Summary
Her præsenterer vi en effektiv metode til at undersøge den anti fibrotiske aktivitet af intravenøst inanvendte humane mesenchymale stromale celler opnået fra hele navlestrengen efter induktion af lungeskade ved en endotracheal tubus injektion af bleomycin i C57BL /6 mus. Denne protokol kan let udvides til den prækliniske testning af andre terapeutiske midler.
Abstract
Pulmonal fibrose er kendetegnende for flere menneskelige lungesygdomme med en anden ætiologi. Da de nuværende terapier er ret begrænsede, er musemodeller fortsat et vigtigt redskab til udvikling af nye antifibrotiske strategier. Her giver vi en effektiv metode til at undersøge in vivo anti fibrotisk aktivitet af humane mesenchymal stromale celler opnået fra hele navlestrengen (HUC-msc) i formildende bleomycin-induceret lungeskade. C57BL/6-mus får en enkelt endotracheal tubus injektion af Bleomycin (1,5 e/kg legemsvægt) efterfulgt af en dobbelt infusion af hUC-MSC (2,5 x 105) i hale vene, 24 timer og 7 dage efter administration af bleomycin. Ved offer på dag 8, 14, eller 21, inflammatoriske og fibrotiske ændringer, kollagen indhold, og hUC-MSC tilstedeværelse i explanted lungevævet analyseres. Injektion af bleomycin i muse luftrøret muliggør direkte målretning af lungerne, hvilket fører til omfattende lungebetændelse og fibrose. Den systemiske administration af en dobbelt dosis af HUC-MSC resulterer i den tidlige sløvhed af den bleomycin-inducerede lungeskade. Intravenøst inbrugt hUC-MSC er forbigående indpodet i mus lunger, hvor de udøver deres anti-inflammatoriske og antifibrotisk aktivitet. Afslutningsvis, denne protokol er blevet anvendt med succes for den prækliniske testning af hUC-MSC i en eksperimentel musemodel af human pulmonal fibrose. Men denne teknik kan let udvides både til at studere virkningen af forskellige endotracheally administrerede stoffer på Patofysiologi af lungerne og til at validere nye anti-inflammatoriske og antifibrotiske systemiske behandlinger.
Introduction
Pulmonal fibrose er en progressiv patologisk proces karakteriseret ved overdreven aflejring af ekstracellulære matrixkomponenter, hovedsagelig type I kollagen, i lunge interstitiumet, hvilket fører til nedsat lungefunktion. Det er kendetegnende for flere menneskelige lungesygdomme med en anden ætiologi og repræsenterer en dårlig klinisk prognostisk faktor. Da de nuværende terapier er ret begrænsede1, er musemodeller fortsat et vigtigt redskab både til yderligere undersøgelse af de sygdomsfremkaldende mekanismer, der påvirker sygdommens indtræden og progression, og til udvikling af nye antifibrotiske strategier2,3.
Til dato, administration af bleomycin har været den mest almindeligt anvendte model af eksperimentelt induceret pulmonal fibrose4. Ved siden af flere leveringsmetoder (herunder intravenøs, intraperitoneal, subkutan og inhalationel) er intratrakeal eller endotracheal tubus injektioner af bleomycin dukket op som de hyppigst anvendte veje4,5. Den metode, som vi beskriver heri, er blevet udviklet for at undgå skalding effekten af bleomycin på trakeal slimhinden. I virkeligheden, ved at uddrive luftrør og visualisere det gennem et opererende mikroskop, er det muligt at opnå instillation af hele volumenet af bleomycin opløsning direkte i den nedre luftvejene uden spild i de øvre luftveje. Når den nødvendige kirurgiske ekspertise og instrumentering er til rådighed, denne metode giver mulighed for sikker, robust og reproducerbar induktion af lungebetændelse og fibrose, som rapporteret nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyresundheds-og forsøgsprocedurer blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (autorisation n. 456/2016-PR) og udført i henhold til erklæringen fra Helsingfors-konventionerne.
1. mus
- Når du har købt dem, skal du lade musene acclimere i mindst 7 dage før injektionen.
Bemærk: mus blev anbragt i dyreanlægget under patogenfrie forhold, blev opretholdt under konstant temperatur og fugtighed på en 12 h lys/mørk cyklus, og fik fri adgang til vand og standard pellet mad. - Brug kvindelige C57BL/6-mus og Injicer dem i alderen 12 til 16 uger.
2. endotracheal injektion af bleomycin
- Tilberedning af bleomycin
Forsigtig: på grundlag af det globalt harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) klassificeres bleomycin som en GHS08 sundhedsrisiko.- Forbered bleomycin under en kemisk hætte.
- For at opnå den ønskede arbejds koncentration (0,05 U/100 μL), resuspension 15 e af lyofiliseret bleomycin sulfat i 30 mL sterilt saltvand.
- Bland forsigtigt prøven ved at invertere røret for at undgå koageldannelse.
- Mærk røret korrekt med datoen for opslæmning, Opbevar det ved 4 °C, og brug dets indhold inden for 24 timer.
- Før inddrypningen skal opløsningen af bleomycin til stuetemperatur.
Bemærk: i dette eksperiment blev en enkelt dosis på 1,5 e/kg legemsvægt af bleomycin anvendt til at inducere lungeskade i C57BL/6 mus. Ikke desto mindre, hver mus stamme har en anden følsomhed over for bleomycin6,7. Titrering af bleomycin skal udføres for at bestemme den optimale dosis i muse stammen, der anvendes til forsøgene.
- Anæstesi
- Forbered anæstesi ved at opløse 0,2 g 2, 2, 2-tribromoethanol i 9 mL sterilt saltvand og 1 mL absolut ethanol (ved en arbejds koncentration på 20 mg/mL).
- Bland grundigt ved at invertere røret for at undgå koageldannelse.
- Mærk røret korrekt med tilberedningsdatoen, Opbevar det ved 4 °C i mørke, og brug det inden for 3 dage.
- Anæstetiserer musene med en intraperitoneal injektion på 250 μL tribromoethanol opløsning (ved en sidste dosis på 200 mg/kg legemsvægt) pr. mus ved hjælp af en 1 mL sprøjte og en 26 G nål.
Bemærk: med denne dosis er musene bevidstløs i mindst 20 minutter. Når det er nødvendigt, justere dosis i henhold til muse respons, i samråd med dyrlægen. - Overvåg musen vejrtrækning. Respirationshastigheden vil aftage lidt. Efter et par minutter, knibe en af musen fødder til at kontrollere manglen på pedal refleks.
- Endotracheal injektion
- Opretholde aseptiske forhold under hele proceduren. Brug sterile kirurgiske instrumenter og materialer, bær sterile handsker og undgå kontakt med enhver ikke-steril overflade.
- Læg den bedøvede mus på ryggen på en kirurgisk platform og hold den på plads ved forsigtigt at fastgøre benene med kirurgiske tape strimler.
Bemærk: skånsom tapning af muse ben anbefales for at undgå, at musen glider væk fra Operations platformen under dens rotation (trin 2.3.10). - Placer musen på opvarmet måtten for at holde rektal temperaturen stabil ved 37 °C i hele interventionen. Måle rektal temperaturen ved en rektal sonde.
- Forsigtigt hyperextend muse halsen ved at placere en "pude", for eksempel en dental bomuld roll, under sin cervikale region.
- Barberer forsigtigt halsen med et barberblad.
- Fjern håret fra operationsområdet med alkohol og Desinficer muse huden flere gange med 1% povidon-jod-opløsning.
- Knib huden med et par anatomiske pincet og lav et kort snit i korrespondance af musens sternohyoide muskler ved hjælp af et par ring-håndteret, buet stump saks.
Bemærk: indsnit i huden er omkring 0,5 cm i længden. Den tilsvarende hud stykke, som er fjernet er så lille, at det vil skabe nogen spænding i muse halsen. - Stop blødningen med bomuldsuld pinde.
- Rengør luftrør med stump dissektion, forsigtigt rense det fra fedt og andre væv.
- Drej den kirurgiske platform for at orientere musen med hovedet mod operatøren.
Bemærk: denne position gør det muligt for operatøren, under injektionen, at vinkle sprøjten, så den følger den naturlige vej til luftrøret direkte til lungerne. - Placer musen under et opererede mikroskop for at hjælpe med visualisering af luftrøret. Juster belysningen, og Indstil forstørrelsen (mellem 1 og 1,2), fokus og skarphed. Luftrør kan let skelnes som en hvid gennemskinnelige rør, og trakeal ringene er tydeligt synlige.
- Bland bleomycin-opløsningen ved forsigtigt at pipettere, og Aspirér 100 μL til en 0,5 mL sprøjte med en 25 G nål, der undgår bobledannelse.
- Når luftrør i klart visualiseret, forsigtigt punktere det med nålen spidsen i en vinkel på 30 ° (figur 1a).
- Indlever langsomt 100 μL bleomycin eller sterilt saltvand (køretøjets kontrol) direkte ind i luft luftrens lumen. Vent et par sekunder, indtil hele lydstyrken bevæger sig ned ad nålen, og fjern den derefter fra luftrøret.
- Observere et par sekunder af apnø, som opstår, når nålen er korrekt indsat i luftrøret, så musen straks vil inhalere hele volumenet af væsken.
- Hvis musen ikke inhalerer væsken, omhyggeligt overvåge sin vejrtrækning og justere nålen position. Hvis musen holder op med at trække vejret, skal du straks fjerne nålen og lade musen genoptage vejrtrækningen normalt, før du genindsætter den.
- Kassér sprøjten og nålen på sikker vis efter injektionen.
- Luk den subkutane fascia og hudsåret med en 5-0 absorberbar sutur.
Bemærk: når det ikke er helt reabsorberet, fjernes suturer 7-10 dage efter operationen.
- Genvinding af dyr
- Placer den injicerede mus på sin side på en varmepude til nyttiggørelse.
- Overvåg musen vejrtrækning og observere musen, indtil den begynder at bevæge sig og genvinder brystbenet recumbency og fuld bevidsthed.
- Når det er bekræftet, at musen er i god stand, returnere den til den oprindelige bur. Må ikke returnere det til selskabet af andre dyr, indtil det er fuldt tilbagebetalt.
- For at sikre langvarig analgesi og undgå eventuelle resterende post-interventionelle smerter, indgives subkutant buprenorphin (i en endelig dosis på 0,05 mg/kg legemsvægt) til mus hver 12 h post endotracheal tubus injektion.
- Undersøg musene i 24 timer efter endotracheal tubus injektion af bleomycin og gør det to gange om dagen. Overvåg musene for åndedrætsbesvær, vægttab, adfærd abnormiteter, og for ethvert tegn på sygelighed.
3. hale vene infusion af human navlestrengen mesenchymal stromale celler
- Celle præparat
Bemærk: isolering, karakterisering, og dyrkning af mesenchymal stromale celler fra menneskelige navlestrengen har tidligere været beskrevet8,9,10. hUC-MSC bør aseptisk manipuleres og inanvendes; Udfør derfor alle trin under en steril hætte.- Udvid hUC-MSC i 75 cm2 kultur kolber til tidlige passager (1 – 3 maksimum).
Bemærk: hUC-MSC bør være 70% konflydende på dagen for deres infusion i mus. - Cellerne vaskes med 10 mL steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 2 mL trypsin, og cellerne inkuberes ved 37 °C i ca. 1 min., indtil de begynder at løsne sig.
- Der neutraliseres trypsin ved tilsætning af 8 mL hUC-MSC komplet medium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS).
- Cellerne opsamles ved centrifugering ved 350 x g i 10 minutter.
- Resuspension pellet i steril saltvand og tælle cellerne ved hjælp af en Bürker kammer. Cellesuspensionen forberedes til infusion ved fortynding af cellerne til en endelig koncentration på 2,5 x 105 i 200 μl steril saltvand pr. mus. Forbered en overskydende cellesuspension for at sikre, at der er nok volumen til at inficere alle mus.
- Opbevar cellerne på is før infusionen. Inden for få timer, som beskrevet i afsnit 3,3.
- Udvid hUC-MSC i 75 cm2 kultur kolber til tidlige passager (1 – 3 maksimum).
- Anæstesi
Bemærk: for at minimere risikoen for beskadigelse af muse hale vene under injektionen må musen ikke bevæge sig. Derfor anæstesi har været foretrukket over simple mus fastholdelsesanordninger.- Anæstetisere musene med 4% isofluran indånding i et induktions kammer.
- Overvåg musen vejrtrækning. Respirationshastigheden vil aftage lidt. Efter et par minutter skal du knibe en af muse fødderne for at kontrollere, om der er korrekt anæstesering.
- Hale vene infusion
- Når bevidstløshed er blevet bekræftet, skal du placere musen under en steril hætte til den aseptiske hUC-MSC intravenøs infusion.
- Opretholde generel anæstesi gennem hele eksperimentet via en ansigtsmaske med en kontinuerlig strøm på 1,5% isofluran.
- For at fremme vasodilatation og give mulighed for en lettere injektion, sug muse halen i varmt vand i 2 min.
- Bland cellesuspensionen ved forsigtigt at pipettere for at sikre, at cellerne ikke danner klumper. Aspirer 200 μL til en 1 mL sprøjte med en 26 G nål, der undgår bobledannelse.
- Hold muse halen ved spidsen og forsigtigt rette den.
- Find den laterale vene af muse halen; forsigtigt skrabe det med en skalpel og tørre det med 70% ethanol.
Bemærk: forsigtigt skrabning af halen udføres for at fjerne hår, hvilket gør injektionsstedet jævnere og renere. - Startende fra den distale del af halen, Indsæt nålen i venen i en 15 ° vinkel og langsomt indgyde 200 μl HUC-MSC eller steril saltvand (køretøjets kontrol) (figur 1b).
- Overvåge den vellykkede intravenøse infusion ved at væsken kommer ind i venen uden modstand og ved manglende ekstravasation. Vent et par sekunder, indtil hele volumen bevæger sig ned nålen, og derefter fjerne det fra venen.
- For at undgå blødning, Tryk kortvarigt på indgangs såret med en steril gaze.
- Kassér sprøjten og nålen på sikker vis efter infusionen.
- Genvinding af dyr
- Placer den inbrugte mus på siden på en varmepude til nyttiggørelse.
- Overvåg musen vejrtrækning og observere musen, indtil den begynder at bevæge sig og genvinder brystbenet recumbency og fuld bevidsthed.
- Når det er bekræftet, at musen er i god stand, returnere den til den oprindelige bur. Må ikke returnere det til selskabet af andre dyr, indtil det er fuldt tilbagebetalt.
- Undersøg musene i 24 timer efter hale vene infusion og hver anden dag, at overvåge deres sundhedsstatus og opdage enhver lidelse eller patologisk tegn tidligt.
4. organ forklarende og vævs behandling
- Ofrer musene på dag 8, 14 eller 21 efter bleomycin administration (figur 1c) ved overdosering af injicerbar anæstesi.
- Punkt i luftrøret og lungerne og straks vaske dem i iskold PBS.
- Fastgør de højre lunger i flydende nitrogen og opbevar dem ved-80 °C for en efterfølgende Molekylær analyse10.
- Oppuere de venstre lunger med 4% PARAFORMALDEHYD og fastgør dem i 10% neutral-Buffered formalin opløsning til 24 h; derefter, dehydrat dem i graderet alkohol serie, rydde dem i xylen, og indlejre dem i paraffin10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungeskade blev induceret af en enkelt endotracheal tubus injektion af 1,5 e/kg legemsvægt af bleomycin sulfat i 100 μL steril saltvand. Kontroldyrene fik en endotracheal tubus injektion af en tilsvarende mængde saltvand. To billeder af hUC-MSC (2,5 x 105 i 200 μl steril saltvand) blev inbrugt i muse hale vene, 24 h og 7 dage efter bleomycin administration. Kontroldyrene fik en intravenøs infusion af et tilsvarende rumfang sterilt saltvand. Mus blev ofret for lunge explant og vævs behandling på dag 8, 14 og 21 efter administration af Bleomycin (figur 1).
Vi viste, at en direkte instillation af bleomycin i muse luftrør tillod en hurtig diffusion ned til lungerne, hvilket resulterede i omfattende inflammation, progressiv fibrose og en forvrængning af deres normale arkitektur, konsekvent med tidligere undersøgelser 11. lunge histopatologiske ændringer blev vurderet af hematoxylin-eosin (H & E) og picrosirius Red farvning10, og fibrose blev bekræftet af et øget indhold af hydroxyprolin og kollagen deposition (figur 2). Inflammatoriske ændringer i væv blev vurderet af en histologisk scoring system baseret på den inflammatoriske infiltration omkring bronkioler, bronkier, og blodkar, og interstitiel lungebetændelse observeret i hematoxylin-eosin farvede lunge sektioner10. Efter bleomycin-injektionen steg Ashcroft-score på lunge sektioner progressivt fra en gennemsnitsværdi på 1,5 på dag 8 til en gennemsnitsværdi på 4,5 på dag 14 og 6,5 på dag 2110. Den dobbelte infusion af hUC-MSC i muse hale vene i vid udstrækning svækket bleomycin-induceret lungeskade, med signifikant reduktion, selv om ikke fuldstændig ophævelse, af både den inflammatoriske infiltration og omfanget af fibrose på hvert tidspunkt ( Figur 2). Immun farvning med specifikke antistoffer10 viste, at Inbrugt HUC-MSC hurtigt og effektivt nåede mus lunger, selv om kun få celler blev detekteret, med et faldende antal fra dag 8 til dag 21 (figur 3). Som tidligere rapporteret12, disse data tyder på en hurtig dislokation af cellerne fra stedet for skade, på trods af deres langvarige beskyttende virkning. Der blev udført immunohistokemisk (IHC) farvning af hUC-MSC, også i de salt behandlede prøver, men ingen celle kunne påvises, da der ikke fandtes inflammatoriske Foci, som tiltrækker hUC-MSC.
Figur 1: skematisk af forsøgsprotokollen. A) mus fik en enkelt endotracheal tubus (e.t.) injektion på 1,5 e/kg legemsvægt af bleomycin for at inducere lungeskade (dag 0). B) en dobbelt intravenøs (i.v.) infusion af 2,5 x 105 humane mesenchymale stromale celler opnået fra hele navlestrengen (HUC-msc) blev udført 24 timer (dag 1) og 7 dage (dag 7) efter administration af bleomycin. (C) en tidslinje for injektioner og øjeblikke af offer er vist her. Mus grupper blev ofret på dag 8, 14, og 21 efter bleomycin administration (dvs., 24 h, 7 dage, og 14 dage efter den anden hUC-MSC infusion, hhv.). Dette tal er blevet modificeret fra Moroncini et al. 10. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hUC-MSC downregulere bleomycin-induceret lungebetændelse og fibrose. (A og B) Repræsentative mikroskopiske billeder (10x forstørrelse) af hematoxylin-eosin (H & E) og picrosirius rød farvning af lunge sektioner opnået fra C57BL/6 mus, 21 dage efter endotracheal tubus injektion af sterilt saltvand (saltvand) eller Bleomycin (bleomycin), sidstnævnte efterfulgt af en intravenøs infusion af hUC-MSC (bleomycin + hUC-MSC) eller sterilt saltvand (bleomycin + saltvand). Saltvands kontrollerne viste normal lunge arkitektur. Udbredte inflammatoriske infiltrater blev observeret 21 dage efter bleomycin skaden, med en alvorlig forvrængning af lunge arkitekturen og dannelsen af fibrotisk Foci. Bleomycin-inducerede ændringer blev signifikant svækket af hUC-MSC-behandlingen, men ikke af saltvand. (C) hydroxyprolin-indhold på dag 8, 14 og 21 i LUNGERNE af C57BL/6-mus, der modtog førnævnte behandlinger. Resultaterne er middelværdien ± SD (n = 8 pr. gruppe) udtrykt som en procentdel af den værdi, der er opnået fra endotracheal tubus salt behandlede mus, og er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05, * *p < 0,01, sammenlignet med bleomycin-behandlede mus. (D) mus Col1A1 ekspression niveauer i hele lunge mRNA opnået på dag 8, 14, og 21 fra C57BL/6 mus, der har modtaget de førnævnte behandlinger. Resultaterne er middelværdien ± SD (n = 5 pr. gruppe) og er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter, der udføres i triplicat. *P < 0,05, * *p < 0,01, sammenlignet med bleomycin-behandlede mus. Dette tal er blevet modificeret fra Moroncini et al. 10. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: påvisning af hUC-msc i lungevævet. (A og B) repræsentative mikroskopiske billeder (henholdsvis 200x og 400x forstørrelse) af immun farvning med anti-HLA-1-antistof af LUNGE sektioner opnået fra C57BL/6-mus, der fik endotracheal tubus bleomycin efterfulgt af intravenøs hUC-MSC. De røde pile indikerer positiv bejdset hUC-MSC. C) humant gapdh vurderet ved kvantitativ realtidsanalyse af polymerasekædereaktion (PCR) i hele mRNA ekstraheret fra den dyrkede HUC-MSC før infusion (Infusioneret HUC-msc) eller fra lungevævet på dag 8, 14 og 21 af C57BL/6-mus, der fik endotracheal tubus Bleomycin efterfulgt af intravenøs hUC-MSC (bleomycin + hUC-MSC). Resultaterne er middelværdien ± SD (n = 5 pr. gruppe) og er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter, der udføres i triplicat. Af note, kilden til menneskelige GAPDH afskrift i denne eksperimentelle protokol kan leveres udelukkende af den intravenøst inbrugte hUC-MSC. Dette tal er blevet modificeret fra Moroncini et al. 10. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotracheal administration er den præferentielle vej til at levere eksogene stoffer i lungerne. Siden flere år er den direkte injektion af bleomycin i luftrøret blevet udbredt til at inducere pulmonal fibrose13 , og for nylig er der udviklet mere avancerede, ikke-invasive teknikker til at opnå denne14,15 ,16.
Den beskrevne metode giver flere meningsfulde fordele i forhold til nogle potentielle begrænsninger. Injektion af luftrøret kræver en kirurgisk indgreb, der bærer med det potentiale for komplikationer forårsaget af selve proceduren, sammen med behovet for dyb animalsk sedation. Derfor er god forberedelse og praksis i at perfektionere proceduren er nødvendige. Udover, at minimere mus lidelse, er det bydende nødvendigt at fastsætte den passende dosis af bedøvelsesmiddel i henhold til musen stamme og til den enkelte respons og til at opretholde en streng observation af dyret sedation tilstand. Ikke desto mindre observerede vi en meget lav dødelighed og optimal dyre restitution fra anæstesi. Ketamin og xylazin kan anvendes til anæstesi, samt tribromoethanol. Men, i mus, den effektive dosis af ketamin og xylazin er tæt på den dødelige dosis; således kan de nemt fremkalde en respiratorisk anholdelse. Omvendt, tribromoethanol dosering kan let justeres og er således et foretrukket anæstesimiddel. Efter endotracheal tubus injektion af bleomycin i luftrøret, vi ikke observere nogen negative virkninger. Musene var fri for feber, og der blev ikke observeret tegn på betændelse eller infektion omkring luftrøret og sår i huden. Derfor var der ikke behov for profylakse mod antibiotika. Desuden sikrer brugen af et opererede mikroskop en høj tillid til succes ved at give operatøren mulighed for nøjagtigt at overvåge den korrekte placering af nålen i muse luftrør før inddrypningen, hvilket minimerer risikoen for at beskadige den.
Endotracheal tubus injektion af bleomycin resulterer i en potent inflammatorisk og fibrotisk respons i begge lunger og kan ses som en robust metode til at generere eksperimentelle musemodeller af humane interstitiel lungesygdomme (ILD). Men som tidligere dokumenteret7, den fibrotiske respons på bleomycin i mus er stamme-afhængige og køn-og aldersrelaterede. Derfor er det afgørende for succesen af protokollen at finde den tolerabel dosis af bleomycin i alle eksperimentelle omgivelser. Hunmus blev brugt i denne undersøgelse, fordi den vigtigste interesse i denne forskning var interstitiel lungesygdom forbundet med systemisk sklerose, som er en sygdom, der i vid udstrækning er udbredt hos unge voksne hunner. Tre til fire måneder gamle mus blev valgt, fordi dette er den alder, hvor de bare indtaste voksen fase (mus opnå seksuel modenhed ved 8-12 uger af alder)17. Således anses de for at være unge voksne mus og er at foretrække frem for yngre dyr, da lungefibrose ikke er almindelig i meget unge individer. De er også at foretrække frem for ældre dyr, da tidligere undersøgelser18 har vist, at i alderen mus udstillet ændringer i lunge fibroblast fænotype, hvilket fører til en øget modtagelighed for afreparation og fibrose efter lungeskade, som kunne repræsentere en mulig skævhed i den eksperimentelle model, der præsenteres her.
Hale vene infusion er en enkel, pålidelig, og noninvasiv måde at sikre en hurtig og effektiv levering af lægemidler til blodbanen. Det kan nemt udføres med simpelt medicinsk udstyr, kort manuel træning og reducerede omkostninger.
Den forsøgsprotokol, der er beskrevet her, modificeret fra tidligere offentliggjorte undersøgelser19,20,21, findes i en dobbelt intravenøs infusion af 2,5 x 105 HUC-MSC for at forbedre celle engraftment i musen lungerne og deres terapeutiske virkning. Faktisk, da proceduren er ikke-traumatisk, det kan gentages i det samme dyr, men en periode på 7 dage mellem to på hinanden følgende injektioner anbefales, at tillade erstatning af eventuelle vasal sår. Desuden brugte vi isofluran indånding til at bedøve C57BL/6 mus under proceduren, for at undgå hale vene skade i tilfælde af pludselige flytninger af dyr.
Afslutningsvis, denne protokol er blevet anvendt med succes til effektivt at inducere pulmonal fibrose i C57BL/6 mus og til at validere in vivo anti fibrotisk virkning af HUC-msc. Denne metode kan også anvendes til administration af lægemidler eller andre stoffer end bleomycin i luftvejene, for at generere forskellige eksperimentelle lungesygdom modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud RF-2011-02352331 fra Ministero Italiano della Salute (til Armando Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
