement hUC-MSC mais pas par saline. (C) Contenu d'hydroxyproline aux jours 8, 14, et 21 dans les poumons des souris c57BL/6 qui ont reçu les traitements mentionnés ci-dessus. Les résultats sont la moyenne de la DD (n - 8 par groupe), exprimée en pourcentage de la valeur obtenue à partir de souris traitées à la saline endotrachéale et sont représentatives de trois expériences indépendantes. P et lt; 0,05,P et Lt; 0,01, par rapport aux souris traitées à la bléomycine. (D) Niveaux d'expression de souris Col1A1 dans l'ARNm de poumon entier obtenu aux jours 8, 14, et 21 des souris c57BL/6 qui ont reçu les traitements mentionnés ci-dessus. Les résultats sont la moyenne de La DD (n - 5 par groupe) et sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées en triple. P et lt; 0,05,P et Lt; 0,01, par rapport aux souris traitées à la bléomycine. Ce chiffre a été modifié à partir de Moroncini et al. 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Détection du hUC-MSC dans les tissus pulmonaires. (A et B) Images microscopiques représentatives (200x et 400x grossissement, respectivement) de l'immunostaining avec l'anticorps anti-HLA-1 des sections pulmonaires obtenues des souris c57BL/6 recevant la bléomycine endotrachéale suivie de la bléomycine intraveineuse hUC-MSC. Les flèches rouges indiquent hUC-MSC positif-taché. (C) Human GAPDH évalué par réaction quantitative en temps réel de la chaîne de polymérase (PCR) dans l'ARNm entier extrait du hUC-MSC cultivé avant l'infusion (hUC-MSC infusée) ou du tissu pulmonaire aux jours 8, 14, et 21 des souris de C57BL/6 recevant endotracheal la bleomycine suivie du hUC-MSC intraveineux (bleomycin-hUC-MSC). Les résultats sont la moyenne de La DD (n - 5 par groupe) et sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées en triple. Il convient de noter que la source de la transcription humaine DE GAPDH dans ce protocole expérimental peut être fournie exclusivement par le hUC-MSC infusé par voie intraveineuse. Ce chiffre a été modifié à partir de Moroncini et al. 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'administration endotrachéale est la voie préférentielle pour la livraison d'agents exogènes dans les poumons. Depuis plusieurs années, l'injection directe de bléomycine dans la trachée a été largement utilisée pour induire la fibrose pulmonaire13 et, récemment, des techniques plus avancées et non invasives ont été développées pour accomplir ce14,15 ,16.
La méthode décrite ici offre plusieurs avantages significatifs par rapport à certaines limitations potentielles. L'injection de la trachée nécessite une intervention chirurgicale, portant avec elle le potentiel de complications causées par la procédure elle-même, ainsi que la nécessité d'une sédation animale profonde. Par conséquent, une bonne préparation et la pratique dans le perfectionnement de la procédure sont nécessaires. En outre, pour minimiser la souffrance de la souris, il est impératif de définir la dose appropriée d'anesthésique en fonction de la souche de la souris et à la réponse individuelle et de maintenir une observation rigoureuse de l'état de sédation animale. Néanmoins, nous avons observé un taux très bas de mortalité et le rétablissement optimal d'animal de l'anesthésie. La kétamine et la xylazine peuvent être utilisées pour l'anesthésie, ainsi que le tribromoéthanol. Cependant, chez la souris, la dose efficace de kétamine et de xylazine est proche de la dose létale; ainsi, ils peuvent facilement induire un arrêt respiratoire. Inversement, le dosage du tribromoéthanol peut être facilement ajusté et est donc un agent anesthésique préférable. Après l'injection endotracheal de la bléomycine dans la trachée, nous n'avons observé aucun effet défavorable. Les souris étaient exemptes de fièvre et aucun signe d'inflammation ou d'infection n'a été observé autour de la trachée et de la blessure de peau. Par conséquent, il n'y avait aucun besoin de prophylaxie antibiotique. En outre, l'utilisation d'un microscope opératoire assure une grande confiance de succès en permettant à l'opérateur de surveiller avec précision le placement correct de l'aiguille dans la trachée de la souris avant l'instillation, minimisant ainsi le risque de l'endommager.
L'injection endotrachéale de bléomycine entraîne une réponse inflammatoire et fibrotique puissante dans les deux poumons et peut être considérée comme une méthode robuste pour générer des modèles expérimentaux de souris des maladies pulmonaires interstitielles humaines (ILD). Cependant, comme précédemment documenté7, la réponse fibrotique à la bleomycine chez les souris est souche-dépendante et sexe- et âge-connexe. Par conséquent, il est essentiel au succès du protocole de trouver la dose tolérable de la bléomycine dans chaque cadre expérimental. Des souris femelles ont été employées dans cette étude parce que l'intérêt principal dans cette recherche était la maladie pulmonaire interstitielle liée à la sclérose systémique, qui est une maladie largement répandue dans de jeunes femelles adultes. Des souris de trois à quatre mois ont été choisies parce que c'est l'âge auquel elles entrent juste dans la phase adulte (les souris atteignent la maturité sexuelle à 8-12 semaines d'âge)17. Ainsi, ils sont considérés comme de jeunes souris adultes et sont préférables aux animaux plus jeunes, puisque la fibrose pulmonaire n'est pas fréquente chez les très jeunes individus. Ils sont également préférables aux animaux plus âgés puisque les études précédentes18 ont démontré que les souris âgées ont montré des altérations dans le phénotype de fibroblaste de poumon, menant à une susceptibilité accrue au délabrement et à la fibrose après des dommages de poumon, qui pourrait représenter un biais possible dans le modèle expérimental présenté ici.
L'infusion de veine de queue est un moyen simple, fiable et non invasif d'assurer l'administration rapide et efficace des médicaments à la circulation sanguine. Il peut être facilement exécuté avec l'équipement médical simple, la formation manuelle courte, et les coûts réduits.
Le protocole expérimental décrit ici, modifié à partir d'études publiées précédemment19,20,21, existe d'une double perfusion intraveineuse de 2,5 x 105 hUC-MSC pour améliorer l'engraftment cellulaire dans la souris les poumons et leur effet thérapeutique. En fait, puisque la procédure est non traumatique, elle peut être répétée chez le même animal, mais une période de 7 jours entre deux injections consécutives est recommandée, pour permettre la réparation d'éventuelles plaies vasales. En outre, nous avons utilisé l'inhalation d'isoflurane pour anesthésier les souris C57BL/6 pendant la procédure, pour éviter les dommages de veine de queue en cas de mouvements animaux soudains.
En conclusion, ce protocole a été appliqué avec succès pour induire efficacement la fibrose pulmonaire chez les souris C57BL/6 et pour valider l'effet antifibrotique in vivo de hUC-MSC. Cette méthode peut également être utilisée pour l'administration de médicaments ou d'agents autres que la bléomycine dans les voies respiratoires, afin de générer différents modèles expérimentaux de maladies pulmonaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention RF-2011-02352331 de Ministero Italiano della Salute (à Armando Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
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